沙门氏菌胞周蛋白二硫键异构酶DsbA对乙肝疫苗HBsAg'a'表位构象的作用研究

目的:研究沙门氏菌胞周蛋白二硫键异构酶DsbA对乙肝疫苗HBsAg'a'表位构象的形成作用.方法:将沙门氏菌胞周蛋白二硫键异构酶DsbA基因克隆于PET32b载体上,与乙肝疫苗HBsAg'a'表位载体共转BL21菌,运用流式细胞仪和荧光显微镜观察HBsAg'a'表位构象的形成.结果:在没有沙门氏菌胞周蛋白二硫键异构酶D...     

蛋白二硫键异构酶小分子抑制剂PACMA-31对血小板活化、血栓形成以及止血的影响

目的蛋白二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)通过催化底物蛋白的二硫键调控其结构和功能。近期有研究发现小分子抑制剂PACMA-31(propynoic acid carbamoyl methyl amide-31)能够特异性地抑制PDI酶活性,本文我们将探讨PACMA-31对血小板活化和血栓形成的影响。方法通过还原酶活性测定实验验证PACMA-31抑制PDI酶活的特异性;通过血小板聚集实验、活体荧光显微镜实验和小鼠尾巴出血实验检测PACMA-31对血小板聚集,体内血栓形成和止血的影响。结果 PACMA-31能够显著地抑制重组PDI蛋白的还原酶活性,而不抑制重组ERp57蛋白的还原酶活性。PACMA-31抑制血小板聚集,同时对血小板的积聚以及纤维蛋白形成起抑制作用,并能够延长小鼠尾巴出血时间。结论 PDI的小分子抑制剂PACMA-31显著抑制血小板聚集,血栓形成和止血。     

铜绿假单胞菌多表位核酸疫苗的构建及其生物学作用的研究

目的:构建铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)多表位-MyD88基因疫苗并对其免疫原性进行研究。方法:将PA外膜蛋白F(OprF)的三个中和性B细胞表位及一个外源通用T细胞表位串联,采用重叠PCR方法合成DNA,并在此序列前插入组织型纤溶酶原(tPA)的信号肽基因,将此获得的片段与MyD88基因分别克隆入pIRES载体构建重组质粒pIRES-tPA-OprF:MyD88,并将该质粒免疫Balb/c小鼠,采用ELISA法测定特异性抗体水平。气管内接种PA,进行肺组织匀浆PA细菌计数。结果:成功构建真核表达质粒pIRES-tPA-OprF:MyD88,用该质粒免疫小鼠,能刺激机体产生高度特异性抗体,气管接种PA后,免疫组小鼠肺匀浆细菌计数明显低于其他对照组。结论:成功构建了重组有MyD88基因的PA表位核酸疫苗,接种小鼠后可诱导特异性免疫应答,产生较好的抗铜绿假单胞菌感染的免疫保护作用。     

HIV-1 B’亚型感染者Nef蛋白CTL表位变异与病毒载量的相关性

目的探讨HIV-1 B’亚型毒株感染者Nef蛋白细胞毒性淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)表位变异及其与病毒载量的相关性。方法从137例HIV-1 B’亚型毒株感染者的血浆样本中提取病毒RNA,经逆转录及巢式PCR扩增获得Nef基因并测序,将获得的Nef基因序列翻译为蛋白序列,然后与HIV免疫学数据库中经过实验证实的CTL表位进行比对,分析Nef蛋白CTL表位变异与感染者病毒载量的关系。结果与HIV免疫学数据库中CTL表位的比较发现,本研究137例HIV-1 B’亚型毒株感染者病毒Nef蛋白大部分CTL表位相对保守,只有5个表位的变异频率超过10%,CTL表位旁序列的变异程度较锚着位点变异大,表位旁上下游第一位氨基酸的突变频率较高,表位氨基酸总变异频率、锚着位点和表位旁序列的氨基酸变异频率与病毒载量呈正相关,非锚着位点氨基酸的变异与病毒载量无相关性。结论 HIV-1 B’亚型毒株感染者Nef蛋白大部分CTL表位较保守,CTL表位旁序列变异程度较锚着位点大,表位旁上下游第一位氨基酸的突变频率较高,推测表位旁序列氨基酸的变异可能是Nef蛋白CTL逃逸突变的主要方式,Nef蛋白CTL表位变异与病毒适应性损伤的关系还需进一步研究。     

沙眼衣原体T细胞表位融合蛋白对沙眼衣原体感染小鼠的保护机制

目的：探讨沙眼衣原体（Ct）感染的T细胞表位融合蛋白疫苗（H-ctm1）对小鼠生殖道感染保护作用的机制,为研制和开发Ct T细胞表位融合蛋白疫苗奠定理论和实验基础。方法：建立阴道感染沙眼衣原体的动物模型。迟发型超敏反应（DTH）实验中,将14只小鼠随机分2个实验组： H-ctm1免疫组和未免疫组（每组7只）。测量每只小鼠双侧后脚掌厚度,左后脚掌足底皮下注射蔗糖-磷酸盐运送液（SPG）,右后脚掌皮下注射热灭活EB（HK-EBs）,每组分别比较左右后脚掌足底厚度和足底注射前后的厚度;在流式细胞术分析实验中,将21只雌性小鼠随机分为3组（每组7只）,分别为H-ctm1免疫组、HK-EBs免疫组（阳性对照）和磷酸盐缓冲液（PBS）免疫组（阴性对照）。免疫后在各组小鼠阴道内接种Ct。在阴道感染Ct后第6天取外周血对CD4+ 和 CD8+ T细胞进行流式细胞术分析。结果：DTH实验中,未免疫组小鼠左或右后脚掌注射前后足底厚度比较差异无显著性（P>0.05）,注射前或注射后左右后脚掌足底厚度比较差异无显著性（P>0.05）。免疫组小鼠注射前左右后脚掌足底厚度比较差异无显著性（P>0.05）,注射后左后脚掌足底厚度高于右后脚掌（P<0.05）。左后脚掌注射前后足底厚度比较差异无显著性（P>0.05）,右后脚掌注射后足底厚度高于注射前（P<0.05）。流式细胞术记数法测3组活化的CD4+和 CD8+ T细胞,H-ctm1组CD4+和CD8+ T细胞阳性率均高于HK-EBs组(P<0.05或P<0.01);H-ctm1组 和HK-EBs 组CD4+和CD8+ T细胞阳性率均高于PBS组(P<0.01)。结论：DTH参与了H-ctm1免疫小鼠的免疫应答;在H-ctm1中,HSP65的存在刺激DC细胞上调MHC（Ⅰ类途径和Ⅱ类途径）分子的表达水平,提高沙眼衣原体主要外膜蛋白表位的免疫原性。     

OmpC-HBsAg‘a’表位嵌合蛋白疫苗的构建表达及其对HBV转基因小鼠的免疫效果研究

目的：构建OmpC-HBsAg‘a’表位嵌合蛋白疫苗来研究对HBV转基因小鼠的免疫效果。方法：将HBsAg‘a’抗原决定簇主要肽段S-（124-147aa）插入到沙门氏菌外膜孔道蛋白OmpC第4 Loop区,并运用DsbA进行辅助二硫键形成,对HBV转基因小鼠免疫,激活固有免疫系统中的B-1细胞产生HBsAb。结果：HBsAg的adr‘a’表位CTSPAQGTSMF-PSCCCTKPSDGNC成功插入OmpC-HBsAg‘a’基因的588~659 bp之间,重组后的载体PCR鉴定和测序结果完全与设计相一致。IPTG诱导表达后,荧光显微镜显示3E7抗体能够识别BL21外膜表面的OmpC-HBsAg‘a’表位嵌合蛋白,用表达该蛋白的BL21直接免疫HBV转基因小鼠,能够产生HBsAb抗体。结论：OmpC-HBsAg‘a’表位嵌合蛋白在原核中表达具有天然构象,以此蛋白为基础的疫苗能够打破HBV转基因小鼠对HBsAg的免疫耐受。     

甲状旁腺激素相关蛋白对发育中的Meckel’s软骨作用的研究

目的观察SD大鼠下颌骨发育过程中甲状旁腺激素相关蛋白（PTHrP）在Meckel’s软骨上时空的变化,初步探讨PTHrP在Meckel’s软骨发育中的意义.方法用免疫组化染色法及原位杂交染色法检测E13-19dSD胎鼠的下颌骨发育过程中,PTHrP及PTHrPmRNA在Meckel’s软骨上的表达.结果 E13-15d在Meckel’s软骨前段PTHrP蛋白强阳性表达,在细胞核、胞浆均表达,在肥大软骨细胞核上表达更明显,而且PTHrPmRNA强阳性表达的位置与PTHrP蛋白一致.E17-19d Meckel’s软骨前段骨化,E17d在临近成骨处的Meckel’s软骨软骨细胞PTHrP蛋白弱阳性表达,且位于肥大软骨细胞核内,PTHrPmRNA阴性表达.E19dPTHrP临近成骨处蛋白染色阴性表达,PTHrPmRNA阴性表达;在前段远离骨化处PTHrPmRNA,PTHrP蛋白强阳性表达,细胞核上表达明显.结论 PTHrP在Meckel’s软骨前段软骨细胞中的表达存在时空特异变化,提示PTHrP蛋白可能由SD大鼠Meckel＇s软骨软骨细胞合成,并作为一种自分泌因子调节Meckel’s软骨细胞的增殖和分化.     

问号钩端螺旋体主要外膜蛋白免疫功能表位及其致炎作用的研究

目的:了解问号钩端螺旋体(简称钩体)主要外膜蛋白OmpL1、LipL32和LipL41免疫功能表位及其致炎作用.方法:建立Ni-NTA亲和层析法,提取不同基因型表达的目的重组蛋白rOmpL1/1和OmpL1/2、LipL32/1和rLipL32/2、LipL41/1和rLipL41/2.采用SDS-PAGE检测上述目的重组蛋白的表达情况和提取物纯度.分别采用Signal P3.0预测服务器Signal P-NN软件、Propred MHC class-Ⅱ binding peptide prediction-ProPred预测服务器EMBOSS软件,对上述蛋白的信号肽、MHC-Ⅱ类分子结合肽和B细胞表位进行分析.以人脐静脉内皮细胞株EVC-304为效应细胞,采用ELISA检测上述目的重组蛋白诱导人脐静脉内皮细胞EVC-304分泌IL-1、IL-8和TNF-α的作用.结果:在IPTG诱导下,所构建的原核表达系统可有效表达rOmpL1/1和rOmpL1/2、rLipL32/1和rLipL32/2、rLipL41/1和rLipL41/2,其产量分别约占细菌总蛋白的30%和15%、40%和35%、15%和10%.提纯后的目的重组蛋白SDS-PAGE后均仅见单一的蛋白条带.OmpL1s、LipL32/1和LipL32/2、LipL41s的信号肽分别位于N端1-24、1-21和1-24、1-24位氨基酸残基.OmpL1s、LipL32s和LipL41s分别有2、2和1个相同的主要MHC-Ⅱ结合肽和B细胞表位,其中OmpL1/2另有1个主要MHC-Ⅱ等位基因结合肽和B细胞表位(59-78).不同浓度的OmpL1s、LipL32s和LipL41s均可明显促进人静脉内皮细胞株EVC-304合成并分泌IL-1α、IL-8和TNF-α(P<0.05).其中IL-1α水平以作用24 h时最高,然后下降;IL-8和TNF-α水平则作用48 h高于24 h.结论:问号钩体ompL1/1、lipL32或lipL41不同基因型的表达产物均存在相似的MHC-Ⅱ类分子结合肽和B细胞表位.rOmpL1/1和OmpL1/2、LipL32/1和rLipL32/2、LipL41/1和rLipL41/2对EVC-304细胞均有直接的致炎作用.     

二硫键异构酶在脑缺血-再灌注损伤中的变化及其意义

目的 探讨脑组织二硫键异构酶（PDI）的变化在脑缺血－再灌注损伤（CIRI）中的意义。方法 制作Wistar大鼠动物模型，随机分为假手术对照组，缺血－再灌注组和重组人硫氧还蛋白酶（还原型rhTRX)治疗组，动态观察正常对照，实验对照和rhTRX治疗组血浆及脑组织一氧化氮（NO）水平，超氧化歧化酶（SOD）活性，脑组织二硫键异构酶（PDI）的变化。结果 脑缺血－再灌溉损伤时，血浆和脑组织NO水平，超氧化歧化酶（SOD）活性与缺血前比较明显下降（P＜0．05）。在rhTRX组,NO及SOD的代谢物明显增多（P＜0．01），rhTRX组与对照组相比较，PDI还原硫基（free-thiols)的细胞水平明显增加。结论 再灌注损伤中氧自由基与NO结合，使NO的减少，是脑损害的直接原因。而PDI通过降低氧自由基而达到保护和恢复NO的功能，防止过高的氧势对脑组织的损害。