人白细胞介素-6基因的克隆表达和纯化的研究

目的：研究人ＩＬ ６基因在大肠杆菌中的高效表达及表达产物的纯化。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ方法克隆了人ＩＬ ６ｃＤＮＡ,用ｐＢＶ２２０载体对ＩＬ ６基因进行了表达调控研究,用阴离子交换柱和凝胶柱对表达产物进行纯化,用ＭＴＴ法测定ｒｈＩＬ ６的活性。结果：表达调控研究发现,当ＳＤ序列到ＡＴＧ之间的距离为６ｂｐ和１０ｂｐ时在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ胶上未见明显表达,而当距离为５ｂｐ、７ｂｐ、８ｂｐ、９ｂｐ时均可获高效表达,最高表达量占菌体总蛋白的２６％。表达产物经变性复性及纯化后产品纯度达９８％,比活性为１１×１０８Ｕ／ｍｇ。结论：本研究为ｒｈＩＬ ６的中试生产奠定了坚实的基础     

白细胞介素-6基因的克隆、表达及纯化的研究

目的 进行重组人白细胞介素－６的批量生产研究。方法 将克隆的人ＩＬ－６基因地ＰＥＴ３０ａ载体的Ｔ７启动子下游,在宿主大肠杆菌中进行表达。结果 工程菌表达量占菌体总蛋白的５０％以上,纯品纯度大于９５％,ｒｈＩＬ－６的分子量为２１０００,等电点为６．７。用依赖ＩＬ－６的小鼠杂交瘤细胞的７ＴＤＩ以ＭＴＴ比色法测定表达蛋白生物活性表明,ｒｈＩＬ－６的ＥＤ５０为０．３５ｎｇ／ｍｌ。结论 上述结果表明ｒｈＩＬ     

小鼠白细胞介素6的克隆表达纯化及鉴定

目的：构建小鼠白细胞介素6(mIL-6)工程菌,通过诱导表达和纯化,得到较高纯度的重组mIL-6融合蛋白。方法：提取小鼠脾脏淋巴细胞总RNA,RT-PCR扩增得到mIL-6基因片段,克隆入pReceiver-B56x表达载体,转化BL21,诱导表达重组蛋白,采用亲和层析纯化。结果：工程菌采用LB培养基,14℃、1mmol/L的IPTG诱导,表达量占菌体蛋白总量的33.3%,部分为可溶表达。超声破碎菌体,离心后取上清液,经过亲和层析一步纯化,目的蛋白纯度达84.4%。结论：构建了高效表达mIL-6的工程菌,目的蛋白部分为可溶表达,为进一步研究白细胞介素6在促进凝血、造血等方面的生物学功能以及其与疾病发生发展的相互关系,并基于此基础上的相关药物开发研究奠定了基础。     

人白细胞介素1受体拮抗基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

目的 获得一株重组人白细胞介素1受体拮抗蛋白的高效表达菌株,为研究各种急慢性炎症疾病的发病机制以及拮抗IL-1的生物学效应奠定基础。方法 分离人外周血淋巴细胞,提取mRNA,反转录PCR获得人白细胞介素1受体拮抗基因（hIL-1ra),克隆人大肠杆菌表达载体。从而构建高效表达人IL-1ra的重组菌株。结果 成功构建了IKL-1ra的高效表达菌株（pLDH-hIL1ra),序列测定与文献报道一致12%SDS-PAGE分析显示此菌株所表达的目的蛋白产物相对分子质量为23ku,与预期结果相符,光密度扫描重组hIL-1ra蛋白质占细菌总蛋白的30%。结论 大肠杆菌中成功地表达了hIL-1ra基因。     

人白细胞介素17cDNA的克隆及表达

目的 获取重组的人白细胞介素17以进行科学研究和应用。方法 应用RT－PCR的方法，从经PHA活化的人外周血单个核细胞中扩增hIL-17cDNA的编码序列，将其克隆至测序载体pBS SKⅡ（ ）中进行测序，再将其亚克隆至表达载体pBV220中，在大肠杆菌XL1－Blue中进行表达。结果 克隆获得了hIL-17cDNA，经热诱导后使hIL-17蛋白在大肠杆菌中的表达量达到了39．7％。结论 通过克隆hIL-17cDNA的编码序列及热诱导使hIL-17蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达。     

人白细胞介素21的原核表达及初步纯化

目的利用PCR技术从人扁桃体细胞cDNA中克隆出IL-21编码基因,并将其在原核细胞大肠杆菌中进行表达,并进行了初步纯化.方法以人扁桃体细胞经PHA刺激的cDNA文库为模板,经PCR获得IL-21全基因片段.测序确认后,分别设计含BamH Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位点的引物,经PCR获得IL-21成熟肽的编码基因.将此IL-21基因插入表达载体pGEX-4T-2,重组克隆经酶切与测序确认后转化大肠杆菌DH5α进行IPTG诱导表达.用琼脂糖珠结合的方法纯化.结果琼脂糖凝胶电泳显示重组质粒的PCR和双酶切产物与理论大小相等.SDS-PAGE显示经IPTG诱导后的大肠杆菌DH5α亦表达一与理论相符的条带.目的蛋白约占总菌体蛋白的10%.并获得了与理论值相符的纯化条带.结论成功地构建了IL-21编码基因克隆载体并获得在原核细胞大肠杆菌中的成功表达,同时建立了该蛋白的琼脂糖珠纯化的方法.     

人重组白细胞介素—8的快速纯化

报道一种快速人重组ＩＬ－８纯化方法，大肠杆菌表达的ＩＬ－８包涵体经尿素变性后，直接用ＤＥＡＥ柱和ＳｅｙｈａｄｅｘＧ５０柱纯化，纯化的ｈＩＬ－８经ＦＰＬＣ鉴定，纯度的９０％以上，该法为实验室快速，简便纯ｈＩＬ－８提供了新的技术路线。     

人白细胞介素—6受体cDNA的克隆

应用ＲＴ－ＰＣＲ技术座人的外周血单个核细胞中扩增出人ＩＬ－６受体的特异性ｃＤＮＡ片段，经琼脂糖电泳证实扩增片段大约为１４００碱基对。运用ＤＮＡ重组技术，将获得的片段连接到ｐＵＣ１８质粒中，经转化，筛选，酶切鉴定构建出重组质粒ｐＵＣＩＬ－６受体。     

从人末梢血T细胞cDNA文库中筛选表达人白细胞介素4基因的克隆

白细胞介素4具有多种生物功能,是调节免疫应答的重要淋巴因子之一。本文从以表达型质粒pcD为载体的人末梢血T细胞cDNA文库中,筛选出人IL-4cDNA克隆pcD-X-IL-4。经限制性内切酶酶切及Southern杂交鉴定,结果表明,pcD-X-IL-4包含有人IL-4基因的片段;转染真核COS7细胞后,在细胞培养上清测出T细胞生长因子样活性,说明所含IL-4基因可表达人IL-4完整分子。     

重组人白细胞介素—3在大肠杆菌中表达及纯化研究

将化学合成的人白细胞介素－３（ｈＩＬ－３）基因与表达质粒ＰＫＫ２２３－３重组并转化大肠杆菌ＪＭ１０５，重组菌在摇瓶中发酵并诱导表达，表达产量达菌体蛋白质总量的５３％么上。发酵菌经超声破碎后得到包本，经洗涤处理使包含体纯度达９０％以上。     

人可溶性白细胞介素—6受体基因在昆虫细胞内的克隆与表达

目的：在昆虫细胞中表达人可溶性白细胞介素－6受体（sIL-6R)基因。方法：将人sIL-6R cDNA克隆至杆状病毒转移载体pAcGP67B中,再将重 组转移载体质粒与野生病毒AcNPV DNA共转染昆虫细胞sf9;经同源重组后,以终点稀释和斑点杂交法筛选重组杆状病毒;采用空斑分析法纯化重组的病毒,然后以纯化的重组病毒感染昆虫细胞Sf9。结果：斑点杂交实验证实,纯化得到的重组病毒含有人sIL-6R基因,SDS－PAGE结果显示,表达产物sIL-6R相对分子质量为47000左右,Western blot和受体配基结合实验表明,表达产物具有与其配基特异性地结合的能力,结论,杆状病毒－昆虫细胞能分泌表达sIL-6R,表达产物具有免疫活性和生物活性。     

白细胞介素—6和γ—干扰素基因在甲状腺组织中表达的研究

目的　研究白细胞介素 - 6 (IL - 6 )、γ-干扰素 (IFN-γ) m RNA在正常及病理甲状腺组织中的表达特征。方法　病理甲状腺组织取自 Graves病 (GD)和非毒性结节性甲状腺肿 (MNG)的手术患者 ,正常对照取材于孤立性良性甲状腺腺瘤旁正常组织 ,m RNA基因的检测采用逆转录 -聚合酶链反应 (RT- PCR)技术。结果　 4例 GD、2例 MNG甲状腺组织均表达 IL - 6和 IFN -γ m RNA ,2份正常甲状腺样本中仅 1例含有 IL - 6与 IFN -γ m RNA。结论　 IL - 6、IFN-γ等细胞因子参与自身免疫性甲状腺疾病 (AITD)的免疫病理过程 ,并与甲状腺功能的紊乱密切相关。     

人可溶性gp130（sgp130）分子的克隆与表达

在成功克隆表达人膜型ｇｐ１３０分子的基础上，构建人可溶性ｇｐ１３０的重组表达质粒ｐＫＣＲ６／ｓｇｐ１３０，并在ＣＨＯ细胞中进行表达。经纯化鉴定和生物学检测，证实所表达的ｓｇｐ１３０具有生物活性。     

重组人白细胞介素10基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的：克隆编码人白细胞介素10（hIL-10）基因的全长cDNA,构建真核表达载体,并在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中进行表达.方法：应用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）技术,从活化的正常人外周血单个核细胞中扩增出hIL-10 cDNA,将测序正确的hIL-10 cDNA克隆至真核表达载体pcDNA3构建重组表达载体.采用磷酸钙法转染CHO细胞,用ELISA法检测hIL-10基因的表达,用单四唑（MTT）检测hIL-10蛋白的活性.结果：RT-PCR产物插入Teasy载体,经序列测定证实hIL-10基因全序列克隆成功.在CHO细胞培养上清中有hIL-10的表达,该产物能抑制淋巴细胞转化.结论：成功构建了真核表达质粒pcDNA3-hIL-10,为进一步研究hIL-10在自身免疫、移植免疫及炎症性疾病中的作用打下了基础.     

人白细胞介素2基因在大肠杆菌中表达水平的提高及产物初步纯化

利用双Ｔａｃ启动子和改造后的人白细胞介素２（ＩＬ－２）ｃＤＮＡ，提高了ＩＬ－２在大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中的表达水平，并经包涵体制备、分子重新折叠及分子筛层析等技术，对表达的ＩＬ－２进行了提取、活性恢复与纯化，纯度可达９５％。本工作为用基因工程方法生产人ＩＬ－２积累了经验。     

应用RT—PCR技术克隆人白细胞介素6的cDNA

0引言人白细胞介素6（11。－6）是一种由212个氨基酸组成的多功能细胞因子「‘’，我们应用反转录一聚合酶链反应（RT－P（二）的方法，成功地从人Hel。a细胞中克隆了11。－6的CDNA，为后续的表达奠定了基础．l材料和方法1．l材料人Hel。a细胞系购自中科院细胞生物所；pUC19及JM103为本实验室保存；Taq聚合酶、AMV反转录酶、T4ljNA连接酶及MagicPCR纯化试剂盒为Promega产品；重组a干扰素和DMEM培养基为GIBCO产品；内切酶为华美公司产品；PCRdl物PI：5’CGGAATTCATGC－CAGlxACCCCCAGGAG3’pZ：5’（7G（iGATCC…     

重组人白细胞介素—2的分离纯化

报道了重组人白细胞介素-2(rHuIL-2)高表达菌株的最佳培养和表达条件、表达产物的分离纯化、复性条件对rHuIl-2活力的影响及高纯度rHuIL-2的性质鉴定。利用制备性SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行rHuIL-2的纯化,回收率可达80%以上,纯度达95%以上,其比活为1～2×10~6 U/mg,能在体外维持CTLL和CTC细胞的增殖,其分子量、等电点、氨基酸组成、N-末端分析结果与德国Boehringer公司的同类产品基本一致。     

人白细胞介素24基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

目的：构建人白细胞介素24（hIL-24）基因原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达hIL-24蛋白,并测定其生物学活性。方法：用PCR方法从含有hIL-24的质粒中扩增hIL-24 cDNA序列,测序鉴定正确后,应用基因重组技术构建PQE/hIL-24,并转入大肠杆菌(E.coli)M15。IPTG诱导表达目的蛋白,镍凝胶亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析鉴定结果,应用外周血单核细胞（PBMCs）,通过ELESA法分别在48和72 h检测rhIL-24刺激的PBMCs中 IL-6、IFN-γ及TNF-α产生情况。结果：获得与GenBank中报道一致的hIL-24基因片段。SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析显示,获得具有hIL-24免疫原性、相对分子质量约为18 400目的蛋白。Ni²⁺-NTA agarose纯化得到单一条带蛋白, 获得rhIL-24蛋白刺激的PBMCs,PBMCs分泌IL-6、IFN-γ、TNF-α的水平显著高于未刺激前分泌水平(P<0.05),rhIL-24具有与天然hIL-24蛋白相同的生物学活性。结论 成功地构建了hIL-24的原核表达载体,在E.coli中高效表达了rhIL-24蛋白,获得了与天然hIL-24蛋白具有相同生物学活性的rhIL-24。