小鼠骨髓未成熟树突状细胞体外扩增及鉴定

目的建立体外大量扩增小鼠未成熟树突状细胞(DC)的方法，从形态学、免疫表型和细胞功能试验等方面予以鉴定。方法制备小鼠骨髓细胞，分别用不同剂量重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rmGM—CSF)培养，7d后收集悬浮细胞进行扫描电镜观察和免疫表型鉴定，并行混合淋巴细胞反应，观察其诱导未致敏T淋巴细胞增殖的情况。结果小剂量rmGM—CSF培养获得的DC(GM^low DC)具有DC的典型特征，细胞表面高表达CD11c，低表达CD40、I—A／1-E，不表达B7—1，与大剂量rmGM—CSF培养获得的DC(GM^high DC)相比，其体外刺激未致敏T淋巴细胞增殖的能力较弱。结论本实验中获得的GM^low DC形态上具有DC的典型特征，在细胞表型、细胞功能试验上具有未成熟的特性，说明所建立的培养未成熟DC的方法是可行的；rmGM—CSF的剂量与细胞的成熟程度相关，一般说来，较大剂量的rmGM—CSF诱导生成的细胞以成熟。DC为主，小剂量rmGM—CSF诱导生成的细胞以未成熟DC为主。     

大鼠骨髓来源树突状细胞体外培养体系的优化

目的 探讨优化大鼠骨髓来源树突状细胞(DC)体外培养体系的方法.方法 应用重组大鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(recombinant rat GM-CSF,rrGM-CSF) 20 μg/L和重组大鼠白介素(recombinant rat interleukin,rrIL)- 4 10 μg/L诱导分化Lewis大鼠...     

小鼠骨髓源性树突状细胞的体外诱导培养及功能分析

目的:建立小鼠骨髓源性树突状细胞(DCs)体外培养和扩增方法,为以DCs为靶点的免疫治疗研究提供基础。方法:从C57BL/6小鼠股骨和胫骨中提取骨髓细胞,以含重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF,400U/ml)和IL-4(200U/ml)的RPMI 1640(含10%FBS)进行诱导培养,于培养第4天加入脂多糖(LPS)继续培养2d。利用倒置相差显微镜和透射电子显微镜观察细胞生长状态和超微结构,流式细胞术鉴定培养第6天时DCs纯度及免疫表型,流式细胞微球捕获芯片技术检测第2、4、6天培养上清中细胞因子IL-6、IL-10、巨噬细胞趋化因子-1(MCP-1)、干扰素-1(IFN-1)、TNF-α、IL-12p70含量。结果:重组小鼠GM-CSF和IL-4诱导培养小鼠骨髓细胞4d,加入脂多糖(LPS)继续培养2d,近90%细胞高表达DCs特征性标志物CD11c,高表达抗原提呈分子MHC-Ⅱ和共刺激分子CD86、CD80,具有典型的树突状形态学特征和分泌炎症性细胞因子IL-6、IL-10、MCP-1、TNF-α和IL-12p70的功能。结论:小鼠骨髓细胞以重组小鼠GM-CSF和IL-4体外诱导培养的DCs具有较高的纯度,保持了体内的形态学、免疫表型及功能特征。     

白三烯C4增强小鼠骨髓来源树突状细胞迁移及肿瘤免疫治疗作用

目的应用白三烯C4（LTC4）调节体外培养DC表面CCR7表达，观察对其迁移能力和抗肿瘤免疫作用的影响。方法体外培养小鼠骨髓细胞来源DC，负载乳腺癌抗原后，加入LTC4培养。检测其表型、CCR7表达及其功能的变化。结果与对照组相比，LTC4组DC表达CD80、CD86增高，CCR7mRNA和蛋白表达上调（P〈0．05），但MLR和CTL活性不受影响。LTC4使DC对其配体CCL19反应性增强（P〈0．05）。在乳腺癌动物模型中，LTC4培养DC抑制肿瘤生长作用比对照组好。结论以LT巳培养可以通过增强DC表面CCR7表达，促进其在体内迁移能力，提高抗乳腺癌DC疫苗的功效。     

大鼠骨髓基质细胞的体外培养和鉴定

目的探讨SD大鼠骨髓基质细胞（MSCs）的体外培养方法,为细胞治疗研究提供大量MSCs。方法取幼年SD大鼠股骨及胫骨骨髓,全骨髓法培养至第4代,观察各代生长情况;同时制备第3代细胞爬片行细胞鉴定。结果第1～3代细胞接种后4h即有细胞贴壁,部分细胞呈梭形改变,24h时可见细胞呈长梭形或多边形;成群生长的细胞呈漩涡状或平行排列,3～4d时即可达85%～90%融合;收获细胞平均密度为（3.4～3.6）×10^4个/cm^2,台盼蓝染色拒染率为95%～97%,1～3代细胞总产量分别为4.08×10^6个、2.44×10^7个及2.85×10^8个。第4代细胞生长较前减慢,需5～6d达85%～90%融合;收获细胞平均密度3.0×10^4个/cm^2,拒染率为95%,细胞总产量为1.42×10^9个,较原代细胞扩增近2000倍。第3代细胞免疫组化鉴定结果：CD105^＋细胞占61.9%,CD44^＋占45.4%,CD29^＋占16.8%,CD45^＋占8.2%,CD31^＋占13.7%,CD34^＋占8.3%,CD11b^＋占1.5%。结论全骨髓培养适合于MSCs体外的大量扩增,可满足细胞治疗研究的需要。     

骨髓来源血管内皮祖细胞的体外分离培养和鉴定

目的:探索体外分离培养骨髓来源血管内皮祖细胞的方法。方法:将骨髓细胞接种至明胶涂层的培养皿内,用含10%胎牛血清、添加50μg/ml ECGS的M199培养液,置37℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度恒温培养箱培养,0.05%胰酶-EDTA消化传代。通过CD31免疫荧光染色、荆豆凝集素免疫细胞化学染色及毛细血管腔形成能力检测进行鉴定。结果:培养5～7天,内皮祖细胞的早期克隆形成,2周后细胞表现出典型的鹅卵石状。可与荆豆凝集素特异性相结合;内皮细胞特异性表面标志CD31荧光染色呈阳性表达;培养过程中可形成管腔状结构。结论:自骨髓可以获取足量的EPCs。     

骨髓来源血管内皮祖细胞的体外分离培养和鉴定

目的:探索体外分离培养骨髓来源血管内皮祖细胞的方法。方法:将骨髓细胞接种至明胶涂层的培养皿内,用含10%胎牛血清、添加50μg/ml ECGS的M199培养液,置37℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度恒温培养箱培养,0.05%胰酶-EDTA消化传代。通过CD31免疫荧光染色、荆豆凝集素免疫细胞化学染色及毛细血管腔形成能力检测进行鉴定。结果:培养5～7天,内皮祖细胞的早期克隆形成,2周后细胞表现出典型的"鹅卵石"状。可与荆豆凝集素特异性相结合;内皮细胞特异性表面标志CD31荧光染色呈阳性表达;培养过程中可形成管腔状结构。结论:自骨髓可以获取足量的EPCs。     

膀胱癌患者外周血树突状细胞的体外培养扩增和鉴定

目的研究膀胱癌患者外周血树突状细胞(DC)的体外培养扩增和鉴定。方法应用Ficoll-Hypaque离心获得界面细胞,贴壁培养2h,获得单个核细胞,体外以重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF,50ng/ml)+重组人白细胞介素4(rhlL-4,10ng/ml)+人肿瘤坏死因子-α(hTNF-α,50ng/ml)诱导培养。倒置相差显微镜及扫描电镜下观察DC生长情况；流式细胞仪检测DC表型；MTT法检测DC活化的T细胞对肿瘤细胞BIU87的杀伤率。结果第6天体外培养的DC由贴壁状态变为悬浮毛刺状细胞,第8天为形态不规则的毛刺状,为典型DC形态。流式细胞仪检测表明,成熟DC高水平表达CD_(1a)、CD_(83)、CD_(86)及HLA-DR等。被DC激活的T细胞对膀胱癌细胞株BIU87的杀伤率为(48.8±3.7)%,未经DC激活的T细胞的杀伤率为(25.7±1.5)%,2组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。结论膀胱癌患者外周血经rhGM-CSF+rhIL-4+hTNF-α体外诱导培养能诱导出DC。     

大鼠未成熟树突状细胞体外扩增及功能鉴定

摘要：目的 探讨建立大鼠体外大量扩增未成熟树突状细胞(DC) 的方法, 以及不同剂量粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM CSF)对大鼠DC分化成熟的影响。方法 分离纯化并扩增大鼠骨髓细胞，用不同剂量GM CSF培养,6 d 和10 d后收集悬浮细胞进行扫描电镜观察和免疫表型鉴定,并行混合淋巴细胞反应,观察其诱导未致敏T 淋巴细胞增殖的情况。结果 小剂量GM CSF 培养获得的DC(GMlowDC) 形态上具有DC 的典型特征,在细胞表型、细胞功能试验上具有未成熟的特性,具有DC 的典型特征,细胞表面高表达CD11c,低表达CD80，CD86及MHC II类分子,与大剂量GM CSF加IL 4的联合组培养获得的DC( GMhighDC) 相比,其体外刺激未致敏T 淋巴细胞的增殖能力较弱.结论 笔者所建立的培养未成熟DC 的方法是可行的；GM CSF的剂量与细胞的成熟程度相关。     

红活麻乙酸乙酯有效部位对小鼠骨髓来源树突状细胞的影响

目的观察湖北民族药红活麻乙酸乙酯有效部位对体外培养树突状细胞（DC）功能及表达的影响。方法用rIL-4和rGM—CSF体外诱导骨髓前体细胞，培养第4天始加入红活麻乙酸乙酯有效部位20mg／L处理，观察DC生长分化情况。用流式细胞仪检测DC表面抗原和共刺激因子，噻唑蓝（MaT）法检测经药物处理的DC体外刺激同种T细胞增殖活性，酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞培养上清液中IL-12p70分泌水平。结果红活麻乙酸乙酯有效部位抑制骨髓来源DCMHCⅡ和共刺激分子CD86的表达以及上清液中IL-12p70的分泌，与未经任何处理的正常DC比较差异有统计学意义。药物处理的DC与同种T细胞以不同比例混合培养时，刺激同种T细胞增殖能力显著下降。结论红活麻乙酸乙酯有效部位使小鼠骨髓来源树突状细胞处于未成熟状态，对其免疫学功能起负性调节作用，其免疫抑制活性的确定也为抗移植排斥反应药物的研发提供了方向。     

大鼠骨髓来源的血管内皮祖细胞的体外培养和鉴定

目的探索大鼠骨髓来源的血管内皮祖细胞（EPCs）的体外培养、诱导分化及鉴定方法。方法采用密度梯度离心法从Wistar大鼠骨髓中分离出骨髓单个核细胞,并在诱导培养基（EGM-2MV）中培养,贴壁筛选法分离,诱导分化为EPCs;观察EPCs的生长分化过程,对其形态、表型、功能加以鉴定。结果培养3 d,细胞贴壁较为完全,第4天换液后,细胞呈现克隆样生长,第7～8天形成类似成熟血管内皮细胞形态,呈现典型的"铺路石"样外观;诱导培养第7、10天的贴壁细胞CD34、Flk-1及CDl33染色均呈阳性;荧光显微镜下观察,DIL-ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光染色的细胞数占贴壁细胞数的75%以上。结论采用密度梯度离心法获得骨髓单个核细胞,在培养液中贴壁培养,可以扩增出具有典型特征的EPCs。     

应用骨髓法培养树突状细胞的研究

目的探讨培养树突状细胞(DC)的最佳方法和合理的培养时间。方法取大鼠的骨髓细胞分别加入4种细胞因子重组大鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rrGMCSF)5μg/L,重组大鼠白细胞介素4(rrIL4)5μg/L,重组大鼠肿瘤坏死因子α(rrTNFα)10μg/L,重组大鼠γ干扰素(rrγIFN)20μg/L培养2周,并用PE标记的抗大鼠CD86单克隆抗体检测它的成熟度。结果从第7天开始细胞周围开始逐渐伸出突起,第13天以后突起5～6支左右,且长度逐渐缩短,成熟的树突状细胞伸出长短不等的突起,类似神经细胞的树突。60只大鼠培养所得的树突状细胞平均为(1.18±0.21)×107第7、11、13、15天的CD86单抗的阳性率分别为30%、80%、92%、94%,随着时间的延长,它的阳性率不断增加,尤以第1周到第2周之间增长的特别明显,但2周以后,树突状细胞的成熟度无明显提高。结论应用骨髓法来培养树突状细胞加入细胞因子rrGMCSF、rrIL-4、rrTNF-α、rr-γ-IFN培养2周,可得到成熟的树突状细胞。     

大鼠骨髓基质细胞的体外培养

目的：观察大鼠骨髓基质细胞在体外培养的条件,为骨组织工程学研究奠定一定实验基础。方法：取幼年SD大鼠,处死后分离骨髓,原代培养骨髓基质细胞,传代后分别观察其生长特性,绘制生长曲线,测定分裂指数和贴壁率。结果：大鼠骨髓基质细胞在第7代以前生长形状相对稳定,生长曲线相似;第4d分裂指数最高,为16％;传代后12h贴壁率最高,为90％。结论：本实验方法中,骨髓基质细胞在体外培养条件下,早期生长性状稳定,增殖速度快,适应性强,可作为骨组织工程学研究的种子细胞。     

胃癌患者外周血来源树突状细胞诱导培养及表型分析

目的分析胃癌患者外周血单个核细胞，经诱导培养获取树突状细胞(DC)的形态学特点及表面分子表达的特点，为基于DC的胃癌生物学治疗提供实验基础。方法胃癌患者外周血单个核细胞经GM-CSF，IL-4及TNF-α诱导培养，获取成熟DC。利用光镜、电镜观察其形态特点。利用流式细胞术检测其表面分子表达特点。结果诱导培养7d即可获取成熟DC，细胞表面出现大量典型树枝状突起；细胞表面分子表达随细胞的成熟而逐渐升高，至培养7d时逐渐趋于稳定。结论胃癌患者外周血单个核细胞经GM-CSF，IL-4及TNF-α诱导培养，可获得大量成熟DC。所获取DC具备典型形态学特点及表面分子表达特点。该研究结果可作为胃癌生物学治疗进一步研究的基础。     

骨髓来源半成熟树突状细胞诱导大鼠小肠移植免疫耐受

Objective To study MyD88 silent semi-mature DC (simDC) inducing immune tolerance in rat small bowel transplantation model. Methods All rats were randomly divided into three groups (n=6). Seven days before transplantation of intestine from F344 donors, Wistar recipient rats were injected with simDC (group A) , imDC (group B) and saline ( group C) through the penile dorsal vein respectively.Small bowel transplantation was performed and the survival time of recipients was observed. Serum IL-2 and IFN-γ levels were assayed. Results The survival time of recipients in group A was ( 13.7±1.2) days, which was significantly longer than that in groups B [(8.0±1.0) days,P<0. 05] and C [(6. 0±0. 8) days P<0. 05]. The serum levels of IL-2 and IFN-γ in group A were lower than in groups B and C (P<0. 05). Conclusion Depending on the unique phenotypic and functional features of sem-DC,they can induce the transplantation tolerance and prolong the survival of intestinal allografts after transplantatin.     

骨髓来源半成熟树突状细胞诱导大鼠小肠移植免疫耐受

Objective To study MyD88 silent semi-mature DC (simDC) inducing immune tolerance in rat small bowel transplantation model. Methods All rats were randomly divided into three groups (n=6). Seven days before transplantation of intestine from F344 donors, Wistar recipient rats were injected with simDC (group A) , imDC (group B) and saline ( group C) through the penile dorsal vein respectively.Small bowel transplantation was performed and the survival time of recipients was observed. Serum IL-2 and IFN-γ levels were assayed. Results The survival time of recipients in group A was ( 13.7±1.2) days, which was significantly longer than that in groups B [(8.0±1.0) days,P<0. 05] and C [(6. 0±0. 8) days P<0. 05]. The serum levels of IL-2 and IFN-γ in group A were lower than in groups B and C (P<0. 05). Conclusion Depending on the unique phenotypic and functional features of sem-DC,they can induce the transplantation tolerance and prolong the survival of intestinal allografts after transplantatin.     

骨髓来源半成熟树突状细胞诱导大鼠小肠移植免疫耐受

目的 观察髓样分化因子88(MyD88)沉默的半成熟树突状细胞(DC)诱导大鼠小肠移植模型免疫耐受.方法 供体乃44大鼠,受体Wistar大鼠.随机分为3组(n=6).A组(半成熟DC组)移植前7d经阴茎背静脉注射半成熟MyD88沉默DC(2×106细胞数),B组(未成熟DC组)移植前7 d经阴茎背静脉注射未成熟DC(2×106细胞数)和C组(阴性对照组)移植前7 d经阴茎背静脉注射1 ml生理盐水.3组均于注射7 d后行大鼠异位节段性小肠移植术,观察统计各组受体存活情况,检测受体血清中的促炎症因子白细胞介素(IL)-2、干扰素(IFN)-γ等的变化.结果 半成熟MyD88沉默DC组[(13.7±1.2)d,n=6]较未成熟DC组[(8.0±1.0)d,n=6,P<0.05]和阴性对照组[(6.0±0.8)d,n=6,P<0.05)存活时间显著延长,同时受体血清中IL-2和IFN-γ等促炎症因子的表达明显降低(P<0.05),病理改变亦较轻微.结论 MyD88沉默的半成熟DC具有独特的表形和功能,能够诱导受体产生特异性免疫耐受,显著延长受体术后的存活时间.     

SD大鼠骨髓细胞体外定向诱导、扩增树突状细胞及鉴定

树突状细胞(DC)是目前所知的机体内功能最强的抗原提呈细胞(APC),在调节免疫反应中起双重作用.DC在生物体内虽然分布广泛,但数量不多,用分离的方法直接获得的DC量更少,所以应用细胞因子体外诱导分离出的单核前体细胞进行分化增殖,可获得足够数量的未成熟DC或成熟DC,供科研用.体外诱导DC的方案很多,骨髓、脐血、外周血干细胞和外周血单核细胞都可作为前体来诱导分化DC.本实验旨在探讨体外利用大鼠骨髓细胞诱导、扩增DC的实用、简单、高效方法.     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养及初步鉴定

目的 探讨体外培养大鼠骨髓间充质干细胞的可行性,分析其部分表型特点,为细胞移植治疗中枢神经系统疾病奠定基础.方法 采用贴壁筛选法分离纯化大鼠MSCs,进行培养,传代扩增,免疫组化鉴定细胞是否表达具有干细胞特性的标记抗原-神经巢蛋白(nestin),并用流式细胞仪进行荧光检测初步鉴定.结果 分离后的MSCs出现增殖性生长,免疫组化显示巢蛋白(nestin)表达阳性,经流式细胞仪检测显示CD44,CD90阳性,CD45阴性.结论 在体外可培养出较大丰度大鼠骨髓间充质干细胞,而且此方法简单易行.