HA20-lys10在大肠埃希菌中的融合表达纯化和凝胶阻滞试验

目的表达和纯化流感病毒血凝素HA2氨基末端20个氨基酸与10个赖氨酸的融合蛋白HA20-lys10,并观察其与质粒结合的能力.方法用PCR方法构建流感病毒血凝素HA2氨基末端20个氨基酸与10个赖氨酸的融合基因HA20-lys10,并克隆于pET32a(+)原核表达载体.将重组表达质粒pET-HA-K转化大肠埃希菌BL21(DE3),当A(Abs)600nm达到0.6时,加入终浓度为1 mmol/L IPIG诱导目的蛋白的表达.表达产物用亲和层析一步法进行纯化,然后用凝胶阻滞试验观察重组蛋白结合质粒的能力.结果IPTG诱导后可获得相对分子质量约为27 000的目的蛋白,表达蛋白以可溶形式存在,占菌体蛋白20%以上.表达菌超声后,表达产物经亲和层析一步纯化后可获得纯度达85%以上目的蛋白.凝胶阻滞试验发现,纯化的重组蛋白在一定条件下可以与质粒结合,使质粒的迁移率明显改变.结论融合蛋白HA20-lys10有望用于受体介导基因转移,以提高基因转移的效率.     

牛乳铁蛋白素基因及其突变基因在大肠埃希菌中的融合表达

目的构建牛乳铁蛋白素基因（LfcinB）及牛乳铁蛋白素突变基因（mLfcinB）的表达载体,建立在大肠埃希菌中融合表达的方法。方法依据大肠埃希菌偏爱密码子设计LfcinB和mLfcinB,进行克隆扩增并测序,构建LfcinB和mLfcinB的融合表达载体并转化人大肠埃希菌,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,产物经谷胱甘肽-琼脂糖凝胶法纯化。结果成功构建了融合表达载体pGEX-4T-1-LfcinB和pGEX-4T-1-mLfcinB,表达载体转化大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导3h后LfcinB和mLfcinB融合蛋白表达率约为30％,洗脱纯化后产物约为60％。聚丙烯酰氨凝胶电泳显示融合蛋白为29kDa,主要以包涵体形式存在,谷胱甘肽-琼脂糖凝胶纯化后得到3．1kDa的目的蛋白。结论LfcinB及其突变基因在大肠埃希菌中的融合表达可提高LfcinB的表达率。     

大肠埃希菌qnrA基因的检测

[目的]了解大连地区耐环丙沙星的大肠埃希菌中qnrA基因的流行情况并研究其耐药机制。[方法]收集临床分离的耐环丙沙星的大肠埃希菌213株,通过PCR法扩增qnrA基因,对qnrA基因阳性株,KB纸片法检测抗菌药的体外抗菌活性,琼脂稀释法测MIC,并进行质粒结合试验。[结果]213株菌中查到2株qnrA阳性菌株,测序结果与Genbank中qnrA基因比对吻合率达100%。其中一株对多种抗菌药耐药,另一株则比较敏感。[结论]大连地区检测到了qnrA基因阳性的菌株,耐药机制复杂,应引起临床重视。     

78份尿液标本大肠埃希菌药敏试验分析

目的:研究尿路感染中大肠杆菌的药敏试验和临床意义。方法:对78份尿液标本菌落计数>105CFU ml的大肠埃希菌,采用 微量稀释法对该菌进行药敏测试,并采用纸片扩散法确认试验进行超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)检测。结果:大肠埃希菌对阿莫西林、替卡西 林、哌拉西林、复方磺胺、头孢噻吩和环丙沙星的耐药率分别为88%、87%、85%、77%、74%和73%,与此同时对亚胺培南、头孢他啶、派拉西林 他唑巴坦、阿米卡星的敏感率分别高达100%、83%、82%、80%。同时检出产ESBLs大肠埃希菌35株(约占45%),表现为多重耐药。结论: 大肠埃希菌检出率高,产ESBLs率高,其在尿路感染中占有非常重要的地位,常规检测ESBLs有助于合理选用抗生素,降低耐药菌株产生。     

大肠埃希菌的药敏结果分析

目的 分析大肠埃希菌的分布及药敏情况,指导临床合理用药.方法 分析临床分离的106株大肠埃希菌的分布及药敏结果.结果 大肠埃希菌主要在中段尿中检出,对亚胺培南、厄他培南、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦敏感率较高,对头孢类抗生素耐药率较高.结论 大肠埃希菌对多种抗生素的耐药率较高,应引起足够重视.     

大肠埃希菌的生物学特性及药敏分析

<正> 大肠埃希菌是埃希菌属中最常见的临床分离菌,也是泌尿系感染的常见菌,在自然界分布广泛,属条件致病菌。笔者自2000年2月至2001年1月从各种临床标本中分离出311株大肠埃希菌,现将生物学特性及药敏分析报告如下。 1.材料与方法 1·1 菌株来源 311株大肠埃希菌均来自本院门诊     

尿路致病性大肠埃希菌和宿主膀胱防御反应的相互作用

尿路致病性大肠埃希菌（uropathogenic Escherichia coli,UPEC)是大部分尿路感染的病原菌,大多数UPEC表面具有纤毛状的粘附器官-1型菌毛,1型菌毛介导细菌与膀胱上皮细胞接触,且侵入其中,UPEC侵入细胞后获得一个保护性环境,或在其中繁殖,或处于静止潜伏状态,具1型菌毛的UPEC侵入细胞引发了宿主的一系列反应;细胞激酶的产生,炎症反应和受感染膀胱上皮细胞的片状脱落,宿主反应和抗生素治疗虽能有效清除尿中细菌,但致病菌可顽固地存在于膀胱组织中,从而成为复发性尿路感染的难治根源。     

产ESBLS大肠埃希菌和克雷伯菌的耐药性分析

目的对产ESBLS大肠埃希菌和克雷伯菌在临床交叉感染的耐药性分析。方法采用法国生物梅里埃API鉴定系统分离鉴定,药敏试验采用k-B纸片扩散法。结果大肠埃希菌106株产ESPBS大肠埃希菌10株,克雷伯菌110株产ESBLS克雷伯菌菌株13株。结论产ESBLS大肠埃希菌和克雷伯菌体外药敏试验对三代头孢均敏感,而体内治疗是无效的,实验室应给临床报告耐药。     

大肠埃希菌在泌尿系感染中的评价

目的通过分析本院住院及门诊患者泌尿系感染大肠埃希菌的检出率及耐药情况,评价大肠埃希菌在泌尿系感染中的地位,为临床治疗与控制绝大部分的泌尿系感染、合理用药提供理论依据。方法收集2010年5月—2013年4月住院及门诊疑似泌尿系感染患者标本322份进行细菌培养,筛选其中主要致病菌大肠埃希菌,用K-B法做药敏试验。结果 322份尿液培养标本中共分离出致病菌170株,阳性率为52.80%,其中分离出的大肠埃希菌77株,占阳性标本的45.29%,77株大肠埃希菌中产超广谱β-内酰胺酶菌株共有35株,占45.5%,77株大肠埃希菌对亚胺培南、美罗培南敏感率为100.0%,对呋喃妥因敏感率为91.42%,头孢哌酮/舒巴坦的敏感率为86.67%,哌拉西林/他唑巴坦敏感率为78.87%。结论尿液培养标本中大肠埃希菌为主要致病菌,其细菌多重耐药和交叉耐药日趋严重,目前在治疗大肠埃希菌引起的泌尿系感染时可首选β-内酰胺类/β-内酰胺酶抑制剂进行治疗,对于危重患者则宜选用碳青霉烯类(如亚胺培南和美罗培南),其次是呋喃妥因,同时应加强标本送检,根据药敏试验合理选择敏感的抗生素。     

G蛋白偶联受体激酶5在大肠杆菌中的表达纯化

通过RT-PCR扩增得到了人G蛋白偶联受体激酶5(GProtein-coupledreceptorki-nase,GPK5)的基因,将其克隆到表达载体pET-28a中,并将该质粒转入大肠杆菌BL21(DE3),在10μmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPIG)诱导培养下表达,通过分离纯化,得到部分纯化的GRK5蛋白。体外活性测定表明,纯化后的GPK5能够特异性地磷酸化视紫红质。动力学常数Km=4.3μmol/L,Vmax=25nmol/(mg·min),与文献报道的从真核表达系统中纯化得到的GRK5相近。     

CGGBPl蛋白在大肠杆菌中的表达及其纯化

目的：对人CGGBPl蛋白进行原核表达及纯化，为进一步研究CGGBPl的生物功能奠定基础．方法：构建原核表达载体pRSETA／CGGBPl．在大肠杆菌BL21中诱导表达人CGGBPl蛋白，经Ni^2＋-NTA亲和层析纯化，利用链酶亲和素磁珠鉴定所表达纯化的蛋白能否和d（CC．G）29重复序列双链DNA特异性结合．结果：诱导后表达得到CGGBPl蛋白，纯化得到的可溶性表达产物CGGBPl蛋白可以和d（CGG）29重复序列双链DNA特异性结合．结论：表达并纯化得到可溶性CGGBPl蛋白，为进一步研究CGGBPl的结构与功能奠定了必要的基础．     

人白细胞介素2基因在大肠杆菌中表达水平的提高及产物初步纯化

利用双Tac启动子和改造后的人白细胞介素2（IL－2）cDNA，提高了IL－2在大肠杆菌（E．Coli）中的表达水平，并经包涵体制备、分子重新折叠及分子筛层析等技术，对表达的IL－2进行了提取、活性恢复与纯化，纯度可达95％。本工作为用基因工程方法生产人IL－2积累了经验。     

CEA单链抗体表达质粒构建及产物纯化

目的单链抗体基因的构建并在大肠杆菌中进行表达以及表达产物的纯化研究。　方法采用重组PCR技术将已获得的抗癌胚抗原 (CEA)鼠源单克隆抗体E7B10 重、轻链可变区基因 (VH、Vk)经 (Gly4 Ser) 3 编码的寡核苷酸拼接成单链抗体基因 ,并在大肠杆菌中表达了单链抗体C端融合 6×His蛋白 ,表达产物经Ni2 -IDASepharose 6B亲和柱纯化。　 结果表达的融合蛋白在胞内主要以可溶性存在 ,其表达量达到菌体总蛋白的 10 % ,SDS -PAGE和Western印迹图谱显示表达产物分子量为 2 7kd ,与其基因编码蛋白的理论推算值相符。表达产物经Ni2 -IDASepharose 6B亲和柱纯化 ,纯度可达 90 %以上 ,得率为 0 .8mg/ 10 0ml。　 结论纯化后的融合蛋白具有CEA结合活力 ,其亲和常数为 5 .4× 10 7/M(抗体结合浓度 ) ,略低于其亲本单抗E7B10 2 .7× 10 9/M。     

小鼠内皮抑制素原核表达质粒的构建及表达

内皮抑制素具有强烈的抑制新生血管形成的作用，其主要在肝脏合成。提取小鼠肝细胞总RNA，设计合适的引物，用RT－PCR扩增出小鼠内皮抑制素cDNA片段，插入原核表达载体pRSET-A中，构建出重组质粒pRSET-ES。将其转化入大肠杆菌DH5α中扩增，质粒酶切筛选，DNA测序予以证实。重组质粒转化入大肠杆菌BDPS中，经IPTG诱导，SDS－PAGE检测到约19.8ku大小的融合蛋白。     

三结构域重组纤连蛋白多肽在大肠杆菌中表达及其产物的纯化与鉴定

在大肠杆菌中表达了一种抗肿瘤转移多肽——人纤连蛋白（ＦＮ） 的ＣｅｌｌＩ－Ｈｅｐ Ⅱ－ＣｅｌｌⅡ三结构域重组多肽（ＣＨ８２）, 表达效率达２１％ 。在低温 （２２ ℃） 培养表达时, ＣＨ８２大部分为可溶性产物, 经ＤＥＡＥ－５２ 层析及Ｈｅｐａｒｉｎ－ａｇａｒｏｓｅ亲和层析可得到纯品; 在高温（３７ ℃） 培养表达时, ＣＨ８２ 主要以包涵体形式出现, 经尿素变性与复性处理后,可通过Ｈｅｐａｒｉｎ－ａｇａｒｏｓｅ 亲和层析得到纯品。所得纯品均具有结合肝素和结合细胞的功能, 且结合细胞的能力比双结构域ＦＮ更强, 表明两个结合细胞的功能结构域均有活性     

人心肌肌钙蛋白I基因的克隆及其在大肠埃希菌中的表达

目的从人心肌组织中克隆出心肌肌钙蛋白Ⅰ（cardiac troponinⅠ，cTnI）的cDNA。构建成表达重组体导入特定宿主菌，以期大量表达并获得高纯度的心肌肌钙蛋白Ⅰ，为临床检测心肌损伤及预后提供诊断试剂材料。方法利用RT—PCR方法从人心肌细胞的总RNA中克隆出编码人心肌肌钙蛋白Ⅰ的cDNA片段，将其插入原核表达载体形成重组体并导入宿主菌BL21（DE3）中，经异丙基硫代-β-半乳糖苷（IPTG）诱导，表达出带6个组氨酸标签的融合蛋白，Ni-NTA树脂纯化后行Western blot进行鉴定。结果成功获取了人cTnI的cDNA，并在大肠埃希菌中高效表达。经Ni—NTA树脂纯化后获得的产物可与其特异性单克隆抗体反应。结论成功克隆了cTnI基因，构建的重组体能够在大肠埃希菌中高效表达，经纯化可获得电泳单点纯的cTnI蛋白。     

淋病奈瑟菌孔蛋白B原核重组质粒的构建、表达与蛋白鉴定

目的克隆和分析淋病奈瑟菌孔蛋白（porinⅠB，PⅠB）的基因序列并表达相应的蛋白质，为淋病奈瑟菌感染的检测和基因工程疫卣的研究与开发建立基础。方法PCR扩增出孔蛋白PⅠBDNA片段后构建出重组质粒pET—PⅠB，并经质粒酶切筛选、DNA测序和异丙基硫-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导大肠埃希菌DE3表达蛋白予以证实。结果所得PⅠB核苷酸序列与GenBank（AF090801）公布的序列相比较，同源性达99．28％，推导氨基酸序列同源性为98．14％。SDS-PAGE检测到40kD大小的融合蛋白。结论淋病奈瑟菌孔蛋白PⅠB原核表达质粒构建正确。     

人酸性成纤维细胞生长因子基因在大肠杆菌中的高效表达及产物纯化、鉴定

用 Ｈｉｎｄ Ⅲ和 Ｅｃｏ ＲⅠ双酶酶切经改造的 Ｐ Ｕ Ｃａ Ｆ Ｇ Ｆ质粒，获得了人酸性成纤维细胞生长因子（ｈａ Ｆ Ｇ Ｆ）基因，将该基因片段插入表达载体ｐｋｋ２２３３，筛选得到了重组质粒ｐｋｋｈａ Ｆ Ｇ Ｆ。加 Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ 诱导该质粒转化的大肠杆菌 Ｊ Ｍ １０９ 表达，ｈａ Ｆ Ｇ Ｆ在发酵液中的表达水平约８０ｍ ｇ／ Ｌ。用肝素亲和层析的方法，获得了电泳纯ｈａ Ｆ Ｇ Ｆ样品。纯化过程中ｈａ Ｆ Ｇ Ｆ活力回收率为６５％ 。纯化ｈａ Ｆ Ｇ Ｆ样品的比活性为 Ｅ Ｄ５０ ４．６ｎｇ／ｍ ｌ，理化及生物活性分析与天然ｈａ Ｆ Ｇ Ｆ对照品完全一致。