OmpC-HBsAg'a'表位嵌合蛋白疫苗的构建表达及其对HBV转基因小鼠的免疫效果研究

目的:构建OmpC-HBsAg'a'表位嵌合蛋白疫苗来研究对HBV转基因小鼠的免疫效果.方法:将HBsAg'a'抗原决定簇主要肽段S-(124-147aa)插入到沙门氏菌外膜孔道蛋白OmpC第4 Loop区,并运用DsbA进行辅助二硫键形成,对HBV转基因小鼠免疫,激活固有免疫系统中的B-1细胞产生HBsAb.结果:H...     

沙门氏菌胞周蛋白二硫键异构酶DsbA对乙肝疫苗HBsAg‘a’表位构象的作用研究

目的：研究沙门氏菌胞周蛋白二硫键异构酶DsbA对乙肝疫苗HBsAg‘a’表位构象的形成作用。方法：将沙门氏菌胞周蛋白二硫键异构酶DsbA基因克隆于PET32b载体上,与乙肝疫苗HBsAg‘a’表位载体共转BL21菌,运用流式细胞仪和荧光显微镜观察HBsAg‘a’表位构象的形成。结果：在没有沙门氏菌胞周蛋白二硫键异构酶DsbA的情况下,HBsAg‘a’表位的正确表达率仅为29.73%,而在共转沙门氏菌胞周蛋白二硫键异构酶DsbA的BL21菌中,HBsAg‘a’表位的正确表达率上升至59.78%,较前提高了1倍。荧光显微镜观察发现加入β-二巯基乙醇破坏二硫键的形成后,DsbA辅助形成HBsAg‘a’表位的绿色荧光也随之消失。结论：沙门氏菌胞周蛋白二硫键异构酶DsbA能够有效促进原核细菌胞膜上HBsAg‘a’表位构象的正确形成。     

HBV基因疫苗诱导正常及HBV转基因小鼠产生体液免疫应答

目的:用乙型肝炎病毒(HBV)蛋白基因真核表达载体诱导正常小鼠及HBV转基因小鼠产生特异性体液免疫应答,以探讨其预防及治疗HBV慢性感染的可行性.方法:将HBV S2.S基因的真核表达载体pCMV-S2.S(PS)和相应的空载体pcDNA3.0分别免疫正常C57BL/6小鼠及同一品系HBV转基因小鼠(n=5).每只小鼠肌内注射纯化质粒100 μg.用ELISA方法检测小鼠血清抗HBs和抗preS2效价及HBV转基因小鼠血清HBsAg和HBeAg的水平.注射基因疫苗后第8周,活检取转基因小鼠肝脏组织,制备石蜡切片并行H-E染色,光镜下观察其病理改变.结果:PS诱导正常及转基因小鼠产生了抗HBs及抗preS2,并且抗preS2的出现早于抗HBs约1～2周.PS免疫8 周后,转基因小鼠血清HBsAg和HBeAg为阴性.注射基因疫苗后第8周病理检查转基因小鼠肝脏组织,肝细胞出现程度不同的广泛浊肿和水样变性,而相应的对照组无明显改变.免疫前后肝组织内单个核淋巴细胞数量无显著变化.结论:研究表明HBV中蛋白基因疫苗能够有效诱导HBsAg特异性的体液免疫应答,能够清除转基因小鼠血清中的HBsAg和HBeAg;初步的实验结果为研制治疗HBV慢性感染的基因疫苗提供了依据.     

人Tau基因多表位肽段原核表达载体的构建与表达

摘要：目的构建含人Tau多表位肽段基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达并纯化目的蛋白,检测Tau多表位DNA疫苗
免疫小鼠后特异性抗体产生情况。方法以质粒pVAX1-Tau 为模板,用PCR 扩增人Tau 多表位肽段基因,插入表达载体
pGEX-4T-2中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-TauP1/P2。将鉴定后的阳性重组质粒转入E.coli BL21（DE3）中,经异丙基-β-D-
硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达,并采用GST法纯化、SDS-PAGE鉴定目的蛋白的表达。以TauP1/P2 DNA疫苗免疫小鼠获
取血清,Dot-blot检测TauP1/P2特异性抗体产生情况。结果PCR扩增出约300 bp的基因片段,克隆至表达载体后,经酶切和测
序验证正确;获得了纯化的目的蛋白,并证实了GST-TauP1/P2融合蛋白的表达。Dot-blot检测到特异性TauP1/P2抗体的产生。
结论成功构建和表达人Tau多表位肽段基因的目的蛋白GST-TauP1/P2,能够识别Tau多表位DNA疫苗免疫后小鼠产生的特
异性TauP1/P2抗体。
     

人Tau基因多表位肽段原核表达载体的构建与表达

目的构建含人Tau多表位肽段基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达并纯化目的蛋白,检测Tau多表位DNA疫苗免疫小鼠后特异性抗体产生情况。方法以质粒pVAX1-Tau为模板,用PCR扩增人Tau多表位肽段基因,插入表达载体pGEX-4T-2中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-TauP1/P2。将鉴定后的阳性重组质粒转入E.coli BL21(DE3)中,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达,并采用GST法纯化、SDS-PAGE鉴定目的蛋白的表达。以TauP1/P2 DNA疫苗免疫小鼠获取血清,Dot-blot检测TauP1/P2特异性抗体产生情况。结果 PCR扩增出约300 bp的基因片段,克隆至表达载体后,经酶切和测序验证正确;获得了纯化的目的蛋白,并证实了GST-TauP1/P2融合蛋白的表达。Dot-blot检测到特异性TauP1/P2抗体的产生。结论成功构建和表达人Tau多表位肽段基因的目的蛋白GST-TauP1/P2,能够识别Tau多表位DNA疫苗免疫后小鼠产生的特异性TauP1/P2抗体。     

CpG ODN联合HBsAg免疫BALB/c小鼠和HBV转基因C57BL/6J小鼠

目的:探讨人工合成硫代修饰的含CpG基序的寡脱氧核苷酸(ODN)作为佐剂对HBsAg诱导BALB/c和HBV转基因小鼠产生免疫应答的影响. 方法: 用人工合成CpG ODN与血源HBsAg联合免疫BALB/c和HBV转基因C57BL/6J小鼠,采用ELISA方法观察小鼠血清HBsAg及抗-HBs水平,用ELISPOT方法判断CpG ODN对HBsAg免疫小鼠脾T淋巴细胞分泌细胞因子的影响. 结果: CpG ODN联合HBsAg免疫BALB/c小鼠较HBsAg单独注射组同期抗-HBs滴度明显提高,尤其在首次免疫后6、8、12 wk,2组比较差异显著(P<0.05),联合免疫较CpG ODN单独免疫自首次免疫后4 ～16 wk差异显著(P<0.05).与HBsAg,CpG ODN 单独免疫比较,联合免疫能使HBsAg特异性分泌IFN- γ T细胞分别增加3或9倍;CpG ODN,HBsAg联合免疫可诱导转基因小鼠产生抗-HBs,随时间延长,抗体滴度逐渐升高,并能使更多小鼠产生抗体,而单用HBsAg组、CpG ODN组均不能诱导抗-HBs的产生,免疫后各组血清HBsAg浓度较免疫前明显下降(P <0.05),但组间无明显差别(P>0.05),与HBsAg,CpG ODN 单独免疫比较,联合免疫能使HBsAg特异性分泌IFN- γ T细胞分别增加3或11倍. 结论: CpG ODN作为佐剂可增强HBsAg诱导BALB/c小鼠产生体液及细胞免疫应答,CpG ODN ,HBsAg联合免疫可打破HBV转基因小鼠对HBsAg免疫耐受,可望成为慢性乙型肝炎的有效预防和治疗性疫苗.     

含多抗原表位的嵌合SARS-CoV基因疫苗的构建和免疫原性研究

目的研制基于表位的SARS-CoV基因疫苗,为传统灭活或减毒疫苗提供有益的配伍选择。方法通过网络数据库结合生物软件分析的方法,确定可能在SARS-CoV感染过程中起重要作用并具较好抗原性参数的结构区域作为候选抗原表位,以密码子优化的方法提高表位串联蛋白的真核表达效率,构建了含多抗原表位的嵌合SARS-CoV基因疫苗。结果多表位串联基因接入真核表达载体后,可在真核细胞内高效表达。多表位嵌合SARS-CoV基因疫苗免疫小鼠后,可诱导融合蛋白特异的体液免疫反应。结论该基于多抗原表位的嵌合SARS-CoV基因疫苗可以诱导抗体应答,为该疫苗的深入研究奠定了基础。     

乙肝表面抗原疫苗对HBV转基因鼠细胞免疫和HBV影响的实验研究

目的：探讨不同剂量HBsAg疫苗，不同次数免疫对HBV转基因小鼠细胞免疫应答和HBV表达的影响。方法：不同剂量，不同次数HBsAg疫苗免疫小鼠后，用^1H-TdR掺入法，ELISA方法，免疫组化法和PCR法分别测定免疫鼠T淋巴细胞增殖能力，细胞培养上清中IL-2，IFN-γ及血清中HBsAg和HBVDNA含量。结果：较大剂量HBsAg疫苗反复免疫后，IL-2、IFN-γ显著增高（P均〈0．01），T淋巴细胞增殖能力显著增强（P〈0．05），血清HBsAg含量显著降低（P〈0．01）。并能抑制血清HBV DNA表达．结论：较大剂量HBV疫苗反复免疫可增强HBV感染者特异性细胞免疫应答，抑制HBV复制、表达．     

小鼠白细胞介素-21基因重组腺病毒可控制慢性HBV感染

目的 观察小鼠白细胞介素-21基因重组腺病毒(Ad-GFP-mIL-21)在慢性HBV感染小鼠中的表达以及其对病毒清除和HBV特异性抗体产生的作用.方法 Ad-GFP-mIL-21体外感染HepG2.2.15细胞后分别采用ELISA和Western blot检测上清和细胞mIL-21的表达;尾静脉注射rAAV8-1.3HBV至野生型C57BL/6小鼠体内建立HBV持续表达模型,12周后实验组尾静脉注射Ad-GFP-mIL-21,以注射空载GFP重组腺病毒或PBS为对照组,荧光显微镜观察Ad-GFP-mIL-21在小鼠体内各器官的表达情况,ELISA检测各组小鼠血清HBsAg、HBsAb、HBcAb和mIL-21的水平.结果 Ad-GFP-mIL21可在体外感染HepG2.2.15细胞,且上清mIL-21水平与重组载体的滴度和感染时间相关.注射Ad-GFP-mIL21至HBV持续表达小鼠后第4天观察到绿色荧光主要在肝细胞表达;与处理前相比,注射第4天血清mIL-21水平显著升高(P<0.05),而HBsAg滴度则明显下降;实验组和对照组小鼠在注射第13天血清HBsAb均为阴性;与对照组相比,实验组小鼠血清HBcAb水平显著升高(P<0.05).结论 Ad-GFP-mIL-21在HBV持续感染小鼠体内可表达mIL-21,并能下调血清HBsAg滴度和促进HBcAb产生,提示其在体内具有控制慢性HBV感染的作用.     

电穿孔法增强HBV DNA疫苗免疫效果的评价

目的: 评估电穿孔法3个主要变量（DNA剂量、接种部位和电压）对诱导Balb/c小鼠体液免疫应答的影响。方法:用能够表达荧光蛋白的荧光素酶质粒肌肉注射小鼠,通过荧光蛋白表达量的测定观察电穿孔法对肌肉细胞中抗原基因的转染效率和蛋白表达的影响。构建乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原(HBsAg)的DNA疫苗,电穿孔法接种疫苗,在DNA疫苗的剂量（0.5、5.0和50.0 μg)、接种部位（肌肉、皮内和皮下)及电穿孔所施加电压（0、36和60V）改变时,采用ELISA法检测HBV表面抗体(HBsAb),以观察小鼠体液免疫的变化。 结果：电穿孔能够加速抗原基因在小鼠体内的表达,荧光蛋白表达随电击电压的升高而增强（P<0.01）;5 μg荧光素酶质粒电穿孔所施加电压60V时荧光蛋白表达在7 d时达到最高。注射途径为皮内的电转染效果最佳。在电场作用下,电压36和60V时HBV DNA疫苗5.0 μg肌肉注射后产生抗体水平分别为22.4 和81.2　IU•mL^-1。结论: 电穿孔法可以有效提高HBV DNA疫苗的免疫原性。     

乙型肝炎病毒重组抗原表位检测敏感性研究

目的:在外源抗原表位表达载体系统中构建并表达乙型肝炎病毒(HBV)抗原表位,并对其诊断敏感性进行评价。方法:人工合成编码HBV“a”抗原决定簇表位中24个氨基酸(S124-147)的寡核苷酸序列,克隆入外源抗原表位表达载体系统FHV-RNA2-I3位点,构建重组质粒,在原核pET系统(BL21细胞)中表达。通过ELISA和West-ernblot检测表达产物的抗原性,并以表达产物为包被抗原,通过ELISA和Westernblot检测58份乙肝患者血清抗-HBs。结果:嵌和蛋白可与抗-HBs特异性结合,其ELISA检测抗-HBs阳性率为77.5%,Westernblot的为68%,而对照试剂盒的为62%。结论:在外源抗原表位表达系统中表达的HBV重组抗原表位具有良好的抗原性,有诊断应用价值。     

外源辅助T淋巴细胞表位影响HBV S基因DNA免疫的体液免疫应答

目的　探讨外源辅助T淋巴细胞 (HTL)表位对HBVS基因体液免疫应答的影响。方法选用 2种通用HTL表位 ,破伤风类毒素的氨基酸残基 (aa) 830 843片段 (TTE)和人工HTL表位(PADRE) ,以及 3种特异性HTL表位 ,结核杆菌热休克蛋白 6 5的aa1 2 0片段 (TBE)、风疹蛋白E2 4的aa5 4 6 5片段 (ME)和沙眼衣原体热休克蛋白 6 0的aa35 48片段 (CE) ,以单个表位或复合表位形式插入HBVS基因的翻译起始密码下游而构建成真核表达载体。 10 0 μg重组载体DNA免疫BALB/c小鼠 ,3周加强 1次 ,共 3次 ,第三次加强接种后 1月取血采用Abbott试剂盒检测抗 HBs。结果　HBVS基因真核表达载体pHB和 6种外源HTL表位HBVS基因真核表达载体pHB TBE、pHB PADRE、pHB TTE、pHB MTE2、pHB MTE3和pHB MTE5构建成功 ,DNA免疫的抗 HBs水平 (IU/L)分别为 10± 5 ,5± 5 ,49±7,2 9± 6 ,16± 8,2 3± 7和 2 8± 8。单个表位中 ,TTE和PADRE具有良好的免疫促进作用 ,而TBE无促进作用。复合表位均有不同程度的免疫增强作用。结论　部分外源HTL表位对HBVS基因的体液免疫应答有促进作用 ,复合表位中的单个表位间的促进作用无协同或迭加效果。表位PADRE可能用于新型高效乙肝疫苗的研制 ,而复合表位MTE5可能用于能克服人类白细胞抗原多态性的乙肝补种疫     

重组登革病毒1-4型包膜蛋白EDIII的融合表达和免疫学特性研究

目的：构建含登革病毒（DENV）1-4型包膜蛋白（E蛋白）EDIII区的融合蛋白,并通过动物实验分析该融合蛋白的免疫机制。方法：通过生物信息学分析获得具有广泛代表性的DENV 1-4型EDIII区的氨基酸序列;将编码DENV 1-4型EDIII区的基因序列通过GS linker进行串联后插入原核表达载体pColdIII的多克隆位点,并将构建的重组质粒pColdIII-EDIII转化至大肠杆菌BL21（DE3）;通过SDS-PAGE及Western blot法鉴定目的蛋白表达,采用镍柱亲和层析法纯化目的蛋白。将纯化的蛋白免疫BABL/c小鼠,初次免疫之后再加强免疫2次。通过ELISA法检测血清中的抗体效价和细胞因子的分泌情况来评价其免疫效应。结果：重组蛋白EDIII免疫小鼠后可以诱导产生高滴度的特异性抗体,抗体效价为1:40 000。抗原刺激小鼠脾淋巴细胞可以诱导Th1和Th2细胞免疫应答。结论：成功表达了含DENV 1-4型E蛋白EDIII的融合蛋白,并通过动物实验证实该融合蛋白能诱导小鼠产生特异性的体液和细胞免疫应答,为DENV四价重组疫苗的研制奠定了基础。     

基因转染Sp2/0细胞作为检测乙肝病毒基因疫苗细胞免疫效应的靶细胞的研究

目的研究乙型肝炎病毒(HBV)S基因转染的Sp2/0细胞作为检测HBV基因疫苗细胞免疫效应的靶细胞的可行性.方法以脂质体介导基因转染,含G418的培养基筛选,获得HBV基因S转染的Sp2/0细胞;构建编码HBV抗原蛋白S的重组真核表达质粒pCR3.1-S作为HBV基因疫苗;采用51Cr 4 h释放法体外检测HBV基因疫苗免疫接种小鼠的淋巴细胞杀伤功能.结果与空载体对照组相比较,HBV基因疫苗诱发Balb/c小鼠产生较好的HBV特异的细胞免疫应答(P＜0.05).结论以Sp2/0基因转染细胞作为靶细胞检测免疫BALB/c小鼠的淋巴细胞杀伤功能是可行的.     

乙肝核酸疫苗pCI/S2S接种小鼠后的免疫应答研究

目的 构建乙肝核酸疫苗pCI/S2S,研究其接种小鼠后,接种局部肌肉特异性抗原蛋白的表达以及所诱生的免疫应答反应.方法 从慢性乙肝患者的混合血清中制备HBV DNA模板,扩增出基因片段S2S,与pCI载体进行连接,得到重组质粒pCI/S2S.将其肌肉注射接种BALB/c小鼠,在不同的时间点检测血清中抗-HBs及抗-preS2;并于第12周时用细胞毒性检测试剂盒(LDH)检测体外细胞毒性T细胞(CTL)活性,同时以免疫组织化学法检测小鼠接种部位HBsAg的表达.结果 小鼠肌肉接种pCI/S2S完成后1周血清抗-HBs、抗-preS2开始阳转,阳转率于6周或8周达高峰,且能诱生特异性CTL应答.此外,免疫组织化学法能在小鼠的接种局部肌细胞中检测出目的抗原蛋白的表达.结论 乙肝核酸疫苗pCI/S2S接种小鼠后,能在小鼠体内诱生特异性的体液免疫和细胞免疫应答.     

单克隆抗体诱发乙肝转基因小鼠肝组织损伤

目的：诱导整合有乙型肝炎病毒（HBV）全基因组、无病理学反应的转基因小鼠产生病理学改变，建立研究急性肝炎发生机制及治疗药物筛选的转基因动物模型。方法：采用尾静脉注射方法将3种HBV单克隆抗体HBsAb、HBeAb、HBcAb分别或混合导入整合有HBV全基因组的转基因小鼠体内，使之与体内的抗原结合产生免疫学反应，随后进行血清学及常规病理学的研究。结果：3种单克隆抗体单独或混合处理均引起HBV转基因小鼠肝细胞的病理学损伤，以HBsAb及HBsAb HBcAb混合处理组损伤较为严重；但小鼠血清转氨酶基本表现正常。结论：体液免疫反应可以诱导HBV转基因小鼠组织细胞发生损伤，并产生与急性肝炎相似症状的病理学改变，HBsAb及HBsAb HBcAb处理的HBV转基因小鼠可以作为研究急性肝炎发生机制的动物模型。     

白细胞介素-12和白细胞介素-18质粒对HBcAgDNA疫苗诱导小鼠(H-2d)体液免疫应答的影响

目的：观察编码白细胞介素（IL）－12和IL－18的真核表达载体[pcDNA3.1/IL-12(以下简称IL－12质粒）和pcDNA3.1/IL-18(以下简称IL－18质粒）]对HBcAg DNA疫苗（pJW4303/HBc)诱导BalB/c(H-2^d)小鼠免疫应答的影响。方法：肌肉注射接种IL－12质粒、IL－18质粒和HBcAg DNA疫苗，ELISA法检测小鼠血清抗HBc IgG亚类（IgGl,IgG2a)水平。结果：免疫6周后，联合注射IL－12、IL－18和IL－12＋IL－18组小鼠血清的抗HBc终点滴度均明显高于单纯注射HBcAg DNA疫苗组小鼠（P＜0．05），抗HBc IgG亚类以IgG2a占优。结论：IL－12、IL－18以及IL－12＋IL－18联合HBcAg DNA疫苗注射能够提高小鼠血清中抗HBc水平。     

白细胞介素-2对乙型肝炎病毒基因疫苗免疫效应的影响

目的　构建表达乙型肝炎病毒 (HBV)S蛋白的重组质粒pCR3 .1 -S作为基因疫苗 ,观察重组人白细胞介素 - 2 (rhIL - 2 )作为佐剂对其诱导BALB/c小鼠产生免疫应答的影响。方法　以不同剂量IL - 2作为佐剂 ,生理盐水作为对照 ,测定不同免疫组的血清抗HBs、淋巴细胞增殖活性、淋巴细胞杀伤活性 ,比较不同免疫组间体液和细胞免疫应答的差异。结果　抗HBsELISA滴度 ,IL - 2组与对照组比较差异无显著性 (P >0 .0 5) ;淋巴细胞增殖指数、淋巴细胞杀伤率 ,IL - 2　 1 0 0 0U/ (只·次 )组、IL - 2　 2 0 0 0U/ (只·次 )组与对照组比较差异有显著性 (P <0 .0 5) ,而IL - 2　 50 0U/ (只·次 )组与对照组比较差异无显著性 (P >0 .0 5)。结论　一定剂量的IL - 2作为佐剂可增强HBV基因疫苗的免疫效应。     

禽流感病毒H5N1亚型基因工程疫苗设计、表达制备及动物实验研究

目的设计并获得一种安全、高效,并能对以H5N1亚型为主的多种禽流感病毒亚型产生保护的复合基因工程疫苗。方法利用分子生物学和分子免疫学方法对国内以及周边国家流行的禽流感毒株进行全面分析,利用生物信息学技术合理设计亚单位加表位的全新复合结构疫苗的氨基酸序列;利用大肠杆菌密码子优化技术根据疫苗氨基酸序列获得基因序列;通过全基因合成的方法获得该疫苗的基因,并通过大肠杆菌表达系统对该疫苗进行表达;目的蛋白经过包涵体洗涤和色谱纯化后复性;通过ELISA评价其抗原特异性,并乳化制备成禽流感蛋白疫苗,通过小鼠体内免疫试验检测其免疫效力。结果设计了包含通用性的辅助性T细胞表位、B细胞表位以及CTL表位的串接疫苗结构;全基因合成获得了该复合疫苗的基因序列;该基因在大肠杆菌表达系统中得到了高效表达,目的蛋白表达量约占菌体总蛋白30%;经过粗纯和精纯后的目的蛋白纯度达到95.5%,复性后获得可溶性蛋白溶液,浓度可达2.4 mg/mL。结论通过小鼠实验,验证了该H5N1亚型基因工程疫苗的抗原性,证实该基因工程疫苗在免疫小鼠体内激发体液免疫的同时调动了细胞免疫。小鼠免疫试验证明,该疫苗可以在小鼠体内有效诱发免疫应答。