人HSPC011蛋白表达纯化和单克隆抗体制备

目的表达纯化人造血干细胞(hematopoietic stem/progenitor cell,HSPC)相关基因HSPC011,并制备其单克隆抗体.方法构建HSPC011原核表达载体,转化至E. coli诱导表达;Ni2+-NTA离子交换树脂层析纯化;纯化HSPC011蛋白免疫BALB/c小鼠,常规杂交瘤技术制备单克隆抗体;Western blot法鉴定其特异性;以所得特异性抗体为一抗,使用免疫组化法检测人毛囊毛乳头细胞中HSPC011的表达.结果成功构建了高效原核表达载体pET28a/HSPC011;经IPTG诱导在E.coli中表达了相对分子量约为13 000的目的蛋白;表达产物经纯化后纯度大于90%;获得1株抗HSPC011杂交瘤细胞;Western blot检测多种人体组织样本均在相对分子量约13 000处有一特异性条带;免疫组化检测在毛乳头细胞胞浆中可见阳性着色.结论成功表达纯化了人HSPC011蛋白并制备了其单克隆抗体,为进一步研究HSPC011基因在毛囊周期性生长调控中的具体作用,寻找有临床应用价值的毛囊活性蛋白奠定了基础.     

人乳头瘤病毒16例E5转化基因的克隆及原核表达

目的 建立人乳头瘤病毒16型E5基因的无性繁殖系,为进一步研究其致癌机理作准备。方法 用PCR人HPV16质粒DNA中扩增出E5基因序列,连接到pGEM－T载体。将阳性的重组pGEM－T用BamHI/EcoR双酶切并回收目的片段连接到原核表达载体pGEX－2T,转化DH5α菌株。取工程菌,TPTG诱导表达,SDS－PAGE电泳鉴定。结果 ①经PCR、测序和双酶切鉴定,认为HPV16E5正确插入上述表达载体,建立了该转化基因的无性繁系。②经IPTG诱导的pGEX－2T－E5质粒表达出约42KD的融合蛋白,分析含有约16KDHPV16E5蛋白,与预期含HPV16E5的融合蛋白分子量相符。结论 ①采用PCR克隆技术,扩增HPV16E5转化基因目的片段,将其克隆到pGEM－T载体在国内首次建立了HPV16E5转化基因的无性繁殖子。②成功构建HPV16E5基因的原核表达质粒,并表达出GST－35融合表达蛋白。     

人细胞角蛋白8(CK8)基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:克隆人细胞角蛋白8(CK8)基因cDNA并在大肠杆菌中表达CK8蛋白产物。方法:运用DNA重组技术,设计CK8基因特异引物,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从人肝细胞癌7721细胞中扩增CK8编码区cDNA,将其插入克隆载体pMD18-T simple vector中,获得重组质粒pMD18-CK8,转化感受态大肠杆菌DH5α。继而采用PCR技术从重组质粒pMD18-CK8中扩增出约1500bp目的片段,再次级克隆到原核表达质粒pET-28a(+)载体中,获得pET-28a-CK8重组原核表达质粒;经酶切、PCR及测序鉴定后转化入BL21(DE3)菌株,在IPTG诱导下进行融合蛋白的表达。采用SDS-PAGE电泳及Western blot检测CK8蛋白表达水平。结果:成功建立了人CK8基因cDNA重组体的无性繁殖系。②在原核细胞中成功地表达出人CK8蛋白,该蛋白具有很好的免疫原性。结论:运用原核细胞基因工程技术成功构建和表达了人细胞角蛋白8(CK8)基因,为进一步研究CK8的基因型及探讨该基因编码的CK8蛋白的性质和生物学活性创造条件。     

重组人CD40胞外结构域在大肠杆菌中的表达和纯化鉴定

目的构建人CD40胞外结构域（exCD40）的原核表达载体，获得可溶性产物。方法以RT-PCR方法从人白细胞总RNA中扩增编码CD40胞外区的cDNA，构建羧基端融合His6标签的exCD40的原核表达载体，在大肠杆菌中表达，并对表达产物进行复性、纯化和鉴定。结果构建了exCD40的原核表达载体，并在大肠杆菌中获得高表达，Mr为23000，与理论大小相符，表达产物主要存在于包涵体中，经Ni^2＋-NTA柱上复性和纯化获得纯度达95％的可溶性exCD40蛋白，该蛋白能与细胞上的CD40L结合。结论从大肠杆菌中成功获得具有配基结合活性的可溶性exCD40蛋白。     

人CD80胞外区在大肠杆菌中的表达和鉴定

目的在人大肠杆菌中表达人ＣＤ８０胞外区蛋白质。方法采用ＰＣＲ扩增人ＣＤ８０胞外区基因ｃＤＮＡ，先后经Ｋｌｅｎｏｗ和ＨｉｎｄⅢ酶切并纯化，再定向克隆至高效表达载体ｐＫｐＬ－３ａ中，构建成ｐＫｐＬ－ＣＤ８０。转化大肠杆菌ｐｏｐ２１３６后，温度诱导表达，再用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定之并检测其活性。结果转化菌表达出分子量为２４０００的蛋白质，免疫学鉴定为ＣＤ８０，并证实有一定生物学活性。结论大肠杆菌中可以成功表达出具有生物学活性的ＣＤ８０，为进一步研究和开发ＣＤ８０打下了基础。     

人CD4基因在大肠杆菌中的表达

本文设计并化学合成了一对ＰＣＲ引物，以人ＣＤ４ｃＤＮＡ为模板，成功地扩增出人ＣＤ４Ｎ端两个结构域的编码基因（６００ｂｐ），并在此基因两端分别插入了ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切位点及起始和终止码。通过ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切位点将ＣＤ４基因克隆入ｐＵＣ１９质粒，经过ＰＣＲ和酶切鉴定得到ＣＤ４重组克隆ｐＴ４０３。ＤＮＡ序列分析结果表明，所克隆ＣＤ４基因与已发表的人ＣＤ４基因序列完全一致。将ＣＤ４基因     

人LIGHT胞外段基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的:构建人LIGHT胞外段基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达.方法:从人外周血单核细胞来源的未成熟树突状细胞中提取总RNA,通过RT-PCR得到LIGHT胞外段基因,并将其克隆至pET32a(+)原核表达载体中,经双酶切鉴定及序列测定后的重组质粒转化入E.coli BL21,IPTG诱导表达目的蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot进行检测.结果:RT-PCR扩增出了大小为543 bp 的LIGHT胞外段基因,经测序证明序列正确.SDS-PAGE和Western blot分析证实重组质粒可表达出Mr约为41 000的蛋白.结论:成功地克隆了人LIGHT胞外段基因并在大肠杆菌中进行了表达为进一步研究LIGHT的功能打下了基础.     

人LC3蛋白在大肠杆菌中的表达纯化及其抗体的制备与鉴定

目的:制备兔抗人LC3的多克隆抗体,为细胞自噬的研究提供有用的检测工具。方法:构建pET32a(+)LC3的原核细胞表达载体并进行序列鉴定,大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达LC3蛋白,SP-Sepharose XL柱纯化;纯化的人LC3蛋白免疫兔制备抗血清,通过LC3蛋白偶联的Sepharose 4B(LC3-Sepharose 4B)亲和层析纯化兔抗人LC3的多克隆抗体,以间接ELISA和Western blot鉴定其特异性。结果:成功实现了LC3蛋白在大肠杆菌中的高效表达和纯化,并用质谱分析证明表达蛋白相对分子质量(Mr)为15 500。制备的兔抗人LC3多克隆抗体具有很高的特异性,与大肠杆菌成分无交叉反应。Western blot能够特异检测自噬过程中LC3Ⅰ型和Ⅱ型蛋白,观察到自噬发生时LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的转化。结论:获得了重组人LC3蛋白,成功地制备了该分子的特异性多克隆抗体,为细胞自噬的检测提供了有用的探针。     

人工毛乳头与毛乳头的形态学和活性比较

目的：通过对人工毛乳头与毛乳头的对比观察,从形态学、细胞活性、膜通透性等方面对人工毛乳头进行评价。方法：利用高压电场微囊发生器,以APA微囊包裹分离毛乳头细胞;在普通光学显微镜、倒置相差显微镜、透射电镜下观察对比新鲜分离的毛乳头与毛乳头细胞微囊（人工毛乳头）的大体形态和超微结构;MTT法比较微囊化和培养的毛乳头细胞的活性;激光共聚焦显微镜比较人工膜和生物膜的通透性。结果：毛乳头细胞微囊与新鲜分离的人头皮毛乳头在大体形态及超微结构方面非常相似,培养14天后两种细胞的活性趋于一致;直径400μm的微囊中的荧光强度高于新鲜分离的毛乳头中的荧光强度（P〈0.05）。结论：人工毛乳头与毛乳头的形态和活性相似,APA膜的通透性优于毛乳头的基膜。     

人脂联素基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

目的利用杆状病毒表达系统探讨人脂联素(ADPN)基因在Sf9昆虫细胞中的高效表达。方法利用PCR方法扩增人脂联素基因,与pFastBac1质粒连接,转化入含有穿梭载体bacmid的大肠杆菌DH10Bac中,筛选发生转座作用的重组穿梭载体Bacmid-ADPN并转染Sf 9昆虫细胞,使其表达重组杆状病毒,经SDS-PAGE、Western blot检测表达产物。结果重组杆状病毒感染的Sf 9细胞形态变化明显,能够表达出与脂联素多克隆抗体相结合的蛋白,蛋白分子质量约为30 ku。结论人脂联素基因在真核细胞中成功得到表达,为进一步研究其生物学活性和作用机制奠定基础。     

人CD19分子胞外区在大肠杆菌中的表达研究

本实验应用计算机优化设计，利用ＰＣＲ 和分子克隆技术，以ｐＵＣ１９／ＣＤ１９ 重组质粒为模板，扩增出人ＣＤ１９ 分子的胞外区基因，并与表达载体相连，经３０ ℃扩增菌体，４２ ℃诱导，实现了在Ｅ－ｃｏｌｉ 中融合表达相对分子质量（ Ｍｒ） 为４１ ０００ 的蛋白谱带。初步纯化的包涵体可溶于２ ％ ＳＤＳ，为对其单克隆抗体（ｍＡｂ） 的制备奠定了基础。     

人细胞骨架调节蛋白基因Nelin的原核表达与分离纯化

目的：原核表达并分离纯化人细胞骨架调节蛋白基因Nelin。方法：利用DNAstar软件预测Nelin的B细胞表位，选择Nelin基因B细胞表位较多、特异性最强的片段。用DNA重组技术，将此片段插入原核表达载体pE128a（＋），构建C末端带有His6标签的原核表达载体pE128a-Nelin，转化大肠杆菌B121（DE3），IPTG诱导，产物用Ni^2＋金属螯合吸附层析柱纯化。结果：成功构建了pE128a-Nelin表达载体，IFTG诱导后表达分子量约为17000的可溶性蛋白，Nelin-His6蛋白的表达量占菌体总蛋白的18％，经Ni^2＋金属螫合层析柱纯化，得到了电泳纯的Nelin—His6蛋白。结论：建立了稳定的Nelin基因的表达体系，为其功能研究奠定了基础。     

人THANK cDNA的克隆及其在大肠杆菌中表达

目的克隆THANKcDNA,并在大肠杆菌中进行表达。方法采用RT-PCR技术,从人外周血单个核细胞的总RNA中扩增人THANK全长编码区基因及THANK胞外区编码基因,PCR产物直接克隆于pMD-18T载体中,重组克隆进行DNA测序。将测序证实的THANK胞外区基因亚克隆到原核表达载体pET-11a中。阳性重组子,以1mmol/LIPTG进行诱导表达,以SDS-PAGE分析THANK胞外区的表达。对表达的蛋白作初步纯化处理后,进行生物学活性检测。结果RT-PCR扩增出一个858bp的DNA片段,限制性内切酶图谱分析和测序结果显示,该片段为编码人THANK的cDNA,与公布的人THANK基因序列一致。将胞外区片段克隆入表达载体,转化大肠杆菌表达后发现,与阴性对照相比,在相对分子质量（Mr）26×104处多显示出一条条带。对该蛋白进行初步活性测定显示其可显著地抑制U937细胞的生长。结论本实验成功地克隆了人THANK基因,并将其可溶性胞外区片段在大肠杆菌中进行了表达,表达的重组蛋白可抑制U937细胞的生长。这为进一步进行THANK基因的功能研究及其开发和临床应用奠定了基础。     

人LIGHT胞外区基因的克隆及融合蛋白的表达

目的：克隆人LIGHT胞外区基因（hsLIGHT），构建其原核表达质粒，并诱导其在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法：采用RT-PCR方法从HL60细胞中扩增hsLIGHT，将其克隆人原核表达质粒pGEX-4T-2，构建其重组表达质粒pGEX-4T-2／hsLIGHT，以不同浓度IPTG诱导表达，于不同时间经SDS-PAGE和Western blot分析、鉴定。结果：经RT-PCR扩增获得的hsLIGHT序列与Genebank报道的LIGHT基因胞外区序列完全一致；SDS-PAGE和Westernblot分析证实重组质粒可表达出相对分子量为47000的蛋白，与GST-hsLIGHT融合蛋白分子量一致。结论：成功完成了人LIGHT胞外区基因的克隆及其原核表达质粒的构建，在大肠杆菌E-coli BL21中经IPTG诱导表达了融合蛋白GST-hsLIGHT，为进一步探讨LIGHT的抗肿瘤生物学活性、探索肿瘤免疫治疗新方法奠定了基础。     

葡萄球菌肠毒素A基因原核表达系统的构建及其表达产物的鉴定

 目的：构建葡萄球菌肠毒素A（SEA）基因原核表达系统，了解重组表达产物rSEA促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤生长的作用。方法：采用高保真PCR从金黄色葡萄球菌ATCC13565株DNA中扩增全长SEA基因片段，T-A克隆后测序，构建SEA基因原核表达系统pET32a-SEA-E.coliBL21DE3。采用SDS-PAGE检测rSEA表达量，Ni-NTA亲和层析法提纯rSEA。采用TCID₅₀法测定rSEA对Vero细胞的细胞毒性并计算TCIC₅₀值。采用MTT比色法分别检测不同浓度rSEA体外对小鼠脾细胞、人外周血单个核细胞（PBMC）的促增殖作用以及对HepG2细胞（人肝癌细胞）、HeLa细胞（人宫颈癌上皮细胞）的生长抑制作用。结果: 与公布的相关序列比较，所克隆的SEA基因核苷酸序列相似性为100%。rSEA表达量约为细菌总蛋白的25%。rSEA对Vero细胞的TCIC₅₀为3.14 μg。1.0-20.0 mg/L的rSEA对小鼠脾细胞和人PBMC均有明显的促增殖作用（P<0.05）。5.0-20.0 mg/L rSEA作用的人PBMC上清均能有效地抑制HepG2细胞和HeLa细胞生长（P<0.05）。结论:成功地构建了rSEA原核表达系统。rSEA仍然具有生物学活性。所建立的细胞毒性、促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤细胞生长作用的检测方法，为以后减毒rSEA突变体的筛选奠定了基础。     

菌体内可溶性表达重组THANK蛋白的免疫调节活性分析

目的：构建含有人THANK基因的表达载体，诱导其在大肠杆菌中可溶性表达，并对表达的THANK蛋白的免疫调节性进行检测。方法：从含有全长，THANKcDNA的pMD18-THANK质粒中克隆THANK的胞外区片段，并将其亚克隆至原核表达载体pET-11a中，筛选阳性重组质粒pET-THANK,以IPTG诱导其可溶性表达，并以SDS－PAGE和Westen blot检测进行分析。表达的蛋白初步纯后，分析其对B、T细胞的免疫调节活性。结果：PCR扩增出了THANK胸包区cDNA片段，SDSPAGE和Western分析产重组的pET-THANK质粒可表达出THANK蛋白。可溶性THANK重组蛋白可共刺激B、T细胞的增生，并可诱导活化T细胞的凋亡。结论：本实验成功地将THANK胞外区片段在大肠杆菌中进行表达，表达的蛋白具有免疫调节活性。     

输血传播病毒部分基因的克隆表达及表达产物活性的初步鉴定

目的　构建含输血传播病毒(TTV)部分基因序列的原核表达载体并进行表达及产物活性的鉴定。方法　在计算机模拟基础上,采用PCR的方法　,从一名非甲～庚肝炎患者血清中,扩增编码蛋白具有抗原活性的TTVORF2部分基因片段。将该片段插入表达载体pQE-30,在大肠埃希菌中进行表达并利用酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴定表达产物活性。结果　SDS-PAGE电泳后经电脑分析显示,表达产物相对分子质量与预计相同,表达量占菌体总蛋白量的22.33％。经ELISA检测表明表达产物有结合抗体活性。结论　成功构建了含TTV部分基因的原核表达载体,表达产物具有抗原活性。     

甲型副伤寒杆菌鞭毛蛋白H1a基因原核表达系统构建及其表达产物的免疫原性和保护作用

目的 构建甲型副伤寒杆菌（Salmonella paratyphi A）H1a基因原核表达系统，确定表达产物rH1a免疫原性和保护作用，检测甲型副伤寒杆菌临床菌株H1a基因携带和表达情况。方法 采用高保真PCR从甲型副伤寒杆菌临床株JH01中扩增H1a基因，T-A克隆后测序，构建H1a基因原核表达系统pET32a-H1a-E．coli B121DE3。采用SDS-PAGE和BioRad凝胶图象分析系统检查rH1a表达情况，Ni-NTA亲和层析法收集rH1a。采用Western blot鉴定其免疫反应性和免疫原性。建立PCR和ELISA检测98株甲型副伤寒杆菌临床菌株H1a基因携带和表达频率。观察rH1a对甲型副伤寒杆菌50001株感染小鼠的免疫保护作用。结果 与报道的相关序列比较，所克隆的H1a基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为99．59％。rH1a表达量为细菌总蛋白的60％左右。甲型副伤寒杆菌全菌抗血清能识别rH1a并与之结合。rH1a免疫家兔可产生抗体。100％（98／98）甲型副伤寒杆菌临床菌株均含有H1a基因并表达H1a。500μg rH1a灌喂或皮下注射免疫小鼠受甲型副伤寒杆菌50001株攻击后的存活率均为50．0％，若加入5μg rLTB，存活率分别上升至75．0％和66．7％。结论 本研究成功地从甲型副伤寒杆菌临床菌株中构建了H1a基因高效原核表达系统。rH1a有良好的免疫原性和一定的免疫保护作用。甲型副伤寒杆菌临床菌株广泛存在H1a基因并高频率表达。     

人GLIPR-2基因的克隆及在原核中可溶性表达

目的构建pQE80L-GLIPR-2载体,并检测融合蛋白RGS·His-GLIPR-2在原核中的表达水平。方法采用RTPCR方法,将克隆人GLIPR-2(glioma pathogenesis related-2,GLIPR-2)基因全长编码区的cDNA连接到原核表达载体pQE80L中,经IPTG诱导原核表达,通过Western blot检测融合蛋白RGS·His-GLIPR-2的表达水平。超声破壁后,通过SDS-PAGE电泳分析表达产物的表达形式。结果成功构建pQE80L-GLIPR-2载体;经IPTG的诱导,GLIPR-2可与RGS·His以融合蛋白的形式高效表达。经Western blot鉴定,pQE80L-GLIPR-2在原核内表达产物相对分子质量为18000,与预期融合蛋白大小一致。对表达产物可溶性分析表明,表达蛋白在上清液中和包涵体中均有表达。结论成功构建的重组质粒能够在大肠杆菌中高效表达可溶性目的蛋白,为进一步研究GLIPR-2基因的功能和意义奠定了基础。