姜黄素通过影响巨噬细胞的极性延缓动脉粥样硬化进展

目的研究姜黄素对ApoE基因敲除(ApoE~(-/-))小鼠动脉粥样硬化进展及斑块中巨噬细胞极性的影响。方法用高脂高胆固醇饮食饲养ApoE~(-/-)小鼠建立动脉粥样硬化模型,设立姜黄素治疗组、阿托伐他汀治疗组和高脂组;通过免疫组织化学(HE染色、油红O染色、Masson染色、苏木精染色)及免疫荧光染色检测主动脉斑块形态及不同亚型巨噬细胞的含量。通过实时荧光定量PCR检测主动脉组织中炎症因子的表达。结果姜黄素干预能减轻ApoE~(-/-)小鼠主动脉粥样硬化病变,并降低动脉粥样硬化斑块的易损指数。姜黄素降低动脉粥样硬化斑块内M1/M2巨噬细胞的比值,减少M1型巨噬细胞分泌的促炎因子白细胞介素1β(IL-1β)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达,促进M2型细胞因子IL-10、Ym1和Fizz1的表达。结论姜黄素可通过影响斑块中巨噬细胞的极性、抑制相关的炎症反应,从而延缓ApoE~(-/-)小鼠动脉粥样硬化的进展。     

LDLR缺失促进CD11b＋Ly6C＋单核细胞的分化和CD11c＋树突状细胞的成熟

目的研究低密度脂蛋白受体敲除(LDLR~(-/-))对小鼠CD11b~+髓系免疫细胞增殖和分化的影响,探索异常免疫细胞反应在动脉粥样硬化发生中的炎症相关新机制。方法 6~8周龄的LDLR~(-/-)小鼠和对照野生型(WT)C57小鼠分别给予普通饮食和高脂饲养12周。采用流式细胞术分析外周血、脾脏和骨髓中免疫细胞亚群,尤其是CD11b~+Gr-1~+髓系免疫细胞、CD11b~+Ly6C+单核巨噬细胞和CD11b~+CD11c~+树突状细胞表达情况,同时检测Lin~-Sca-1~-CD34~+c Kit~+共同髓系祖细胞(CMP)在LDLR~(-/-)小鼠骨髓内表达情况。最后应用~(125)I标记anti-CD11b作为分子探针,在体无创监测LDLR~(-/-)小鼠主动脉粥样硬化斑块的炎症微环境。结果 (1)在普通饮食和高脂饲养状态下,LDLR缺失均可显著增加LDLR~(-/-)小鼠外周血和脾脏内CD11b~+和CD11b~+Gr-1~+髓系细胞的表达。(2)LDLR~(-/-)小鼠外周血和肝脏中CD11b~+Ly6C~+单核巨噬细胞的表达增加;CD11b~+CD11c~+树突状细胞在LDLR~(-/-)小鼠脾脏中的表达增加。(3)普通饮食状态下,CMP的百分比在LDLR~(-/-)小鼠骨髓中较WT小鼠增加,但在高脂饲养时减少。(4)以CD11b为炎症分子靶标,可用SPECT/CT实时监测LDLR~(-/-)小鼠动脉粥样斑块。结论 LDLR缺失显著增加CD11b~+Gr-1~+髓系免疫细胞的增殖和动员,促进LDLR~(-/-)小鼠单核巨噬细胞的分化和树突状细胞的成熟。以CD11b~+髓系细胞为靶标,可以在体监测动脉粥样斑块的炎症微环境。     

实验性小鼠动脉粥样硬化斑块易损指数计算方法的优化

目的通过对Shiomi等提出的以脂质堆积为核心的斑块易损指数计算方法进行优化,以期更全面、客观地对实验性动脉粥样硬化斑块不稳定性进行评估。方法实验分为对照组(C57BL/6小鼠)和模型组(LDLR~(-/-)和ApoE~(-/-)小鼠),每组6只动物。对照组给予正常饲料,模型组给予高脂饲料,25周后处死动物,分离主动脉根部和主动脉弓,经OCT包埋后连续切片,分别进行HE、苦味酸-天狼猩红、油红O、阿利新蓝染色,内皮细胞及平滑肌细胞免疫荧光染色、基质金属蛋白酶及巨噬细胞免疫组织化学染色。对Shiomi等提出的斑块易损指数公式进行改良,在计算公式分子中增加影响斑块不稳定性因素,同时在分母中增加影响斑块稳定性指标,优化动脉粥样硬化斑块易损指数计算公式。通过对比两个公式对LDLR~(-/-)小鼠主动脉根部和无名动脉斑块稳定性的判断,考察评估优化后计算公式的可靠性。之后采用优化公式对高脂饮食ApoE~(-/-)小鼠和LDLR~(-/-)小鼠主动脉不同部位斑块稳定性进行评价,对比两种小鼠动脉粥样硬化进展的差异。结果模型组小鼠主动脉不同部位斑块破损面积,脂质沉积,胶原蛋白、蛋白多糖和基质金属蛋白酶分布,巨噬细胞浸润,纤维帽内皮细胞覆盖率和平滑肌细胞覆盖率与对照组相比发生明显改变。在此基础上优化了基于多指标病理染色的斑块不稳定性计算公式。通过计算发现,ApoE~(-/-)小鼠和LDLR~(-/-)小鼠无名动脉斑块易损指数明显大于主动脉根部;而在相同部位,ApoE~(-/-)小鼠斑块易损指数明显高于LDLR~(-/-)小鼠。结论本研究所优化的基于多指标组织病理学染色的斑块易损指数计算公式,涵盖多种影响斑块不稳定性的重要因素,可对斑块不稳定性进行准确评估。该方法简单、全面、可靠,具有较大实用价值。     

二甲双胍通过激活AMPK/STAT3通路调控巨噬细胞分化抑制小鼠动脉粥样硬化形成

目的 探究二甲双胍(Met)通过腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/信号转导及转录激活因子3(STAT3)信号通路调控巨噬细胞表型对小鼠动脉粥样硬化(As)形成的影响。方法 体外培养RAW264.7巨噬细胞,使用脂多糖促进巨噬细胞分化,同时使用Met刺激细胞。流式细胞术检测不同表型(CD86、CD206)巨噬细胞比例。Western blot检测相关信号通路蛋白诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶1(Arg-1)、AMPK、磷酸化AMPK(pAMPK)、STAT3、磷酸化STAT3(pSTAT3)蛋白表达水平。高脂饲料喂养ApoE－/－小鼠构建As模型。实验组(Met组)小鼠予Met灌胃干预,对照组(CTL组)小鼠给予同体积生理盐水灌胃干预。3个月后,提取小鼠大动脉全长(头臂干至双侧髂动脉)及主动脉根部,分别行油红O染色和免疫荧光染色,评价主动脉脂质沉积情况和脂质斑块内巨噬细胞不同表型比例。提取大动脉蛋白,Western blot验证相关信号通路的AMPK、pAMPK、STAT3、pSTAT3蛋白表达水平。结果 细胞实验表明,Met刺激后M1巨噬细胞比例明显减少,M2巨噬细胞比例明显增加(P＜0.05),AMPK活性明显增加,而STAT3活性明显下降。动物实验表明,在造模3个月后,油红O染色示Met组小鼠大动脉全长和主动脉瓣膜处脂质沉积均较CTL组明显减少(P＜0.05)；免疫荧光染色示Met组脂质斑块内M1巨噬细胞比例较CTL组明显减少,而M2巨噬细胞比例较CTL组明显增多(P＜0.05)。Western blot实验显示,与CTL组相比,Met组AMPK活性明显增加,而STAT3活性明显降低(P＜0.05)。结论 Met通过激活AMPK抑制STAT3活性,调控斑块内巨噬细胞表型分化,抑制小鼠As形成。     

鸢尾素对载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化的影响

目的研究鸢尾素对载脂蛋白E基因敲除(ApoE~(-/-))小鼠动脉粥样硬化的影响。方法将ApoE~(-/-)小鼠随机分为正常对照组、动脉粥样硬化模型组、鸢尾素组,每组10只,分别给予普通饮食+生理盐水、高脂饮食+生理盐水、高脂饮食+鸢尾素,饲养至12周后处死,处死前测体重,用化学法测定总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)、血清超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量。采用HE染色和整体油红O染色分析主动脉粥样斑块面积大小,实时荧光定量(qRT-PCR)检测主动脉CD36、NF-κB p65的mRNA表达,Western blot检测主动脉CD36、NF-κB p65、SOD的蛋白表达。结果动脉粥样硬化模型组主动脉斑块面积明显高于正常对照组,内膜明显增厚,而鸢尾素组较动脉粥样硬化模型组斑块面积减少,内膜增厚程度下降。与正常对照组比较,动脉粥样硬化模型组小鼠体重、TC、TG、LDLC、MDA水平升高,NF-κB p65、CD36mRNA和蛋白表达增加,而血清SOD活性、HDLC水平减低(P0.05)。与动脉粥样硬化模型组比较,鸢尾素组小鼠体重、TC、TG、LDLC、MDA水平降低,NF-κB p65、CD36 mRNA和蛋白表达下调,而血清SOD活性、HDLC水平升高(P0.05)。结论鸢尾素能减轻ApoE~(-/-)小鼠动脉粥样硬化的发生发展,这可能与其降低小鼠体重和血脂、抑制炎症反应、抗氧化应激有关。     

载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块中血小板因子4和Toll样受体2的表达

目的观察高脂饲养的载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块表达Toll样受体2和血小板因子4的情况,探讨血小板因子4对内皮细胞Toll样受体2表达的影响。方法高脂饲料喂养载脂蛋白E基因敲除小鼠12周,建立动脉粥样硬化模型。安乐死处死动物,原位灌流固定,取主动脉于10%中性缓冲福尔马林中固定,石蜡包埋连续切片,HE染色观察动脉粥样硬化斑块形态,免疫组织化学检测斑块中Toll样受体2和血小板因子4的表达。结果载脂蛋白E基因敲除小鼠血脂水平明显增高,主动脉HE染色可见态动脉粥样硬化病变。在载脂蛋白E基因敲除小鼠主动脉富含脂质斑块中Toll样受体2表达上调,其中血管内皮细胞、巨噬细胞表达Toll样受体2明显增多。载脂蛋白E基因敲除小鼠主动脉斑块中也发现有血小板因子4表达,主要在内皮细胞和动脉粥样硬化斑块肩部。结论1.载脂蛋白E基因敲除小鼠粥样斑块中Toll样受体2表达上调,并且Toll样受体2主要表达在粥样斑块的内皮细胞和巨噬细胞上。2.载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块中可见血小板因子4表达。     

β3肾上腺素受体激动剂米拉贝隆对载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化的影响

目的:探索米拉贝隆(mirabegron)对动脉粥样硬化(As)的作用。方法:建立载脂蛋白E基因敲除(ApoE~(-/-))小鼠As模型(n=16)并分为米拉贝隆组(n=8)、安慰剂组(n=8),同时设立空白对照组(n=8)。米拉贝隆干预6周后,采集小鼠心脏及主动脉标本,油红O及HE染色观察主动脉斑块面积,Masson染色观察主动脉根部胶原纤维含量,免疫组织化学染色检测主动脉根部平滑肌细胞,巨噬细胞表达水平。结果:与空白对照组相比,安慰剂组小鼠主动脉斑块表面积(P0.05)、横截面积(P0.05)显著增大,斑块中平滑肌数目(P0.05)、巨噬细胞数目(P0.05)、胶原纤维(P0.05)均明显升高;与安慰剂组相比,米拉贝隆组小鼠主动脉斑块表面积(P0.05)及横截面积(P0.05)显著减小,斑块中平滑肌数目(P0.05)、巨噬细胞数目(P0.05)及胶原纤维成分(P0.05)均显著下降。结论:米拉贝隆可延缓Apo E~(-/-)小鼠As的发展,具有潜在的防治As的临床价值。     

复方普洱茶饮料对动脉粥样硬化小鼠主动脉斑块的干预作用及血清TXA2/PGI2比值和DNA甲基化水平的影响

目的探讨复方普洱茶饮料对高脂喂养的Apo E基因敲除(ApoE~(-/-))小鼠动脉粥样硬化(As)斑块的干预作用及血清血栓素(TX)A2/前列环素(PG)I2比值和DNA甲基化水平的影响。方法将30只8周龄雄性ApoE~(-/-)小鼠高脂饲料喂养6 w后随机分为模型组、立普妥(阳性对照组)和茶饮料组(n=10),给予药物干预6 w,另设正常组同品系小鼠(C57BL/6J家系)6只。检测其血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、胰岛素、TXA2、PGI2、DNA甲基化转移酶(DNMT)水平和DNA甲基化水平。HE染色和VG染色,图像分析测量小鼠主动脉As斑块面积、斑块内细胞外脂质成分和胶原成分。结果与模型组相比,茶饮料组和立普妥组小鼠血清TC和TG水平明显降低,HDL-C水平明显升高(均P0.01),校正后主动脉As斑块面积、斑块内细胞外脂质成分显著降低(P0.05);小鼠血清DNA甲基化、DNMT及胰岛素水平、小鼠血清TXA2水平显著降低而血清PGI2水平显著升高(均P0.01)。结论复方普洱茶饮料可以降低血清TXA2/PGI2比值和DNA甲基化水平,从而达到抗ApoE~(-/-)小鼠主动脉As斑块的作用。     

ApoE~(-/-)小鼠动脉粥样硬化进程中microRNA-146a的表达变化

目的:观察ApoE~(-/-)小鼠动脉粥样硬化发生过程中microRNA-146a(miR-146a)的变化,探讨miR-146a与动脉粥样硬化之间的关系。方法:在ApoE~(-/-)小鼠中通过高脂高胆固醇喂饲构建动脉粥样硬化模型,分别在喂饲后第0周、4周、8周、12周、16周时采血和分离主动脉组织,通过HE染色和油红O染色观察主动脉组织的斑块形态,计算主动脉内膜/中膜比值和主动脉斑块的脂质含量;采用Real-Time PCR检测第0周、4周、8周、12周、16周时血浆和主动脉组织的miR-146a水平。结果:在高脂高胆固醇饲养后第8周时ApoE~(-/-)小鼠主动脉组织开始出现动脉粥样硬化,在第16周时主动脉粥样硬化最显著,16周时主动脉组织的内膜/中膜比值和主动脉斑块的脂质含量显著升高(P0.01);在动脉粥样硬化发生过程中,小鼠血浆和主动脉组织中的miR-146a水平均明显升高,其中血浆miR-146a的峰值出现在第8周(P0.01),之后血浆miR-146a逐渐下降;而主动脉组织的miR-146a水平从第4周开始升高(P0.05),逐渐上升至16周时达到峰值(P0.01);主动脉组织中miR-146a水平与ApoE~(-/-)小鼠主动脉粥样硬化呈强正相关性(r=0.892 5,P0.000 1)。结论:miR-146a可能参与了ApoE~(-/-)小鼠主动脉主动脉粥样硬化的发生。     

西洋参茎叶总皂苷对载脂蛋白E基因敲除小鼠血脂及脂质代谢相关基因周脂素和CD36表达的影响

目的观察西洋参茎叶总皂苷对载脂蛋白E基因敲除小鼠斑块成分及脂质代谢相关基因周脂素和清道夫受体CD36表达的影响,探讨西洋参茎叶总皂苷稳定动脉粥样硬化斑块的作用及可能机制。方法33只6~8周龄小鼠载脂蛋白E基因敲除小鼠予高脂饮食喂养13周后,待其形成成熟的动脉粥样硬化斑块后,随机分为3组:模型组、西洋参茎叶总皂苷组、辛伐他汀组(阳性对照组),每组11只。继续高脂喂养,并按体重比折算给予小鼠临床推荐剂量的相应药物治疗13周,处死动物,检测血脂,取心脏和主动脉,每只小鼠均取主动脉根部的4个切面,分别行HE染色和Movat染色,观察并计算各组小鼠主动脉粥样斑块内脂质核心大小,脂质成分与胶原成分比值。实时荧光定量PCR法检测主动脉内周脂素和CD36 mRNA的表达。结果给药13周后,与模型组比较西洋参茎叶总皂苷组小鼠主动脉斑块内脂质核心面积以及脂质成分与胶原成分比值明显减小(P<0.01),血清高密度脂蛋白显著升高(P<0.01)。而主动脉内周脂素和CD36 mRNA的表达与模型组比较均显著降低(P<0.05)。结论在临床推荐剂量上,西洋参茎叶总皂苷可通过改善载脂蛋白E基因敲除小鼠主动脉斑块内部成分,尤其是减少斑块内脂质含量来起到稳定动脉硬化斑块的作用,其机制可能与抑制脂质代谢相关基因周脂素和清道夫受体CD36 mRNA的表达有关。     

JAZF1基因过表达对ApoE~(-/-)小鼠脂代谢及动脉粥样硬化的影响

目的探讨JAZF1基因过表达对ApoE-/-小鼠脂代谢及动脉粥样硬化(AS)的影响。方法将48只雄性ApoE-/-小鼠随机分为:高脂+空载(GF组)及高脂+JAZF1质粒组(JAZF1组)、高脂+生理盐水组(HF组)。检测各组血脂、生化指标、组织脂质含量、粪便胆汁酸及主动脉内膜粥样硬化病变。采用[1-14 C]醋酸盐腹腔注射,免疫荧光观察JAZF1基因过表达对ApoE-/-小鼠肝脏TC合成代谢及斑块巨噬细胞聚集的影响。结果JAZF1组肝脏JAZF1表达以及HDL-C/TC高于HF、GF组(P均0.05),而FBG、FIns、TC、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、动脉粥样硬化指数(AI)、血脂综合指数(LCI)和肝脏TC含量低于HF、GF组(P均0.05);与HF组和GF组比较,JAZF1组血管内膜脂质堆积减少,主动脉内斑块泡沫细胞聚集较少,斑块面积、斑块面积/管腔面积、主动脉粥样斑块内巨噬细胞CD68表达、肝脏14 C标记TC放射活性及肝和小肠14 C标记TC放射活性降低(P0.05或P0.01)。结论 JAZF1基因过表达可减少ApoE-/-小鼠肝脏TC含量,并抑制TC合成,改善脂代谢,抑制巨噬细胞在斑块内的聚集,减轻和延缓AS的形成。     

大蒜素对高脂饮食ApoE－/－小鼠动脉粥样硬化形成的影响

目的观察大蒜素对高脂饮食诱导的ApoE~(-/-)小鼠巨噬细胞泡沫化及动脉粥样硬化形成的影响,并从清道夫受体调控的角度探讨其相关的作用机制。方法 6周雄性ApoE~(-/-)小鼠随机分为4组:正常饮食组、高脂饮食组、高脂饮食+低剂量大蒜素组、高脂饮食+高剂量大蒜素组。采用血脂检测试剂盒测定小鼠血脂水平;使用油红O染色法观察小鼠主动脉根部斑块形成面积和腹腔巨噬细胞泡沫化情况;Western blot法检测腹腔巨噬细胞中清道夫受体SR-A和CD36表达以及JNK和p38激酶磷酸化水平。结果大蒜素可呈剂量依赖性降低高脂饮食小鼠总胆固醇、甘油三酯及低密度脂蛋白胆固醇的水平(P0.05),并显著减少主动脉根部斑块面积以及腹腔巨噬细胞泡沫化的形成(P0.05)。Western blot结果显示大蒜素不仅抑制高脂饮食所诱导的腹腔巨噬细胞中SR-A和CD36表达的增加(P0.05),还能够显著减少JNK和p38激酶磷酸化水平。结论大蒜素减少SR-A和CD36表达,并抑制JNK和p38激酶激活,从而发挥抗泡沫化和动脉粥样硬化的作用。     

糖基化高密度脂蛋白对ApoE~(-/-)小鼠颈动脉粥样硬化斑块稳定性的影响

目的:探究糖基化高密度脂蛋白(HDL)对载脂蛋白E(ApoE)~(-/-)小鼠颈动脉粥样斑块稳定性的影响。方法:通过ApoE~(-/-)小鼠颈动脉套管手术配合高脂饮食的方式诱导小鼠动脉粥样硬化斑块的模型,将术后4周经后尾静脉注射糖基化HDL的ApoE~(-/-)小鼠设为G-HDL组,注射正常HDL的小鼠设为HDL组,注射磷酸盐缓冲液(PBS)的小鼠设为PBS组;术后6周将小鼠安乐处死,取小鼠的颈动脉进行组织病理和免疫组织化学检查。结果:3组间血脂水平和体质量差异无统计学意义(P≥0.05)。与HDL组相比,苏木精-伊红染色显示GHDL组颈动脉斑块体积较小、粥样斑块内纤维帽细薄、脂质核心大融合成片,管腔狭窄程度较轻;油红O染色颈动脉斑块内红染区域明显增多(P0.05);Masson染色显示斑块内胶原面积显著减少(P0.05);免疫组织化学检测显示平滑细胞和巨噬细胞增多。结论:G-HDL不影响血脂水平,通过增加斑块内脂质沉积、斑块内纤维帽变薄和巨噬细胞增加,使得动脉粥样斑块不稳定,本研究为糖尿病动脉粥样硬化的防治提供新的方向。     

脂多糖动员骨髓CD11b+Gr-1+髓系抑制细胞及其吞噬氧化型低密度脂蛋白形成泡沫细胞

目的 研究小鼠骨髓来源的未成熟CD11b+ Gr-1+髓系前体细胞在急性炎性脂多糖刺激下动员释放.及其诱导分化成巨噬细胞样细胞后吞噬氧化型低密度脂蛋白形成泡沫细胞.方法 小鼠腹腔注射脂多糖5μg/g体重,24 h后采用流式细胞术分析骨髓,脾脏,和外周血中CD11b+Gr-1+髓系前体细胞,CD11b+Gr-1-单核细胞,和CD11b-Gr-1+粒细胞的百分比的变化.体外泡沫细胞形成实验取小鼠骨髓单个核细胞以DMEM培养基+胎牛血清培养,以粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子诱导分化48 h,加入100 mg/L氧化型低密度脂蛋白孵育48 h以形成脂质负荷泡沫细胞.油红O染色鉴定泡沫细胞.结果 (1)脂多糖腹腔注射可以显著促进CD11b+Gr-1+髓系前体细胞从骨髓动员并释放到外周组织;脾脏和循环中CD11b+Gr-1+髓系前体细胞和CD11b+Gr-1-单核细胞显著增加.(2)从骨髓分离的CD11b+Gr-1+髓系前体细胞以粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子诱导分化后形成单核/巨噬细胞样细胞,继而加入氧化型低密度脂蛋白孵育,可以形成脂质负荷细胞(泡沫细胞).油红O染色可见泡沫细胞的胞浆中有红染的大型脂滴,核被胞浆内脂滴挤压在一侧.结论 急性炎性刺激脂多糖可以动员小鼠骨髓CD11b+Gr-1+髓系前体细胞的向循环和外周组织释放.CD11b+Gr-1+髓系前体细胞可被诱导分化并吞噬氧化型低密度脂蛋白形成泡沫细胞.     

载脂蛋白CⅢ通过增加氧化应激及内质网应激水平促进动脉粥样硬化病变

目的构建载脂蛋白CⅢ(Apo CⅢ)转基因小鼠,并与动脉粥样硬化易感的低密度脂蛋白受体(LDLR)敲除小鼠杂交,获得Apo CⅢ转基因+LDLR缺陷(Apo CⅢ+LDLR~(―/―))小鼠模型,开展Apo CⅢ对动脉粥样硬化影响及潜在机制的研究。方法 Apo CⅢ+LDLR~(―/―)小鼠与LDLR~(―/―)小鼠喂饲高脂饲料3个月,检测其血浆甘油三酯、总胆固醇、脂质过氧化产物和还原性谷胱甘肽水平。对小鼠的全主动脉和主动脉窦进行油红O染色及二氢乙啶染色,并提取主动脉的RNA和蛋白,分析相关基因的表达。结果 Apo CⅢ+LDLR~(―/―)小鼠喂饲高脂饲料后血浆甘油三酯水平明显高于LDLR~(―/―)小鼠,但总胆固醇水平差别不明显。主动脉全长和主动脉窦的染色显示动脉粥样硬化斑块明显增加。Apo CⅢ+LDLR~(―/―)小鼠血浆脂质过氧化产物8-异前列腺素和丙二醛水平明显升高,抗氧化物质还原性谷胱甘肽水平明显降低。对其主动脉进行二氢乙啶染色发现,动脉内活性氧水平明显增加。主动脉内氧化应激和内质网应激相关基因的mRNA和蛋白表达明显升高。提示Apo CⅢ可能通过增加动脉内的氧化应激和内质网应激,从而促进动脉粥样硬化斑块形成。结论 Apo CⅢ具有促动脉粥样硬化的作用,其机制可能与整体氧化应激水平的升高以及动脉壁氧化应激、内质网应激水平的增加有关。     

Orai1在载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块形成中的表达

目的探讨Orai1在载脂蛋白E基因敲除(Apo E-/-)小鼠动脉粥样硬化斑块形成过程中的表达。方法选取7~8周龄雄性Apo E-/-小鼠及野生型C57BL/6J小鼠,高脂饲喂20、27和33周后,在各个时点处死动物。取主动脉制备连续切片,HE、Masson染色计算机图像分析仪测定斑块面积占管腔面积百分比,及胶原成分占斑块面积百分比;油红O染色分析斑块中脂质含量;免疫组织化学染色测定平滑肌细胞阳性表达Orai1的百分比;Western Blot定量分析Orai1在易损斑块形成过程中的动态表达。结果与同周龄C57BL/6J小鼠相比,Apo E-/-小鼠主动脉Orai1表达增高,且随着其周龄增加,Orai1在Apo E-/-小鼠主动脉的表达动态升高(P0.05)。结论 Orai1参与动脉粥样硬化斑块形成的病理过程,在其形成过程中其表达上调。     

MicroRNA-21及其靶基因程序性细胞死亡因子4在动脉粥样硬化中的作用

目的探讨microRNA(miR)-21及其靶基因程序性细胞死亡因子4(PDCD4)在动脉粥样硬化(AS)发生发展中的作用。方法收集38例急性ST段抬高型心肌梗死(STEMI)患者及34例非冠心病患者的血浆,实时定量PCR检测miR-21的表达水平。在Lipo3 000的介导下,将miR-21类似物、抑制剂及沉默PDCD4(siP DCD4)分别转染鼠巨噬细胞系RAW 264.7细胞,并用氧化修饰低密度脂蛋白(ox-LDL)与细胞共同孵育,设立空白对照组(未转染且未加ox-LDL)及ox-LDL组(仅加oxLDL)。采用油红O染色检测细胞泡沫化程度,实时定量PCR及Western blot分别检测泡沫细胞中miR-21及PDCD4蛋白水平。此外,建立ApoE~(-/-)小鼠AS模型20只,按随机数字表法分为3组:单纯高脂喂养组6只、过表达miR-21组7只及阴性对照组(NC,7只),鼠尾静脉注射胆固醇包裹的miR-21激动剂(agomiR-21)及阴性对照agomiR-NC分别建立过表达miR-21组及NC组。选用正常饲料喂养的C57BL/6小鼠作为正常对照组。实时定量PCR检测miR-21在AS斑块及正常动脉组织中的表达;Western blot及免疫组化分别检测PDCD4蛋白水平。结果与相应的对照组比较,miR-21在STEMI患者血浆、泡沫细胞及单纯高脂喂养ApoE~(-/-)小鼠斑块组织中的表达水平均明显升高(P<0.001;P<0.01;P<0.01);泡沫细胞及单纯高脂喂养ApoE~(-/-)小鼠斑块内PDCD4蛋白水平明显增多;与ox-LDL组比较,ox-LDL+miR-21类似物组及ox-LDL+siP DCD4组巨噬细胞泡沫化程度明显下降,ox-LDL+miR-21抑制剂组细胞泡沫化程度明显增加。过表达miR-21组AS斑块内PDCD4蛋白水平较NC组明显减少,且斑块较NC组明显减小。结论 miR-21在急性STEMI患者血浆中、泡沫细胞及AS斑块内的水平明显升高。过表达miR-21及沉默PDCD4可抑制巨噬细胞向泡沫细胞的转化,这与动物组织实验结果一致,表明miR-21或可靶向调控PDCD4的表达,从而发挥抗AS的作用。     

载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化病变进展过程中循环单核细胞亚群和斑块内增殖巨噬细胞的动态变化

目的观察载脂蛋白E基因敲除(Apo E-/-)小鼠动脉粥样硬化病变进展过程中循环单核细胞亚群(Ly6G-CD11b+Ly Chi和Ly6G-CD11b+Ly6Clo)比例和斑块内局部增殖巨噬细胞密度的动态变化。方法 40只Apo E-/-小鼠随机分为正常饮食组和高脂饮食组,分别于饮食干预后第2周末、第4周末、第6周末和第8周末处死部分动物,油红O染色检测主动脉根部动脉粥样硬化斑块面积,免疫荧光染色和共聚焦显微镜成像检测斑块内的巨噬细胞和增殖巨噬细胞(F4/80和Ki67双阳性细胞),流式细胞术分析循环单核细胞亚群比例。结果随着高脂饮食时间的增加主动脉动脉粥样硬化病变逐渐加重;动脉斑块中总巨噬细胞和增殖巨噬细胞密度在高脂饮食后进行性升高,并于第4周末达到高峰;巨噬细胞与增殖巨噬细胞密度百分比在高脂饮食后进行性升高,并于第6周末达到高峰;随着高脂饮食时间的增加Ly6G-CD11b+Ly Chi单核细胞亚群比例逐渐增大。结论在Apo E-/-动脉粥样硬化模型发展过程中,循环Ly6G-CD11b+Ly Chi单核细胞呈递增趋势,增殖巨噬细胞密度在第4周达到平台期。     

敲除miR-223促进血管炎症和动脉粥样硬化的发生

目的研究miR-223对血管炎症和动脉粥样硬化的影响,为临床动脉硬化性疾病提供新的诊疗方向。方法miR-223敲除鼠与ApoE敲除鼠(ApoE KO)繁殖制备miR-223/ApoE双敲鼠(miR-223/ApoE DKO);检测小鼠血浆脂质水平;处死取材后检测主动脉根部及血管全长的斑块含量;通过免疫组化检测斑块的炎症细胞浸润;转录组学测序分析血管中炎症相关基因的表达;结合microRNA靶基因数据库寻找并验证其可能的靶基因。结果miR-223/ApoE双敲鼠主动脉根部及血管全长斑块量显著增加(P<0.05)。免疫组化染色显示,主动脉根部炎症细胞浸润增加;血管转录组学测序发现炎症相关基因血管细胞黏附分子1(VCAM-1)、白细胞介素1α(IL-1α)等在双敲鼠中显著上调。通过靶基因数据库筛选,发现白细胞介素6(IL-6)是miR-223的靶基因并且在双敲鼠的血管中表达显著上调;使用miR-223模拟物刺激成纤维细胞,显著抑制了IL-6的表达。结论miR-223抑制靶基因IL-6的表达降低炎症反应,敲除miR-223显著升高血管炎症水平促进动脉粥样硬化的进展。     

负向调控调节性T细胞对小鼠动脉粥样硬化形成的影响

目的通过干扰FOXP3基因来研究负向调控天然调节性T细胞对ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化的影响。方法构建FOXP3-siRNA慢病毒载体和获取Foxp3hight+CD4+CD25+Treg细胞分别通过尾静脉注入不同组小鼠体内;利用流式细胞仪检测小鼠体内CD4+CD25+Treg细胞数目;利用ELISA法检测各组脾细胞炎性因子浓度;取小鼠升主动脉动脉行病理分析其粥样斑块大小。结果注入FOXP3-siRNA慢病毒载体的小鼠CD4+CD25+Treg细胞数目减少,动脉粥样斑块面积显著增大。而注入Foxp3hight++CD4+CD25+Treg细胞则相反,小鼠CD4+CD25+Treg细胞数目增加,动脉粥样斑块面积减小。结论负向调控天然调节性T细胞能促进动脉粥样硬化的形成。