16年腹膜透析的基础和临床研究回顾

总结16年以来中南大学湘雅二医院肾内科腹膜透析的基础与临床研究的经验与成果。在国内率先成功构建了腹膜透析及腹膜纤维化动物模型,分离、鉴定了腹膜间皮细胞;利用细胞、分子生物学方法,系统研究了腹膜透析液的生物相容性、腹膜间皮细胞透析损伤的分子机制与防治措施,观察了促纤维化细胞因子转化生长因子-β1(TGF-β1),结缔组织生长因子（CTGF）及过氧化物酶体增生物激活受体-γ（PPAR-γ)等在腹膜纤维化发病机制中的重要作用,并初步阐明了它们的基因表达调控机制。首次在腹膜透析研究领域中利用纳米载体介导TGF-β1-shRNA与pCTGF-shRNA质粒在腹膜细胞与组织中的表达。在临床研究方面,研究了腹膜透析置管定位新方法、腹膜透析溶质转运特点及其机制、腹膜透析治疗模式及其他并发症的防治。     

人参总皂甙对乳酸盐腹膜透析液致人腹膜间皮细胞损伤的保护作用

目的 :观察人参总皂甙 (GS)对乳酸盐腹膜透析液 (L -PDS)在体外所致的人类腹膜间皮细胞 (HPMC)活力和增殖抑制的影响。方法 :采用胰蛋白酶消化法从人腹膜组织中分离间皮细胞 ,建立稳定的体外培养模型 ;用乳酸脱氢酶 (LDH)的释放和四甲基偶氮唑盐比色法 (MTT法 )评估细胞的活性及增殖能力。结果 :2 .5 %和 4.2 5 %葡萄糖L-PDS组与对照组相比HPMC的LDH释放增多 ,且两浓度差异无显著性 ;随L -PDS暴露时间的延长 ,HPMC的存活率逐渐降低 ;GS可以减少LDH的释放 ,提高细胞存活率 (P <0 .0 1) ,并能促进HPMC的增殖 (P <0 .0 5 )。结论 :GS对L-PDS体外所致HPMC活力和细胞增殖的抑制具有一定的保护作用。     

葛根素对体外培养人腹膜间皮细胞保护作用的研究

目的:了解葛根素对体外培养的人腹膜间皮细胞增殖活性、氧化应激和转移生长因子-β1(TGF-β1)分泌的影响.方法:体外培养人腹膜间皮细胞,分对照组,腹膜透析液(PDS)组及葛根素1、2、3组(葛根素终浓度依次为50、100、200μg·ml-1)5组观察.检测各组间皮细胞的增殖活性,上清MDA、SOD、GSH水平以及TGF-β1的含量并进行比较.结果:在PDS干预下腹膜间皮细胞MTT还原能力明显下降,上清液MDA水平较对照组显著升高,SOD、GSH水平较对照组显著降低.葛根素组MDA水平显著低于PDS组,SOD、GSH水平显著高于PDS组.腹膜间皮细胞在PDS干预下分泌TGF-β1较对照组显著增加,葛根素组TGF-β1分泌与PDS组比较有显著下降.结论:葛根素可以拮抗商业性PDS对腹膜间皮细胞增殖活性的抑制作用,可以抑制氧化应激和TGF-β1分泌.     

异博定注射液对慢性腹膜透析大鼠腹膜透析功能及腹膜形态的影响

目的探讨不同剂量的异搏定对高糖透析液作用下，腹膜透析大鼠模型腹膜间皮细胞的形态和功能的影响及它们之间的关系。方法48只SD大鼠随机分为对照组和异博定低、中、高剂量组4组，腹膜透析30d后进行腹膜功能试验、CA125检测，同时对腹膜印片进行形态学分析。结果异博定中、高剂量组能明显升高透析大鼠透析液超滤量，与对照组相比较有统计学意义（P〈0．01），且异博定各组对透析大鼠CA125、腹膜间皮细胞的表面积、细胞密度等均无明显影响，相互间比较无统计学意义（P〉0．05）。结论透析液中加入中、高剂量的异搏定可增加腹膜透析鼠的超滤及溶质的清除，且长期使用不会导致对腹膜间皮细胞损伤，其作用机制可能与其减少腹膜间皮细胞肥大、保护腹膜间皮细胞、改善腹膜超滤功能有关。     

黄芪液拮抗乳酸盐腹透液对人腹膜间皮细胞的损伤作用

目的 :研究黄芪液对乳酸盐腹透液致腹膜间皮细胞增殖及损伤作用的影响。方法 :采用胰蛋白酶 -ED TA消化法 ,从人腹膜组织中分离间皮细胞 ,并建立体外人腹膜间皮细胞 (HPMC)培养模型。以MTT法测定HPMC增殖程度 ,采用自动生化分析仪检测 ,培养液中乳酸脱氢酶 (LDH)水平示细胞损伤程度。结果 :2 .5 %乳酸盐腹透液中加用黄芪液 (1mg/ml)与HPMC作用 4 5min ,其培养液中LDH水平较腹透液对照组明显降低(P <0 .0 1) ,HPMC增殖能力明显增强 (P <0 .0 1)。结论 :黄芪液能拮抗乳酸盐腹透液致HPMC的损伤。     

人参总皂甙对乳酸盐腹膜透析液致人腹膜间皮细胞损伤的保护作用

目的：观察人参总皂甙（GS）对乳酸盐腹膜透析液（L－PDS）在体外所致的人类腹膜间皮细胞（HPMC）活力和增殖抑制的影响。方法：采用胰蛋白酶消化法从人腹膜组织中分离间皮细胞,建立稳定的体外培养模型;用乳酸脱氢酶（LDH）的释放和四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）评估细胞的活性及增殖能力。结果：2．5％和4．25％葡萄糖L－PDS组与对照组相比HPMC的LDH释放增多,且两浓度差异无显著性;随L－PDS暴露时间的延长,HPMC的存活率逐渐降低;GS可以减少LDH的释放,提高细胞存活率（P＜0．01）,并能促进HPMC的增殖（P＜0．05）。结论：GS对L－PDS体外所致HPMC活力和细胞增殖的抑制具有一定的保护作用。     

腹透液CA125水平与腹膜转运的关系

目的探讨腹透患者检测癌抗原125(CA125)的临床意义以及间皮细胞在腹膜转运中的作用。方法采用4.25%葡萄糖浓度的腹透液对34例腹透患者行腹膜平衡试验,于腹透液留腹4h时采集10mL用放免法测定CA125浓度,并用体表面积校正。收集0、1、4h的透析液及1h的血标本,测定肌酐和葡萄糖浓度,记录净超滤量(nUF),计算4h透析液肌酐与血肌酐浓度之比(D/Pcr)、肌酐转运面积系数(MTACcr)、葡萄糖吸收率(Glu%)、1h透析液钠与血钠比值(D/PNa+)等溶质和液体转运参数。结果腹透液CA125平均浓度为(7.39±4.47)U·mL-1·1.73m～2。腹透液CA125水平与患者腹透龄呈显著负相关(P<0.05);与D/PNa+弱正相关(P<0.05);与溶质转运参数D/Pcr、MTACcr、Glu%、nUF不相关。结论动态观察腹透液CA125水平可间接了解腹膜间皮细胞状态。随着腹透治疗时间的延长,腹膜间皮细胞的数量会逐渐减少。腹透时间皮细胞不是溶质转运的一道重要滤过屏障。     

腹透液相关浓度葡萄糖对体外腹膜间皮细胞的影响

目的 研究腹透液相关的三种浓度葡萄糖（1．5％、2．5％、4．25％）对体外培养的腹膜间皮细胞凋亡及其形态的影响。方法 胰蛋白酶消化法从腹膜组织中分离间皮细胞，建立体外培养模型。采用Hoechst 33258荧光染色法及流式细胞仪技术测定体外培养的腹膜间皮细胞在腹膜透析液相关浓度葡萄糖作用下的凋亡率；采用透射电子显微镜技术观察高浓度葡萄糖对体外培养的腹膜间皮细胞形态学的影响。结果Hoechst 33258荧光染色法和流式细胞仪结果显示：与对照组比较，1．5％、2．5％、4．25％葡萄糖均能引起明显的腹膜间皮细胞的凋亡（P〈0．05），三种浓度葡萄糖组间也有显著的差异（P〈0．05），4．25％甘露醇能引起明显的凋亡（P〈0．01），4．25％葡萄糖与4．25％甘露醇比较，前者能引起明显的凋亡（P〈0．05）；与正常对照组比较，1．5％葡萄糖分别作用于腹膜间皮细胞24h、72h、120h，各时间组均出现明显的凋亡（P〈0．05）。腹膜间皮细胞的凋亡率与葡萄糖浓度和作用时间呈正相关（r〉0．7．P〈0.05）。透射电子显微镜观察4．25％葡萄糖作用72h后大鼠腹膜间皮细胞的形态变化：细胞表面的微绒毛倒伏、脱失；细胞质内出现线粒体空泡样变；细胞核内的染色质浓缩、边集；出现凋亡小体。结论 腹膜透析液相关的三种浓度葡萄糖和4．25％的甘露醇均能引起腹膜间皮细胞的凋亡；葡萄糖诱导的腹膜间皮细胞凋亡具有浓度和时间依赖性；葡萄糖引起的细胞凋亡不仅与其渗透压有关，还与葡萄糖代谢有关；葡萄糖引起的细胞形态改变有：腹膜间皮细胞表面的微绒毛倒伏、缺失；细胞质内的线粒体出现空泡样变：细胞核内出现染色质浓缩、边集的改变。     

氨基胍对乳酸盐腹膜透析液致人腹膜间皮细胞损伤及血管内皮生长因子表达的影响

目的 研究氨基胍(AG)对乳酸盐腹膜透析液(L-PDS)致人腹膜间皮细胞(HMrSV5)损伤及血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响.方法 采用人腹膜间皮细胞株HMrSV5为体外实验模型,分为无血清DMEM培养液对照组、L-PDS组(2.5%L-PDS)、L-PDS+AG组(2.5%L-PDS+10 mmol/L AG)、单纯AG组(终浓度10 mmol/L).各组以上不同干预因素与HMrSV5细胞共孵育.MTT法检测各组细胞增殖、评估细胞活力,Western blot和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测VEGF蛋白及mRNA的表达.结果 MTT试验表明,L-PDS组OD值为(0.120±0.019),明显低于对照组的(0.298±0.031),差异有统计学意义(P<0.05);L-PDS+AG组OD值为(0.289±0.022),明显高于L-PDS组,差异有统计学意义(P<0.05).Western blot和RT-PCR结果均表明,与对照组比较,L-PDS组细胞中VEGF蛋白和mRNA表达明显增加,与L-PDS组比较,PDS+AG组VEGF蛋白和mRNA的表达明显减低,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 AG可拮抗乳酸盐腹膜透析液致人腹膜间皮细胞损伤并下调VEGF的表达.     

腹透液对大鼠腹膜间皮细胞凋亡和增殖的影响

目的探讨腹透液对腹膜间皮细胞凋亡和增殖的影响。方法采用MTT比色法测定腹透液对体外培养的大鼠腹膜间皮细胞增殖的影响．同时应用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率。结果腹透液刺激1h后，体外培养的大鼠腹膜问皮细胞增殖抑制率、G0/G1期细胞比例、早期凋亡率均增高；腹透液中糖浓度越高，刺激时间越长，以上3个指标增高越明显。含4．25％葡萄糖的腹透液刺激3h后，细胞增殖抑制率达44．12％，G0/G1期细胞占71．95％，早期凋亡率达23．59％，远远高于不含糖的阴性对照组和含1．5％糖腹透液组（P〈0．001），也高于4．25％甘露醇组（P〈0．05）。结论高糖腹透液诱导体外培养的腹膜间皮细胞凋亡．抑制其增殖。     

高糖对人腹膜间皮细胞间隙连接蛋白的影响

目的研究高糖对人腹膜间皮细胞间隙连接蛋白（connexin43）表达的影响。方法分离培养人腹膜间皮细胞,细胞分为3组：正常糖组（含5．5mmol／L葡萄糖）、高糖组（含140mmol／L葡萄糖）和渗透压对照组（含5．5mmol／L葡萄糖加24．5mmol／L甘露醇）,培养24、48h后,应用Northernblot、Westernblot方法检测connexin43mRNA和蛋白质表达,比较3组之间的差异。结果正常糖组腹膜问皮细胞表达丰富的connexin43,高糖环境下培养的腹膜间皮细胞connexin43mRNA和蛋白质表达均较正常糖组显著下降（P〈0．05）。渗透压对照组与正常糖组之间无明显差异（P〉0．05）。结论高糖可抑制腹膜间皮细胞connexin43mRNA和蛋白质表达,可能为腹膜透析（PD）中腹膜间皮层完整性损伤的机制之一。     

新生儿出生时期脐血浆胶体渗透压的正常值研究

121例(男65、女56)武汉地区出生的正常新生儿脐血浆胶体渗透压研究表明:男女差别无显著性,经 D 检验为偏态资料,中位数为287.98mmol/L.95％和90％正常估计值分别为263.38～344.75mmol/L 和268.42～309.05mmol/L 与 Nesons 的正常值289～308mmol/L 有一定的重叠。     

高糖对人腹膜间皮细胞增殖及损伤作用的影响

目的研究高糖对人腹膜间皮细胞（HPMC）增殖及损伤作用的影响。方法利用HPMC体外培养模型,HPMC分别经含1.5%、2.5%、4.25%葡萄糖的1640培养基培养6、12、24、48 h后,以四甲基偶氮多胍（MTT）法,测定HPMC增殖程度,采用自动生化仪检测培养液中乳酸脱氢酶（LDH）分泌水平。结果不同浓度葡萄与Control组间MTT OD值不同、LDH值亦不同,但时间效应均相近。而不同浓度葡萄糖组间MTT OD值、LDH值均相近、时间效应均相近。结论高糖可抑制HPMC增殖,促进LDH分泌,在腹膜损伤及纤维化进程中起一定作用。     

左旋肉碱对高糖条件下人腹膜间皮细胞增殖、凋亡及纤维连接蛋白分泌的影响

目的：探讨左旋肉碱对高糖条件下体外培养人腹膜间皮细胞增殖、凋亡及纤维连接蛋白（FN）分泌的影响。方法：以不同浓度左旋肉碱作用体外培养人腹膜间皮细胞，MTT法测定细胞增殖，Annexin V-FITC／PI双标记法检测细胞凋亡，ELISA法检测培养液中FN浓度。结果：不同浓度左旋肉碱作用24h后，0．1％左旋肉碱组细胞增殖活性显著升高（P〈0．05），作用72h后0．5％及1．0％左旋肉碱组细胞增殖活性明显降低（P〈0．05）。作用48及72h后0．05％及0．1％左旋肉碱组细胞凋亡率降低。作用24h后0．05％左旋肉碱组培养液中FN浓度升高（P〈0．05），作用72h后左旋肉碱组培养液中FN浓度均下降（P〈0．01）。结论：高糖条件下一定浓度的左旋肉碱可以促进人腹膜间皮细胞增殖、减少其凋亡。     

血浆晶体渗透压对急性心肌梗死患者预后影响的研究

目的评估血浆晶体渗透压对急性心肌梗死（AMI）患者临床及预后的影响。方法将102例AMI患者按入院1 h内的血浆晶体渗透压水平分3组,正常血浆晶体渗透压组为N组72例,低血浆晶体渗透压组为L组21例,高血浆晶体渗透压组为H组9例,按照急性心肌梗死诊断和治疗指南处理,观察3组患者发生心力衰竭、心源性休克、心室颤动、Ⅲ度AVB、住院病死率和30d病死率的差异。结果年龄较大,有糖尿病、心肌梗死、脑卒中和心力衰竭病史者更容易出现血浆晶体渗透压异常（P〈0.05）;血浆晶体渗透压异常组更容易并发心力衰竭、心源性休克、心室颤动和Ⅲ°AVB等严重并发症（P〈0.05）;静脉溶栓冠脉再通率也显著降低（P〈0.05）;住院病死率和30d病死率亦明显增加（P〈0.05）。结论 AMI患者早期血浆晶体渗透压异常,其住院病死率和30d病死率明显增加,提示血浆晶体渗透压异常可能是影响AMI患者预后的独立危险因素。     

一氧化氮对腹膜间皮细胞醛糖还原酶活性的影响

目的通过观察一氧化氮对腹膜间皮细胞醛糖还原酶（AR）活性的影响，探讨一氧化氮对腹膜间皮细胞醛糖还原酶的调节作用。方法采用人的网膜作为细胞来源，胰蛋白酶-EDTA消化法进行人腹膜间皮细胞（HPMC）的分离、培养，间接免疫荧光法对第二代细胞进行鉴定。第2-3代细胞用于实验。以硝普纳为一氧化氮供体，硝普纳（0．5mmol／L、1mmol／L、2mmol／L）＋1．5％葡萄糖培养液为实验组，以无一氧化氮1．5％葡萄糖培养液为对照组，观察剂量及时间对腹膜间皮细胞醛糖还原酶活性的影响。应用紫外分光光度计记录NADPH在340nm处吸光值的下降表示醛糖还原酶活性。结果高糖状态下各浓度一氧化氮组醛糖还原酶活性均高于对照组，且醛糖还原酶活性随一氧化氮浓度的增加而增加；一氧化氮＋葡萄糖组醛糖还原酶活性随着时间的延长而逐渐增加。各时点一氧化氮＋葡萄糖组醛糖还原酶活性均高于葡萄糖组。结论一氧化氮以时间及剂量依赖的方式使腹膜间皮细胞醛糖还原酶活性增加。     

糖原合成酶激酶-3β磷酸化 促进人腹膜间皮细胞转分化的实验研究

目的：探讨糖原合成酶激酶（GSK）-3β磷酸化在人腹膜间皮细胞(HPMC)转分化中的作用。方法：从人腹膜组织中分离和培养人原代腹膜间皮细胞。观察GSK-3β抑制剂氯化锂（LiCl）对HPMC GSK-3β磷酸化的影响,在不同时间点（0,1,3,6,12 h）和不同浓度（0,5,10,20,40 mmol/L）LiCl下Western 印迹检测p-GSK-3β和总GSK-3β表达水平的变化。Western 印迹检测20 mmol/L LiCl作用HPMC不同时间,α-SMA和E-cadherin蛋白的表达。间接免疫荧光染色方法检测α-SMA的表达和分布。结果：LiCl促进HPMC GSK-3β磷酸化在一定范围内呈浓度依赖性和时间依赖性（P＜0.05）,但总GSK-3β水平不变（P＞0.05）。20 mmol/L LiCl干预HPMC 24 h后,α-SMA表达显著增高（P＜0.05）,E-cadherin表达显著下调（P＜0.05）。间接免疫荧光结果显示20 mmol/L LiCl作用24 h后α-SMA表达显著增高（P＜0.05）。结论：GSK-3β磷酸化能诱导HPMC发生上皮-间质细胞转分化,为治疗腹膜纤维化提供了新的思路。     

高浓度葡萄糖对人肾间质成纤维细胞增殖及PAI-1基因表达的影响

目的：探讨高糖环境下成纤维细胞的增殖情况以及I型纤溶酶原激活物抑制物（PAI－1）在介导肾小管一间质损伤过程中的作用。方法：采用MTT方法分别检测正常糖浓度和高糖浓度下细胞的增殖，RT－PCR方法观察PAI－1mRNA的表达。同时将细胞培养于25mmol/L甘露醇中，观察高糖中渗透压所起的作用。结果：培养24h后，高糖以剂量依赖形式抑制细胞增殖，与正常对照组相比，高糖可以增加PAI－1的表达，甘露醇也抑制细胞增殖，同时对PAI－1的表达产生作用。结论：高糖可抑制成纤维细胞增殖，刺激PAI－1的表达。PAI－1在糖尿病肾病肾小管一间质纤维化过程中，可能具有主要的介导作用。     

氨基胍对腹膜间皮细胞醛糖还原酶活性的影响

目的观察氨基胍对腹膜间皮细胞醛糖还原酶活性的影响，探讨氨基胍对腹膜间皮细胞醛糖还原酶的调节作用。方法采用人的网膜作为细胞来源，胰蛋白酶-EDTA消化法进行人腹膜间皮细胞的分离、培养，间接免疫荧光法对第二代细胞进行鉴定；用生长期细胞进行实验，培养6d后测AR活性；应用紫外分光光度计记录NADPH在340nm处的吸光值测定醛糖还原酶活性。结果实验组氨基胍组醛糖还原酶的活性与对照组比较仅略下降，无显著性差异。结论氨基胍并不能明显地抑制腹膜间皮细胞醛糖还原酶的活性。