人骨髓基质细胞协同外源性细胞因子对脐血CD34+细胞的体外扩增作用

目的探讨人骨髓基质细胞(hBMSC)协同以干细胞因子和FL为主的细胞因子对脐血CD34+细胞的体外扩增作用.方法采用免疫磁珠法分选脐血CD34+细胞,以SCF+IL-3+IL-6+FL+EPO组合高效扩增CD34+细胞[1],并结合该细胞因子组合接种到预先照射(20Gy)的hBMSC上,d10结束培养,收获细胞分别作细胞计数、集落培养和流式细胞术检测CD34+细胞数.结果本法获得的脐血CD34+细胞纯度较高(92±0.04)%,在hBMSC组培养的d2,造血细胞几乎都粘附到hBMSC上,随着培养时间的延长,CD34+细胞比例不断下降.hBMSC组与无hBMSC组相比,除细胞总数扩增倍数外,CFU-GM、BFU-E、CD34+细胞扩增倍数差异有显著性意义(P<0.05).结论①脐血来源的CD34+细胞粘附于滋养层上形成造血灶,且10d后造血细胞仍具有体外集落形成能力,表明骨髓基质细胞可支持并维系体外造血;②hBMSC协同外源性细胞因子可能是扩增造血干/祖细胞的较理想方案.     

培养条件对CD34~+细胞体外诱导分化和扩增红细胞的影响

目的观察培养基以及细胞接种密度对体外诱导CD34+细胞向红细胞增殖和分化的影响。方法将脐血来源的CD34+细胞用无血清培养基或含10%胎牛血清(FCS)的IMDM培养基培养(6孔培养板,3ml/孔),添加的细胞因子为100ng/ml干细胞因子(SCF)、5ng/ml白细胞介素3(IL-3)、3IU/ml促红细胞生成素(EPO),细胞初始接种密度为104/ml或105/ml,并通过间充质干细胞(MSC)的支持培养来诱导其向红系细胞扩增和分化。结果培养23d后,无血清培养基组细胞扩增倍数达到2.54×105倍,其中红系细胞>95%,而IMDM/5%FCS组的最大扩增倍数只有1.84×104倍,其中的红系细胞约占40%。培养8d后初始接种密度为104/ml的CD34+细胞增殖(420±40)倍,而105/ml的CD34+细胞增殖(162±45)倍。结论CD34+细胞在无血清培养基中的扩增倍数以及最终诱导出的红细胞,都明显高于在IMDM/10%FCS培养基中所占比例,104/ml的CD34+细胞接种密度比105/ml更有利于细胞的扩增。     

培养条件对体外诱导造血干/祖细胞向血小板定向增殖与分化的影响

目的观察3种不同培养基以及细胞接种密度对体外诱导造血干/祖细胞向血小板方向增殖和分化的影响。方法用添加干细胞因子(SCF)和促血小板生成素(TPO)等细胞因子的无血清培养基(StemSpan(SFEM和X-VIVO10)或IMDM/10%FBS来扩增脐血CD34+细胞向血小板定向分化,比较不同培养基的培养效果;CD34+细胞接种浓度为5×103/ml、104/ml和105/ml,比较不同接种浓度对扩增效果的影响。结果培养d 14、d 24和d 29时,StemSpan(SFEM培养基体系中细胞分别扩增了(11 000±577.35)、(196 666.67±14 529.66)和(176 666.67±8 819.17)倍,显著高于X-VIVO10和IMDM/10%FBS组,其中在d 24和d 29时,巨核系细胞所占比例分别是(54.57±2.32)%和(69.4±2.02)%,显著高于X-VIVO10和IMDM/10%FBS组。培养14 d后初始接种浓度为104/ml的CD34+细胞在StemSpan(SFEM培养基体系中扩增(11 000±577.35)倍,显著高于初始接种浓度为5×103/ml和105/ml组。结论和X-VIVO10和IMDM/10%FBS相比,StemSpan(SPEM培养基最有利于脐血CD34+细胞体外向血小板定向扩增和分化;104/ml的CD34+细胞接种密度最有利于细胞扩增和分化。     

转基因骨髓基质细胞对人脐血CD34+细胞体外扩增作用的研究

为探讨转染FL基因的人原代骨髓基质细胞对脐血CD34+ 细胞的体外扩增效应 ,建立了转基因骨髓基质细胞与人脐血CD34+ 细胞共培养体系。采用免疫磁珠法分离人脐血CD34+ 细胞 ,在不同的体外培养体系中进行培养并取样检测细胞总数 ,CFC和CD34+ 细胞百分率。结果表明 ,在不同组合的培养体系中 ,转基因骨髓基质细胞培养体系较骨髓基质细胞培养体系和无滋养层培养体系对有核细胞总数 ,CFC含量和CD34+ 细胞含量均具有明显的扩增作用 ,分别扩增了 12 2 .5± 4 .3,39.6± 2 .7和 11.8± 0 5 2倍 (P <0 .0 5 )。结论 :转染FL基因的人骨髓基质细胞协同其它细胞因子可增强对人脐血CD34+ 细胞的体外扩增作用。     

脐血间充质干细胞的生物学特征及其对造血干/祖细胞体外扩增的支持作用

目的探讨脐血间充质干细胞(MSC)的生物学特征及其对造血干/祖细胞体外扩增的支持作用。方法用液体培养法分离脐血贴壁细胞,采用ELISA方法检测贴壁细胞条件培养液中细胞因子的表达;用流式细胞术分析其免疫表型特征;在成软骨细胞诱导培养条件下诱导细胞分化,并用RTPCR方法检测分化后细胞原胶原Ⅱ型基因的表达。采用分阶段共培养方法观察脐血贴壁细胞对CD34+细胞体外扩增的支持作用。结果脐血单个核细胞纤维样细胞集落形成率为(3.5±0.7)/106。脐血MSC体外至少可以扩增15代。没有分化的脐血MSC表型为CD13、CD29、CD90、CD105、CD166、SH2、SH3和SH4阳性,CD45、CD34和CD14阴性;脐血MSC培养上清中干细胞因子、IL6和肿瘤坏死因子α检测阳性。在成软骨细胞诱导培养基培养条件下,脐血MSC原胶原Ⅱ型基因mRNA表达阳性。脐血MSC与CD34+细胞共掊养14d,CD34+细胞扩增率高于未共培养组4倍。结论脐血MSC具有类似于成体骨髓MSC的特征,对造血干细胞增殖有明显的支持作用。     

人骨髓基质细胞促进脐血CD34+细胞的体外扩增和对NOD/SCID小鼠的植入

目的 研究人骨髓基质细胞(MSC)促进脐血CD34+细胞体外扩增及植入能力的作用.方法 分离、培养正常人的MSC作为滋养层细胞.在TPO、SCF、FL和G-CSF刺激下,比较有、无MSC滋养层细胞对扩增脐血CD34+细胞后,CD34+细胞和CFU数的增加倍数,以及植入非肥胖性糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠的能力.结果 以骨髓MSC为滋养层细胞的培养体系可以更加有效地扩增脐血CD34+细胞.体外扩增1周总细胞数(TNC)、CD34+细胞和CFU的均数分别增加111.6、19.3和58.0倍;体外扩增2周后TNC、CD34+细胞和CFU的均数分别增加532.8、41.3和563.5倍.脐血细胞输入NOD/SCID小鼠6周后,移植未扩增脐血细胞的对照组小鼠骨髓细胞中人CD45+细胞比例仅为1.2%～3.7%;移植单纯细胞因子刺激扩增组小鼠骨髓中,人CD45+细胞比例为7.6%～12.1%;以MSC为滋养层扩增的脐血细胞移植组,人CD45+细胞比例达到45.3%～59.1%.结论 以人骨髓MSC为作为饲养层细胞,不但可以更加有效扩增脐血CD34+细胞,而且可以促进脐血细胞植入NOD/SCID小鼠的能力,有潜在的临床应用价值.     

Tpo、IL-11基因修饰的基质细胞对CD34+CD38-早期造血祖细胞扩增的影响

目的　观察经Tpo、IL 11基因修饰的基质细胞对脐血CD3 4 + CD3 8-细胞体外扩增的影响。方法　用载有Tpo、IL 11基因的重组逆转录病毒感染成纤维样基质细胞HFCL ,通过Northernblot法检测基因修饰的HFCL细胞Tpo、IL 11基因的表达。以未经基因修饰的HFCL细胞作为对照 ,将脐血CD3 4 + 造血干 /祖细胞在这种基因修饰的HFCL细胞支持下 ,进行 7d体外扩增后 ,用锥虫蓝拒染法计数活细胞总数 ,并用流式细胞仪分析扩增细胞中CD3 4 + 细胞以及CD3 4 + CD3 8-细胞的比例。结果　在Tpo基因修饰的HFCL细胞、IL 11基因修饰的HFCL细胞和Tpo +IL 11基因共同修饰的HFCL细胞的支持下 ,扩增后CD3 4 + CD3 8-早期造血祖细胞的比例分别为 (1.8± 0 .2 4 ) %、(1.6 2± 0 .2 3) %、(2 .4 5±0 2 8) % ,细胞扩增倍数为 4 .2倍、3.6倍、6 .9倍 ,高于对照组的 (0 .80± 0 .2 3) %和 1.5倍 ,同时扩增细胞总数和CD3 4 + 细胞比例亦高于未经基因修饰的HFCL细胞所支持的扩增体系。结论　Tpo、IL 11基因修饰的基质细胞可有效促进脐血CD3 4 + 造血干 /祖细胞体外扩增 ,同时能有效维持扩增体系中的CD3 4 + CD3 8-细胞以及促进其扩增。     

人胎盘源贴壁细胞支持脐血CD34+细胞体外扩增

从胎盘中分离培养人胎盘源贴壁细胞 (humanplacentaderivedadherentcells,hPDAC) ,研究其对脐血CD34+细胞体外扩增作用。以酶消化法自人胎盘组织中分离培养hPDAC ,并以流式细胞术对其进行鉴定。进一步 ,采用免疫磁珠法分离人脐血CD34+细胞 ,建立以hPDAC为滋养层的CD34+细胞体外扩增培养体系 ,并与无滋养层的液体培养体系相比 ,观察不同培养体系对有核细胞总数、CFC及CD34+细胞百分率的影响。结果表明 ,人胎盘组织中可分离培养出hPDAC ,并证实其为混合性细胞群体 ,主要含有间充质细胞。以hPDAC为滋养层的共培养体系较无滋养层液体培养体系对有核细胞总数、CFC及CD34+细胞均具有明显的扩增效应 ,其中以SCF +IL 3+IL 6 +FL +hPDAC组扩增效果最强 ,分别扩增了 ( 12 6 .0± 6 .7)倍 ,( 4 9.8± 1.7)倍和 ( 8.3± 1.6 5 )倍。上述结果提示 ,hPDAC具有体外支持造血作用 ,并提供了一与脐血CD34+细胞体外扩增相适应的新滋养层。     

两步法扩增诱导脐血及动员外周血CD34+细胞来源树突状细胞的比较

为了比较先扩增、后诱导的两步法从脐血(CB)CD34+细胞和动员外周血(MPB)CD34+细胞诱导所得DC的产量及功能,将免疫磁珠分选获得的CB-CD34+细胞和MPB-CD34+细胞用FL、TPO、SCF、GM-CSF等细胞因子先扩增10天,然后加入GM-CSF、IL-4及TNF-α、CD40Ab、PGE2等细胞因子组合诱导获得DC.采用流式细胞仪检测DC表型,混合淋巴细胞培养检测DC刺激异基因T细胞增殖能力,ELISA法检测DC分泌IL-12能力,Transwell板检测DC在次级淋巴组织趋化因子(SLC)介导下的趋化功能.结果表明 ①扩增10天时CB组、MPB组细胞中CD14+CD1a-细胞含量无显著差异[(40.48±16.85)% vs (28.07±23.19)%, P＞0.05].但由于CB组细胞扩增倍数显著高于MPB组(388.88±84.63倍vs 79.67±10.32倍, P＜0.01),CB组CD14+CD1a-细胞扩增倍数显著高于MPB组(189.42±25.02倍vs 28.74±23.27倍, P＜0.01); ②TNF-α/CD40Ab/PGE2条件下与TNF-α条件下相比,CB组和MPB组所得DC均表达更高的CD83[分别为(34.52±11.22)% vs (3.70±2.27)%、(36.69±13.36)% vs (7.34±3.364)%, P均＜0.01]; ③CB组与MPB组在TNF-α/CD40Ab/PGE2诱导条件下所得DC均高水平表达CD83、CD86、HLA-DR、CD11c、CD54、CD40,CB组所得CD83+细胞的扩增倍数显著高于MPB组(198.72±117.53倍vs 33.95±6.19倍,P＜0.01); ④CD40Ab/PGE2/TNF-α条件下CB与MPB来源的DC在刺激异基因T细胞增殖、IL-12的分泌[(16.2±4.31)pg/ml vs (13.5±4.1)pg/ml]以及SLC介导的迁移率[(28.09±7.76)% vs (18.5±3.47)%]上均无显著差别(P均＞0.05).结论 在两步法培养体系下,CB-CD34+细胞与MPB-CD34+细胞来源的DC具有相同的功能,而前者产量显著高于后者.     

人骨髓基质细胞协同外源性细胞因子对脐血CD34+细胞的体外扩增作用

目的　探讨人骨髓基质细胞 (hBMSC)协同以干细胞因子和FL为主的细胞因子对脐血CD3 4 + 细胞的体外扩增作用。方法　采用免疫磁珠法分选脐血CD3 4 + 细胞 ,以SCF +IL 3+IL 6 +FL +EPO组合高效扩增CD3 4 +细胞[1] ,并结合该细胞因子组合接种到预先照射 (2 0Gy)的hBMSC上 ,d10结束培养 ,收获细胞分别作细胞计数、集落培养和流式细胞术检测CD3 4 + 细胞数。结果　本法获得的脐血CD3 4 + 细胞纯度较高 (92± 0 .0 4 ) % ,在hBMSC组培养的d2 ,造血细胞几乎都粘附到hBMSC上 ,随着培养时间的延长 ,CD3 4 + 细胞比例不断下降。hBMSC组与无hBMSC组相比 ,除细胞总数扩增倍数外 ,CFU GM、BFU E、CD3 4 + 细胞扩增倍数差异有显著性意义 (P <0 .0 5 )。结论　①脐血来源的CD3 4 + 细胞粘附于滋养层上形成造血灶 ,且 10d后造血细胞仍具有体外集落形成能力 ,表明骨髓基质细胞可支持并维系体外造血 ;②hBMSC协同外源性细胞因子可能是扩增造血干 /祖细胞的较理想方案     

人胎盘组织源造血干/祖细胞的初步研究

为了探讨足月胎盘组织源单个核细胞(human mature placenta tissue-derived mononuclear cells,hPTMNC)中CD34+细胞的体外增殖、分化能力,寻找新的造血干/祖细胞来源供临床应用,分别采用流式细胞术检测、造血干/祖细胞集落培养和体外无细胞因子长期培养的方法,测定胎盘组织源和脐血中的CD34+细胞及其亚群和集落形成单位的数量。结果表明:胎盘组织源CD34+细胞(2.74±0.61%)及其亚群CD34+/CD38-细胞(2.46±0.42%)、造血干/祖细胞集落CFU-GM(186.90±24.52)和BFU-E(101.40±13.35)水平都较脐血CD34+细胞(1.73±0·32%)、CD34+/CD38-细胞(0.80±0.25%)、CFU-GM(136.90±25.15)、BFU-E(49.20±8.13)高;前者在体外无细胞因子培养条件下存活时间长,且细胞数量增加约2倍。结论:胎盘是胎儿期的造血器官,胎盘细胞成分更幼稚,是一种造血干/祖细胞移植的新的种子细胞。     

人参总皂甙协同造血生长因子体外诱导CD34+造血干/祖细胞扩增与分化的作用

为探讨人参总皂甙(total saponins of panax ginseng,TSPG)协同造血生长因子体外诱导CD34+造血干/祖细胞(HSC/HPC)扩增与分化的作用,收集人脐血、骨髓细胞并采用StemsepTM干细胞分选系统分离纯化CD34+HSC/HPC,用不同剂量TSPG加入不同组合的造血生长因子进行培养,检测细胞总数、CD34+细胞和CD33+细胞比例及集落形成细胞总数(CFC)、粒系祖细胞(CFU-GM)数量变化.结果显示10-70μg/ml TSPG均可不同程度地提高脐血细胞总数、CFC数和CD34+细胞数,50μg/ml是最佳刺激浓度,可使细胞总数、CFC数和CD34+细胞数分别增至(2470.5±79.96)×103、(53.96±4.29)×100%和(21.86±3.09)×100%;20μg/ml是液体培养诱导骨髓CD34+细胞向粒系分化的最佳浓度,可使细胞总数、CFU-GM和CD33+细胞分别增至(133.2±9.03)×103、(26.78±1.91)×100%和(16.98±1.73)×100%;甲基纤维素半固体培养检测显示,TSPG(10-50μg/ml)均能提高CD34+细胞形成CFU-GM的集落产率,以TSPG 20μg/ml效果最为明显.结论合适剂量的TSPG能够促进CD34+造血干/祖细胞体外扩增与定向诱导分化.     

脐血CD34^＋细胞体外扩增脐血巨核祖细胞的研究

本研究探讨人脐血CD34^＋细胞体外扩增的巨核祖细胞的生物学特性及其免疫原性变化，为体外扩增脐血巨核祖细胞的临床应用提供实验依据。采用Ficoll-Hapaque分离法分离人脐血单个核细胞，应用免疫磁珠法（MACS）再分离富集CD34^＋细胞，在含血小板生成素（TPO，50ng／ml）、白介素-1]（IL—11，50ng／ml）和肝素（25U／ml）的无血清液体培养体系中培养14天。用流式细胞术检测扩增产物免疫表型（CD34^＋、CD41a^＋、CD61^＋、CD34^＋CD41a^＋及CD34^＋CD61^＋）、巨核细胞凋亡率及其表面HLA Ⅰ、Ⅱ类分子的表达，并进行巨核细胞集落形成单位（CFU—Mk）的检测。结果显示：脐血CD34^＋细胞能够有效地向巨核细胞分化，CD41a^＋和CD61^＋细胞比例在培养第14天达到峰值，CD34^＋CD41^＋和CD34^＋CD61^＋细胞比例在扩增第7天达到最高峰[分别为（3．41±2．80）％和（1．89±1．43）％]；CFU—Mk大集落在扩增第7天达到高峰（（20．66±32．79）倍]，小集落在扩增第10天达到高峰[（435．62±482．65）倍]；在培养7、10和14天时巨核细胞的凋亡率分别为（19．48±9．64）％、（26．87±9．03）％和（52．46±11．74）％，其中培养7天和10天的凋亡率无显著性差异（P〉0．05），培养14天的凋亡率显著高于7天和10天（P均〈0．05）；巨核细胞表面HLA Ⅰ、Ⅱ类分子的表达随着扩增天数的延长逐渐降低，其中培养0到10天阶段下降明显．结论：采用TPO＋IL 11＋肝素组合．可以有效地扩增脐血巨核祖细胞；培养7天，CFU—Mk大集落扩增倍数、CD34^＋CD41^＋和CD34^＋CD61^＋细胞比例均达高峰，这是巨核祖细胞体外扩增的较佳培养时间。     

间充质干细胞对脐血CD34^＋细胞扩增及其细胞特性变化的影响

本研究探讨脐带间充质干细胞（MSC）对CD34^＋细胞（HSPC）体外扩增的支持作用及对CD34^＋细胞表面标志、归巢黏附分子、集落形成能力等干细胞特征变化的影响。用免疫磁珠法从新鲜分离的脐血单个核细胞分离CD34^＋造血干祖细胞（HSPC）；用MSC饲养层（feeder）制备经^137Cs照射的间充质干细胞饲养细胞（MSC feeder cells）。将CD34^＋细胞接种在不同的培养体系中，实验分为3组：HSPC＋CK组为培养液中加入细胞因子组合（SCF、FL和TPO），HSPC＋MSC组为CD34^＋细胞接种在MSC feeder上，HSPC＋MSC＋CK组同时加入细胞因子组合及MSC饲养细胞。培养后4、7、10、14天计数有核细胞总数（MNC），计算细胞扩增情况；用流式细胞术检测不同处理组间CD34^＋细胞及亚群免疫表型、归巢黏附分子和集落形成能力。结果表明：在2周的培养时间里，3组MNC和CD34^＋细胞均明显增加，MNC扩增数依次HSPC＋MSC＋CK组〉HSPC＋CK组〉HSPC＋MSC组。体外扩增10天内HSPC＋MSC＋CK组MNC得到大量的扩增，同时CD34^＋细胞的扩增亦较高。培养4天3组细胞CD34^＋比例较0天有明显下降（P〈0．01）；扩增后CD34^＋细胞比例：HSPC＋MSC组〉HSPC＋MSC＋CK组〉HSPC＋CK组（P〈0．01）；各组CD34^＋细胞亚型细胞比例有所不同，HSPC＋CK组4天时CD34^＋CD38^-细胞有一过性升高（62．71％），之后迅速降低，7天时为0．05％；HSPC＋MSC组7天时CD34^＋CD38^-细胞比例为18．92％，与HSPC＋CK组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。从集落形成分析结果看出：MSC、细胞因子混合组扩增后细胞集落形成能力在不同时间点均维持在较高水平。结论：脐血CD34^＋细胞在体外短期培养（〈7天）下，MSC和细胞因子联合应用能同时使CD34^＋细胞得到明显的扩增并维持造血干祖细胞的生物学特征。     

人脐血CD133+细胞体外短期培养中生物学特性的变化

为了解脐血CD133+细胞的生物学特性及其在体外短期扩增培养中的变化 ,探讨其体外扩增的可行性 ,初步观察了脐血CD133+细胞的免疫表型、细胞周期、端粒酶活性以及粘附分子的表达等生物学特性及其在体外扩增中的动态变化并与CD34+细胞进行比较。结果显示 ,新鲜脐血CD133+和CD34+细胞的含量分别为 ( 1.0 5±0 73) %和 ( 1.4 0± 0 .5 6 ) % ,CD34+细胞中 79.6 2 %为CD133+CD34+细胞 ,而CD133+细胞中 97%以上为CD133+CD34+细胞。短期扩增培养结果显示 ,CD133+细胞组扩增第 10天 ,CD133+,CD133+CD34+和CD34+CD38-细胞以及第 6天的CFU mix ,HPP CFC和CD34+CD38-细胞的扩增倍数要高于CD34+细胞组 ( P <0 .0 5 ) ;扩增中 ,CD133+CD34+细胞的比例逐渐下降 ,而CD133-CD34+和CD133-CD34-细胞的比例则逐渐上升。新鲜脐血CD133+和CD34+细胞的端粒酶活性较低 ,但高于CD34-细胞。扩增 1周后 ,端粒酶活性明显上调 ,15天以后又逐渐下降 ;90 %以上脐血CD133+细胞表达CD11a ,CD4 9d和CD5 4 ,约 5 0 %表达CD6 2L。扩增早期 ,CD4 9d表达上调 ,CD11a表达无明显变化 ,而CD5 4和CD6 2L则有下调趋势 ,随着扩增时间的延长 ,各种粘附分子的表达均有不同程度的下调。在整个扩增过程中 ,大部分CD34+细胞仍然表达CD11a,CD4 9d和CD5 4     

脐血造血干/祖细胞表面CD95/Fas抗原和Bcl-2的表达和功能研究

对人脐血干 /祖细胞表面CD95 /Fas抗原及Bcl 2的表达和功能特征进行了研究。新鲜分离的脐血CD34+细胞表达低水平CD95 ,体外培养中联合应用细胞因子如SCF和FL可上调CD95表达 ,负调控因子例如肿瘤坏死因子 α(TNF α)和干扰素 γ(IFN γ)可进一步增加其表达量。将CD34+ 细胞与抗 CD95单克隆抗体共同孵育 ,通过活细胞记数、流式细胞术、集落形成细胞 (CFU C)及长期培养启动细胞 (LTC IC)的分析 ,研究了CD95介导的功能特性。抗 CD95单抗与TNF α或IFN γ组合条件下 ,活细胞记数和CFU C计数分别为 31.9± 11.2和 4 3± 2 .0 ,LTC IC生成受到抑制 ,细胞凋亡率为 4 2 .9± 12 .4。而抗 CD95单抗在无细胞因子存在条件下或抗 CD95单抗与早期效应细胞因子SCF和FL组合条件下诱导的凋亡率很低。细胞浆内增加的Bcl 2水平和脐血CD34+ 细胞表面CD95的关系表明Bcl 2可能对CD95介导的CD34+ 细胞的凋亡起保护作用。     

人胎盘组织造血干/祖细胞的分离富集

为了探索从胎盘组织中分离富集造血干/祖细胞(HSPC)的标化流程,采用机械法加胶原酶消化法制备人胎盘组织单个细胞悬液,用羟乙基淀粉(6%HES)法从中分离出单个核细胞(MNC),再经免疫磁珠分选法分选出CD34-、CD34+CD38-、CD34+CD38+3个细胞亚群,用流式细胞术对各阶段分选细胞进行表型分析并计算分选细胞的富集度和回收率。结果表明:机械法加胶原酶消化法制备的人胎盘组织单个细胞悬液中单个核细胞(MNC)数达(12.30±3.51)×108,与脐血初始样品所含的MNC数(8.86±5.38)×108比较差异无统计学意义,而其CD34+细胞所占百分率[(3.93±2.31)%]则明显高于脐血[(0.44±0.29)%]。胎盘组织单个细胞悬液经6%HES分离后MNC和CD34+细胞的回收率分别为(45.3±11.7)%和(51.1±9.8)%;MNC经免疫磁珠分选后,其CD34+细胞的纯度和回收率分别为(73.4±14.1)%和(52.7±11.7)%。结论:本实验所建立的"机械法加胶原酶消化法-HES分离MNC-MACS分选目标细胞"的分离纯化方法可从胎盘组织获得高丰度、高富集度、高活性的HSPC,为进一步研究胎盘HSPC提供了比较经济、效果较好的分离富集方案。     

人参二醇促骨髓CD34+细胞增殖和分化的研究

本研究探讨人参二醇（PDS）对正常人骨髓CD34^＋细胞的促进增殖和诱导分化作用。用吸附单克隆抗体的免疫磁珠技术从正常人骨髓分离出CD34^＋细胞,采用琼脂半固体多向祖细胞集落（CFU-Mix）培养方法观察PDS对CD34^＋细胞的增殖作用;用液体培养使CD34^＋细胞增殖,并向红系、粒系定向生长,用流式细胞仪分析PDS诱导后细胞表面标记变化。结果显示：免疫磁珠分离CD34^＋细胞的获得率占骨髓有核细胞（MNC）的（1.0±0.15）%;活细胞比例占（95.6±1.2）%,CD34^＋细胞富集度达（86.8±2.8）%。中浓度PDS（25mg/L）能够有效地促进CD34^＋细胞增殖,生成CFU-Mix集落,提高率为（56.3±3.5）%,与对照相比较有显著差异（p〈0.01）。液体培养生成粒系、红系细胞的数量明显增高,与对照相比差异有显著性,提高率分别为（35.6±3.2）%和（22.3±2.1）%,与对照相比差异有显著性（p〈0.01）,且呈剂量依赖性。经PDS诱导14天后,细胞表面分化标记明显增高,CD33^＋细胞在PDS50mg/L时最高,CD71^＋细胞在25mg/L时最高,G-A^＋细胞在10mg/L时最高,而CD15^＋细胞数量无明显变化。结论：PDS不但促进CD34^＋细胞增殖,且能诱导其定向分化,提示PDS具有类似造血生长因子和协同生长因子的效应。