兔椎间盘髓核细胞体外生物学特性的实验研究

目的 对兔椎间盘髓核细胞进行体外培养,观察细胞的形态、表型及超微结构改变,研究其体外生物学特性.方法 取2周龄健康新西兰白兔椎间盘髓核组织,在含有15%灭活FBS的DMEM/F12培养液中培养,倒置相差显微镜下观察原代和传代细胞形态.分别在取材后、原代、第1代、第2代细胞培养期间,进行髓核细胞活力测定;爬片培养后进行甲苯胺蓝、HE、聚集蛋白聚糖番红O、Ⅰ型及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察;MTT法绘制髓核细胞生长曲线,并行原代及第2代细胞透射电镜观察,对体外细胞的生物学特性进行研究.结果 倒置相差显微镜见原代髓核细胞呈类圆形,折光性较强;5 d开始有细胞贴壁,细胞呈多角形或短梭形;6～8 d细胞生长进入指数生长期;约17 d时,细胞长满瓶壁,可进行传代;随传代次数增加,细胞形态逐渐由多角形、短梭形向长梭形改变.髓核细胞活力测定在刚分离完成后细胞活力为95%～97%,原代培养期间为98%～100%,第1代培养期间仍能维持为100%,第2代细胞活力下降较为明显,为75%～80%.髓核细胞甲苯胺蓝染色呈强阳性:HE染色见细胞核、细胞质着色明显.第1代髓核细胞Ⅰ型胶原免疫组织化学染色呈阴性,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈阳性,聚集蛋白聚糖番红O染色呈阳性;第2代细胞Ⅰ型胶原免疫组织化学染色呈阳性,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈弱阳性,聚集蛋白多糖番红O染色着色较浅.MTT生长曲线与体外细胞培养时生长过程相符.透射电镜显示原代髓核细胞内线粒体少,胞质内有大量糖原颗粒,随传代次数增加,糖原颗粒减少,线粒体数量增多,细胞器开始肿胀.结论 明确了兔髓核细胞体外生物学特性变迁,为组织工程髓核的种子细胞研究提供了实验依据.     

不同代次兔髓核细胞冻存后的生物学特性比较

目的:比较不同代次兔髓核细胞冻存后的生物学特性,找出适合作为种子细胞冻存的兔髓核细胞代次。方法:取3～4月龄新西兰大白兔10只,麻醉后在严格无菌条件下分离胸腰椎间盘(T1/2～L7/S1)髓核细胞,体外传代培养,分别取一、二、三、四、五代细胞冻存2～3个月后复苏,取一代未冻存细胞作为对照组(A组,n=10);一、二、三、四、五代冻存后复苏的细胞作为实验组(分别为B、C、D、E、F组,各组n=10),在相同条件下培养2周,培养第2天时采用台盼蓝染色测定细胞成活率;培养第2d、5d、10d、14d时采用MTT法检测细胞生长活性,采用间苯三酚分光光度法测定蛋白多糖(PG)含量;培养第14d时采用阿利新兰染色法测定糖胺聚糖(GAG)合成总量,用RT-PCR法检测各组细胞Ⅱ型胶原基因的表达情况。检测细胞浓度均为1×105个/ml。采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。结果:培养第2d时B、C组细胞成活率接近A组(P>0.05);D、E、F三组细胞成活率明显低于A、B、C组(P<0.05)。不同时间点各组细胞均有不同程度的增殖,A、B、C、D四组生长趋势较接近,A、B、C三组相同时间点生长活性比较差异无统计学意义(P>0.05),D组与同一时间点A组比较有显著性差异(P<0.05),E组第10d和第14d以及F组各时间点间比较差异无显著性(P>0.05);A、B、C三组各时间点的PG含量及GAG含量高于相应时间点D、E、F组(P<0.05);A、B、C三组的Ⅱ型胶原基因表达量高于D、E组(P<0.05),明显高于F组(P<0.01)。结论:不同代次兔髓核细胞冻存后生物学特性不同,第一、二代细胞冻存后能较好保持髓核细胞特性,可作为种子细胞进行低温保存。     

椎间盘纤维环细胞的培养

目的　通过对椎间盘纤维环细胞的培养 ,观察细胞的演变 ,为研究椎间盘纤维环细胞的生物学特性、退变机理、组织工程、基因治疗等提供方法和体外模型。方法　采用胰蛋白酶、胶原酶分离大鼠椎间盘纤维环细胞 ,选择DMEM(体积分数 2 0 %的小牛血清 )培养基体外培养 ,行HE染色 ,甲苯胺蓝 ,免疫细胞化学染色分析细胞的生物学特性 ,透射电镜观察细胞的超微结构。结果　采用粗品胶原酶能充分消化纤维环组织 ;在含体积分数为 2 0 %小牛血清的DE TA培养液中细胞生长良好 ;原代纤维环细胞多为梭形 ,有伪足伸出 ,甲苯胺蓝染色 ,胞浆染为深蓝色 ;透射电镜下纤维环细胞内多见长条状粗面内质网 ,部分囊池扩张。线粒体较少 ,可见平行于细胞膜方向的微丝。免疫细胞学方法检测表明纤维环细胞有Ⅰ、Ⅱ型胶原表达。结论　本实验为椎间盘纤维环细胞的培养提供了简单、有效的方法 ,为进一步研究椎间盘纤维环细胞生物学功能和调控研究打下了基础。     

山羊髓核激光切除纤维环超微结构观察

作者应用Ｎｄ：ＹＡＧ１．０６μｍ激光行活山羊椎间盘髓核切除实验，用ＪＥＯＬ─１２００ＥＸ透射电子显微镜观察总能量４００Ｊ、６００Ｊ、８００Ｊ、１０００Ｊ、１２００Ｊ下纤维环的超微结构，发现离辐射中心０．５±０．１ｃｍ的髓核汽化时，离辐射中心约１．０±０．ｌｃｍ的纤维环结构仍基本正常，推断椎间盘周围组织不会损伤，认为人体在１０００～２０００Ｊ范围内是安全和有效的。     

兔阴茎海绵体平滑肌细胞的体外培养及其生物学特性

目的 :研究体外培养的新西兰白兔阴茎海绵体平滑肌细胞的生物学特性。　方法 :采用组织块培养法 ,对兔阴茎海绵体平滑肌细胞进行活细胞观察 ,并测定其细胞生长曲线、贴壁率、细胞分裂指数。　结果 :①兔阴茎海绵体平滑肌细胞为梭形 ,呈长轴平行排列 ,具有明显的方向性 ;②体外贴壁快 ,生长迅速 ,体外培养的阴茎海绵体平滑肌细胞在合适的传代条件和比例下能够生存并保持其稳定的生物学特性。　结论 :体外培养的兔阴茎海绵体平滑肌细胞模型可用于检测某些药物对阴茎勃起的影响。     

仿生髓核组织工程材料支架对体外培养髓核细胞合成代谢的影响

目的：观察自行设计构建的仿生髓核组织工程材料——CⅡ／HyA-CS（CHCS）支架对体外培养髓核细胞合成代谢的影响。方法：将体外培养的传1代髓核细胞接种于培养瓶内，置入CHCS支架，体外培养10d后，分别测定^3H-脯氨酸掺入量、培养液中糖胺聚糖（GAG）含量、髓核细胞可凝集蛋白多糖（Aggrecan）、核多糖（Decorin）、二聚糖（Biglycan）的mRNA表达及Aggrecan的蛋白表达等。结果：实验组与对照组的^3H-脯氨酸掺入量、培养液中GAG含量、髓核细胞Aggrecan、Decorin、Biglycan mRNA表达、Aggrecan蛋白表达等均无统计学差异。结论：CHCS支架对体外培养髓核细胞的合成代谢无明显抑制作用。     

人髓核软骨样细胞的生物学特性观察

目的:探讨人髓核软骨样细胞的生物学特性,为组织工程椎间盘种子细胞的选取提供依据.方法:髓核组织取材于3例脊柱侧凸行前路矫形手术者(年龄11～13岁),依次用0.25%胰蛋白酶和0.2%Ⅱ型胶原酶分离髓核细胞,用含10%胎牛血清(FBS)的F12培养液培养细胞,取传1～7代次细胞进行光镜、电镜检查,观察细胞形态学改变,对细胞计数、二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT)摄取进行比较,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定细胞的聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、Ⅰ型和Ⅱ型胶原蛋白信使RNA(mRNA)的表达情况.结果:体外培养条件下,传3代之前的细胞形态正常,胞浆丰富;传4代起.部分细胞的形态逐渐向长梭形演化.与传1代细胞相比,传2、3代细胞数量增殖无明显减缓(P>0.05),传4代细胞第4天开始生长减慢(P<0.05),传5Ⅰ7代细胞第2天即较转1代细胞数量明显减少(P<0.05).传1Ⅰ3代细胞的MTT摄取吸光度值差异无统计学意义(P>0.05),和传1代相比,传4代具有统计学差异(P<0.05),传5Ⅰ7代的差异更显著(P<0.01).聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原在传3代之前各代次的mRNA表达量间无统计学差异(P>0.05),和传1代相比,Ⅱ型胶原从第4代起表达量显著下降(P<0.05),聚集蛋白聚糖从第5代起表达量显著下降(P<0.05),而从传5代起髓核软骨样细胞开始表达Ⅰ型胶原:结论:髓核细胞传代后前3代细胞形态良好,增殖能力强,聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原mRNA表达良好,适合作为组织工程椎间盘的种子细胞.     

兔关月板纤维软骨细胞的培养及生物学特性研究

目的：通过半月板纤维软骨细胞的分离、培养、鉴定,观察其生长特点,研究半月板生物学特性及其损伤修复的细胞学基础。方法：机械分离兔半月板软骨,胰蛋白酶、胶原酶联合消化,１０％ＦＢＳＥ的ＤＭＥＭ中原代和传代培养,例置显微镜动态观察细胞形态及生长情况,ＧＡＧ、Ⅱ型胶原免疫组化染色,电镜观察细胞超微结构。结果：培养细胞呈多角形,有突起,富含分泌颗粒,ＧＡＧ、Ⅱ型胶原染色阳性,细胞线粒体和内质网发达。结论：培养的细胞保持了体内纤维软骨细胞的基本特性。     

年龄因素对大鼠髓核细胞生物学特性的影响

[目的]探讨年龄因素对大鼠髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)生物学特性的影响。[方法]分别从青年(3个月龄)和老年(14个月龄)雄性SD大鼠分离培养NPCs。镜下观察两组NPCs形态特征和生长状况;待细胞传至第3代时,绘制生长曲线评估其增殖能力;衰老相关β半乳糖苷酶(senescence associated-beta-galactosidase,SA-β-gal)染色法测定NPCs衰老情况;流式细胞仪检测细胞周期分布;RT-PCR检测Ⅱ型胶原、蛋白多糖及SOX-9的mRNA相对表达。[结果]两组细胞均呈短梭形或多角形,老年组NPCs胞体略偏大、扁平,胞质的折光性减弱,核变大;青年组NPCs较老年组贴壁、生长快,达到细胞融合状态所需时间短;生长曲线结果显示,进入对数生长期后,青年组NPCs增殖速率显著高于老年组;SA-β-gal染色结果显示,青年组蓝染的NPCs呈散在分布,而老年组多呈簇状分布,其SA-β-gal阳性率显著高于青年组(P0.05);细胞周期分析结果显示,老年组G1期细胞的百分比显著高于青年组(P0.05),S期细胞百分比显著低于青年组(P0.05);RT-PCR检测结果显示,青年组Ⅱ型胶原、蛋白多糖及SOX-9的mRNA相对表达量显著高于老年组(P0.05)。[结论]随年龄增长,NPCs衰老后其生物学活性及表型基因的表达降低。     

颈椎间盘纤维环及髓核的超微结构观察

目的：探讨在颈椎间盘纤维环及髓核退变中组织形态的变化。方法：对正常人、单纯颈椎间盘突出症、脊髓型颈椎病三组椎间盘纤维环及髓核进行电镜观察。结果：三组椎间盘胶原纤维无明显变化,单纯颈椎间盘突出症与脊髓型颈椎病人的退变椎间盘细胞较正常人有明显变化,表现为严重退变或细胞坏死。结论：单纯颈椎间盘突出症患者椎间盘以退变细胞为主,为退变早期阶段功能代偿期,脊髓型颈椎病椎间盘以坏死细胞为主,为退变晚期阶段,为不可逆期;颈腰椎间盘退变的组织形态学不完全相同。     

不同Pfirrmann分级椎间盘内髓核细胞生物学特性的比较

目的比较不同Pfirrmann分级椎间盘内髓核细胞的生物学特性,验证腰椎间盘退变Pfirrmann分级能否反应髓核组织在细胞水平的退变程度。方法取术中获得的患者的髓核组织,按腰椎椎间盘退变Pfirrmann分级标准进行分组。组织切片甲苯胺蓝观察比较各组髓核内细胞的密度。采用酶消化法分离培养髓核细胞。台盼蓝染色计算各组细胞活性比率,光镜观察细胞形态,透射电镜观察细胞的超微结构。MTT法绘制各组2代细胞的生长曲线。阿利辛蓝法检测各组细胞的蛋白聚糖含量,比较各组差异。结果随退变级别升高,标本内胶冻样物质含量减少,透明度降低,纤维化组织增多,Ⅴ级标本完全纤维化,并伴有钙化,无法区分髓核组织。Ⅰ级和Ⅱ级髓核内细胞密度明显高于Ⅲ级,Ⅳ级又明显高于Ⅳ级。Ⅰ级组髓核细胞的活性比率为（93.5±3.7）%;Ⅱ级组细胞活性比率为（91.6±4.3）%;Ⅲ级组细胞活性比率为（83.5±6.7）%;Ⅳ级组细胞活性比率为（74.8±5.9）%。除Ⅰ级与Ⅱ级比较差异无统计学意义外,其余各组两两比较差异均具有统计学意义（P〈0.05）。光镜下Ⅰ级和Ⅱ级组细胞呈短梭形或多角形轮廓清晰饱满,折光性强。Ⅲ级组胞突较长,Ⅳ级组胞突更长,细胞轮廓模糊。电镜下Ⅰ级和Ⅱ级组细胞相似,胞浆内含有大量粗面内质网和线粒体,Ⅲ级组细胞内的粗面内质网和线粒体减少,出现小的空泡,可见溶酶体出现。Ⅳ级组细胞溶酶体大量聚集,可见巨大的空泡样结构。Ⅰ级组和Ⅱ级组细胞生长速率快于Ⅲ级组（P〈0.01））。Ⅲ级组细胞生长速率快于Ⅳ级组（P〈0.05）。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组细胞GAG含量分别为（423.19±41.21）mg/L,（408.23±29.25）mg/L、（273.05±52.44）mg/L、（91.73±38.06）mg/L,Ⅰ级组和Ⅱ级组细胞高于于III级组（P〈0.05））。Ⅲ级组细胞高于Ⅳ级组（P〈0.05）。结论椎间盘退变的Pfirrmann分级,能很好的反映髓核组织在细胞水平的退变程度。是一种简单有效的退变分级系统。     

不同代次成人正常髓核细胞的形态及生长动力学比较

目的比较不同代次成人正常髓核细胞体外培养的形态及生长动力学差异。方法从成人正常髓核组织分离培养髓核细胞，传代后对细胞形态、生长曲线、噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）摄取等进行比较研究。结果体外培养条件下，传3代之前的细胞形态正常，胞浆丰富；传4代起，部分细胞的形态逐渐向长梭形演化。生长曲线提示传3代之前的髓核细胞持续增殖能力强。MTT测定吸光度值，传1、3代时差异无统计学意义（P〉0．05），传5、7代与传1代相比，差异具有统计学意义（P〈0．05）。结论体外培养条件下，前3代成人正常髓核细胞形态良好，活性高，增殖能力强，适合作为组织工程椎间盘的种子细胞。     

骨形态发生蛋白和碱性成纤维细胞生长因子激发纤维环细胞成骨的潜能

目的研究联合使用重组人骨形态发生蛋白（recombinant human bone morphogenetic protein-2,rhBMP-2）和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）椎间盘纤维环细胞成骨潜能的激发作用。方法向体外培养的纤维环细胞中分别及联合加入rhBMP-2和bFGF,观察纤维环细胞的表型表达特点。结果联合使用rh-BMP-2和bFGF能够明显促进椎间盘细胞增殖,提高细胞内碱性磷酸酶活力,增加I型胶原分泌,提高钙盐沉积程度,提高骨钙素的表达水平。结论联用rhBMP-2和bFGF能够诱导纤维环细胞向成骨细胞方向分化,分泌钙盐并形成钙结节。     

H2O2氧化应激诱导兔椎间盘髓核细胞衰老的研究

目的:研究H2O2不同浓度对兔椎间盘髓核细胞形态、活力、增值、周期等的影响.方法:新西兰大白兔(2～3 kg,雌)10只,无菌条件下酶消化法分离髓核细胞.含15％FBS的DMEM/F12(1:1)培养液培养,细胞90％融合后传第1代.按照H2O2不同浓度(0μmol/L、130 μmol/L、216 μmol/L、360 μmol/L、600 μmol/L、1 000 μmol/L)分组,0 μmol/L H2O2为空白对照组.在细胞对数生长期,不同浓度H2O2处理1h后原培养液继续培养48 h,通过检测,分析比较各组髓核细胞与空白对照组间形态、活力、增值、周期的差异性.结果:与空白对照组比较,当H2O2浓度为130 μmol/L、216 μmol/L时,髓核细胞生物学特性未见显著性改变(P＞0.05);当H2O2浓度为360 μmol/L、600 μmol/L、1 000 μmol/L时,髓核细胞出现衰老改变:细胞质减少并出现空泡、增值减慢、衰老相关-β-半乳糖苷酶蓝染率增加、细胞周期阻滞于G1期而进入S期减少(P＜0.05).随着H2O2浓度的增高,衰老程度不断升高.结论:一定浓度的H2O2能够导致髓核细胞提前衰老,引起髓核细胞生物学特性的改变.     

人骨膜细胞生物学特性的实验研究

目的 探讨人骨膜细胞体外培养的生物学特性. 方法 以胫骨骨膜组织为材料,采用组织块法分离细胞,完全培养基培养,通过倒置显微镜观察细胞形态学,锥虫蓝染色计数法检侧细胞增殖能力;流式细胞学分析细胞表面抗原.随机分为3组,成骨实验组和成软骨实验组分别加入不同的定向培养剂,对照组加入完全培养基,采用碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色检测各组细胞的成骨和成软骨分化指标. 结果 骨膜细胞在体外培养条件下呈贴壁生长,细胞生长曲线证实骨膜细胞传至第9代仍保持良好的增殖能力,流式细胞仪检测证实细胞表面抗原CD90及CD105呈阳性;组织化学染色检测证实成骨实验组分化后细胞碱性磷酸酶及钙结节呈阳性,成软骨实验组分化后细胞蛋白聚糖及Ⅱ型胶原呈阳性,对照组各项指标均生阴性.结论 骨膜细胞体外培养细胞增殖能力强,具有间充质干细胞的特性和良好的成骨和成软骨分化潜能,其定向诱导分化的成骨细胞和软骨细胞均具有各自明显的细胞功能表达.     

乌司他丁对兔髓核细胞中诱导型一氧化氮合酶和基质金属蛋白酶表达的影响

目的 探讨乌司他丁对白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)诱导的兔椎间盘髓核细胞中诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)和MMP-3表达的影响.方法 用酶消化法...     

兔椎间盘器官与脊柱运动节段离体培养条件下髓核组织的变化

目的:比较离体培养的兔椎间盘器官及脊柱运动节段两种模型椎间盘髓核组织的变化.方法:将21只新西兰白兔随机分为器官组8只,节段组13只,处死后在无菌条件下分别取出椎间盘器官和脊柱运动节段各50个,在高渗培养基中进行整体培养(410 mOsm/kg),于培养前及培养后第3、7、14、21天,两组各取10个椎间盘分别进行HE染色、II型胶原免疫组化、蛋白多糖含量和髓核细胞活力测定.结果:培养21 d器官组与培养14 d节段组HE染色示椎间盘组织结构基本保持完整,21 d节段组椎间盘组织形态学破坏;21 d器官组与14 d节段组Ⅱ型胶原免疫组化染色强度差异无统计学意义(P>0.05),21 d节段组染色变浅,与之前各时间点及器官组相比差异有统计学意义(P<0.05);蛋白多糖PAS/AB染色7 d内两组强度无降低,14 d两组强度均有所减弱,21 d节段组染色强度进一步减弱,改变比器官组更为明显;髓核细胞荧光检测两组7 d时强度较培养前变化不明显(P>0.05),21 d器官组与14 d节段组强度略有降低,但与之前时间点比较差异无统计学意义(P>0.05),21 d节段组髓核细胞荧光强度减弱,细胞活性降低,与之前各时间点及器官组比较差异明显(P<0.05).结论:14d内脊柱运动节段可作为研究生物力学对椎间盘影响的离体实验模型.     

An in vitro study of dynamic cyclic compressive stress on human inner annulus fibrosus and nucleus pulposus cells

Background contextIntervertebral disc (IVD) cells exhibit diverse biologic responses to compressive stress depending on the compressive stress type, magnitude, duration, and anatomic zone of IVD cell origin. The previous studies mainly focused on the effects of compressive stress on animal IVD tissue. Few studies have investigated the response of human IVD tissue to compressive stress.PurposeTo assess the effect of dynamic cyclic compressive stress on biosynthesis of collagen and glycosaminoglycan of human inner annulus fibrosus (AF) and nucleus pulposus (NP) cells.Study design/settingObservation of moderate and high magnitudes of compressive stress on human IVD cell biosynthesis.Patient sampleHuman IVD of adolescent idiopathic scoliosis case undergoing thoracoscopic discectomy and fusion was collected.Outcome measuresCell morphology, cell proliferation assay, as well as collagen and glycosaminoglycan content were examined in vitro.MethodsIntervertebral discs were cultured under 0.2 or 0.4 MPa of compressive stress at 1 Hz for 2 hours twice a day up to 7 days. These were compared with samples unloaded. The analysis was done via electron microscopy examination, cell proliferation assay, as well as collagen and glycosaminoglycan content analysis.ResultsCollagen and glycosaminoglycan content in the inner AF and NP cells cultured under 0.2 MPa of compressive stress was significantly higher than that in the control cells but was significantly lower than that in the control cells under 0.4 MPa of compressive stress. The number of endoplasmic reticulum in the inner AF and NP cells cultured under 0.2 MPa of compressive stress was significantly higher than that in the control cells but was significantly lower than that in the control cells under 0.4 MPa of compressive stress.ConclusionThese findings imply that biosynthetic characteristics of human inner AF and NP cells may vary under varying degrees of compressive stresses, which may result in varying amounts of extracellular matrix being secreted.