一株含新的mucA突变基因的黏液型铜绿假单胞菌的生物学特性

目的研究黏液型铜绿假单胞菌PA17中的mucA基因序列及其生物膜形成、生长速度和耐药性,并与铜绿假单胞菌标准菌株PAOI进行比较。方法采用聚合酶链反应(PCR)方法分别扩增PA17与非黏液型铜绿假单胞菌标准菌株PAOI的mucA基因,全自动荧光测序仪测序。同时用改良的平板培养法分别建立PA17和PAOI的生物膜模型,于8h、24h、3d,6d用扫描电镜检测生物膜形成情况。稀释平板计数法比较PA17和PAOI的生长曲线,国际标准琼脂平皿二倍稀释法检测常用抗生素对上述两菌株的体外抗菌活性。结果PA17mucA基因第166～333位核苷酸缺失;其生物膜形成速度及生长速度明显慢于PAOI;PA17与PAOI对常用抗生素的耐药性一致。结论发现一株含新的mucA突变基因的黏液型铜绿假单胞菌,其生物学特性不同于以往报道的黏液型铜绿假单胞菌,可能与mucA基因新的突变有关。     

蹭行运动和胞外藻酸盐在铜绿假单胞菌生物被膜形成中的作用

目的 比较3株铜绿假单胞菌即含新的mucA基因突变的黏液型PA17、mucA基因经典突变的黏液型PD0300、含野生型mucA基因的非黏液型PA01生物被膜早期形成和成熟形态,探讨铜绿假单胞菌纤毛介导的蹭行运动和胞外基质藻酸盐在黏液型及非黏液型铜绿假单胞菌生物被膜形成中的作用.方法 用PAl7、PAO1、PD0300的单菌落穿刺接种1%琼脂糖平板,肉眼观察细菌纤毛介导的蹭行运动,测定细菌运动环评估3株细菌的蹭行运动能力;在生物被膜形成早期采用结晶紫对膜内黏附细菌染色,测定其吸光度(A)值,建立24 h内3株细菌的黏附曲线;建立未饱和铜绿假单胞菌生物被膜模型,检测早期和成熟期的胞外藻酸盐分泌;将含绿色荧光蛋白的pUCP/UV质粒转化3株铜绿假单胞菌,在激光共聚焦显微镜下观察静态生物被膜不同时期的形态和结构.结果 黏液型PA17、非黏液型PAO1菌株蹭行运动的直径小于黏液型PDO300(P<0.05),PA17、PAO1的运动能力弱于PDO300菌株;黏液型PDO300在早期生物被膜形成中黏附能力最强,非黏液型PAO1次之,黏液型PA17最弱;在未饱和生物被膜早期和成熟期黏液型菌株PA17、PDO300藻酸盐合成均明显高于非黏液型菌株PAO1(P<0.05),而PA17和PDO300在生物被膜相同时期的藻酸盐合成无明显差异(P>0.05);激光共聚焦显微镜下PA17菌株在生物被膜形成中,不可逆黏附形成明显迟于非黏液型PAO1和黏液型PDO300,PA17成熟生物被膜形态呈薄膜状,与非黏液型PAO1成熟生物被膜类似;而PDO300不可逆黏附形成早,成熟生物被膜形态呈蘑菇状.结论 纤毛介导的蹭行运动是早期生物被膜形成中黏附的重要方式,可能影响成熟生物被膜的形态;而藻酸盐不是早期黏附的主要决定因素,与成熟生物被膜形态无关.     

黏液型铜绿假单胞菌和非黏液型铜绿假单胞菌的感染分布及耐药性比较

目的:了解黏液型和非黏液型铜绿假单胞菌感染分布特点及其耐药性。方法:回顾性分析2012年1月~2014年12月临床分离黏液型和非黏液型铜绿假单胞菌分布特征及其对抗生素敏感性,分析其耐药特点。细菌鉴定用VITEK 2 Compact全自动细菌培养鉴定仪、API 20NE;药敏试验采用K-B法。结果:38株黏液型铜绿假单胞菌中,痰液标本检出最多(31株),占81.58%;科室以呼吸科、ICU、烧伤科患者居高。非黏液型铜绿假单胞菌中,痰液占74.19%;以呼吸科、烧伤科分离居多。除环丙沙星、左氧氟沙星外,非黏液型铜绿假单胞菌对其他9种抗生素的耐药率明显高于黏液型铜绿假单胞菌黏液型PA;对庆大霉素的耐药性在治疗后明显高于治疗前,差异具有统计学意义(P<0.05);其他抗生素的耐药性也表现出不同程度的变化。结论:应结合黏液型铜绿假单胞菌的特点,联合大环内酯类等抗生素,破坏其生物膜的影响,增强抗生素的杀菌作用。     

肽核酸体外抑制铜绿假单胞菌PAO1生物膜形成的研究

目的研究肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)对铜绿假单胞菌生物膜形成的抑制作用,探讨其潜在的抗铜绿假单胞菌生物膜形成的应用价值。方法采用计算机软件设计和斑点杂交联合筛选出能与铜绿假单胞菌PAO1早期生物膜形成关键基因motA mRNA结合紧密的反义寡核苷酸序列,根据其序列合成肽核酸(PNA)并连接穿膜肽(cell pene-trating peptide,CCPs)(KFF)3K形成CCPs-PNA,分别采用不同浓度的CCPs、PNA和CCPs-PNA处理铜绿假单胞菌PAO1,定量测定并用显微镜观察其对生物膜形成的抑制作用。结果 PNA和CCPs-PNA对铜绿假单胞菌PAO1生物膜的早期形成都有抑制作用,并且随着浓度的增加,其抑制作用也增加,但CCPs-PNA对生物膜形成的抑制明显优于PNA组。1、5、10μmol/L的(KFF)3K-PNA对PAO1生物膜形成的抑制率分别约为30%、50%、70%。而1μmol/L的PNA对PAO1生物膜形成基本没有影响,5、10μmol/L的PNA对PAO1生物膜形成的抑制率却分别为3%和10%左右。各个浓度的CCPs对细菌生物膜的形成都没有影响。与对照组相比,CCPs-PNA处理之后的PAO1,其运动能力明显下降,PAO1处理组与对照组在运动培养基上的扩散直径之比约为3∶5。结论针对motA基因的PNA通过抑制PAO1的运动能力、降低吸附,从而对铜绿假单胞菌PA01起始阶段的生物膜形成产生抑制作用,穿膜肽(KFF)3K大大增强了此作用。推测铜绿假单胞菌的motA基因或其编码产物可能是一个良好的抗铜绿假单胞菌生物膜形成的靶点。     

铜绿假单胞菌QS系统缺陷对生物膜形成及大鼠肺部慢性感染的影响

目的研究lasI rhlI基因缺陷对铜绿假单胞菌体外生物膜形成的影响;观察铜绿假单胞菌PAO1野生型及其群体感应系统的lasI rhlI基因缺陷型菌株人工生物膜致病性的差异,了解群感应系统的lasI rhlI基因在铜绿假单胞菌生物膜感染致病过程中的作用。方法采用生理盐水-吸痰管系统进行铜绿假单胞菌体外生物膜的培养,3d后用扫描电子显微镜观察PAO1、PAO1 lasI rhlI形成生物膜的情况。从大鼠支气管内直接予以PA(菌种为铜绿假单胞菌PAO1野生型,PAO1 lasI rhlI基因缺陷型)海藻酸盐微菌粒悬液(1×109CFU/mL)攻击,建立PAO1野生型及QS系统的lasI rhlI基因缺陷型菌株人工生物膜肺部感染动物模型。于感染2周后评估各组大鼠的肺部病理学、细菌学的变化。结果3d后PAO1野生型的生物膜较厚,lasI rhlI基因缺陷型菌株所形成的生物膜结构呈薄膜状,明显薄于PAO1野生型。感染2周后,PAO1野生型组的病理学改变和细菌学改变均显著重于lasI rhlI基因缺陷组(P<0.001)。结论QS系统的lasI和rhlI基因影响铜绿假单胞菌体外形成生物膜的能力,并且在PA肺部感染过程中发挥着重要作用。     

黏液型和非黏液型铜绿假单胞菌对18种抗生素的耐药性分析

目的：比较黏液型和非黏液型铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa,PA）在体外药物敏感性试验中对各种药物的耐药性,指导临床合理使用抗菌药物。方法使用生物梅里埃 API20NE 系统对菌株进行鉴定,用 K-B 纸片法和微量肉汤稀释法对菌株进行药物敏感性试验,并进行统计学分析。结果黏液型 PA 对黏菌素、阿米卡星、妥布霉素100．0％敏感,其余抗菌药物的耐药率为2．6％～78．3％;非黏液型 PA 对复方新诺明100．0％耐药,其余抗菌药物的耐药率为2．6％～96．6％。除黏菌素、阿米卡星外,黏液型 PA 耐药率均显著低于非黏液型 PA（P ＜0．05或＜0．01）。结论黏液型 PA 的体外耐药性明显弱于非黏液型 PA,但由于其能产生大量藻酸盐,而在菌体外形成生物膜,因此要加强非黏液型 PA 的检测,指导临床合理用药。     

黄芪、穿心莲单独或与抗菌肽LL-37联合应用对铜绿假单胞菌生物膜的影响

【目的】探讨黄芪、穿心莲对铜绿假单胞菌(PA)生物膜的抑制作用及与抗菌肽LL-37联合应用是否有协同作用。【方法】培养铜绿假单胞菌野生菌株PAO1生物膜,并采用紫外分光光度法进行鉴定。采用微量肉汤稀释法分别检测黄芪、穿心莲和抗菌肽LL-37对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度(MIC)。采用紫外分光光度法检测20、50、100 g/L黄芪,20、50、100 g/L穿心莲单独用药或分别与32、64μg/mL抗菌肽LL-37联合应用对PAO1生物膜的作用。【结果】成功构建体外PAO1生物膜模型。黄芪、穿心莲在3.125～200 g/L浓度范围内对PAO1无抑制作用。抗菌肽LL-37对PAO1的MIC为256μg/mL。黄芪、穿心莲单独用药对PAO1生物膜早期形成均具有抑制作用(P0.05),呈现浓度依赖性。黄芪/穿心莲与抗菌肽LL-37联合用药对PAO1生物膜的形成及对成熟生物膜的清除作用不明显,不具有协同作用。【结论】黄芪、穿心莲均能够早期抑制PAO1生物膜的形成并且在一定程度上对成熟生物膜结构有一定的破坏作用;与抗菌肽LL-37联合应用时,不具有协同作用。     

黏液型铜绿假单胞菌耐药性分析

目的 探讨黏液型铜绿假单胞菌的耐药性,为临床治疗提供参考.方法 对分离出的22株黏液型铜绿假单胞菌用K-B法进行体外药敏检测,并进行统计分析.结果 黏液型铜绿假单胞菌对美洛培南、亚胺培南、派拉西林/他唑巴坦、敏感率较高(均为100％),头孢吡肟为95.45％、庆大霉素、左旋氧氟沙星为90.91％、阿米卡星为86.36％、环丙沙星为77.27％、头孢他啶为68.18％、派拉西林为59.09％、头孢派酮为54.54％.结论 黏液型铜绿假单胞菌体外耐药性较弱,但因其存在生物膜,体内用药时耐药率较高,因此临床培养鉴定出铜绿假单胞菌时,应注意是否为黏液型,以便临床医生选择合适的药物进行治疗.     

牡荆素对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响

目的 探讨牡荆素与抗生素联用对铜绿假单胞菌生物膜的影响。方法 通过微量肉汤稀释法检测 铜绿假单胞菌对应各抗生素的最低抑菌浓度;利用96 孔细胞培养板结合结晶紫染色法探讨牡荆素单独使用 及与抗生素联用对铜绿假单胞菌生物膜的影响。结果 当牡荆素的浓度≥ 31.25 μg/ml 时,能抑制PAO1 生物 膜的形成,使生物膜的总量从100% 减少到（80.00±4.62）%,且随着牡荆素的浓度增高,其抑制能力越强;4 种 抗生素头孢他啶（CAZ）、环丙沙星（CIP）、庆大霉素（GEN）和左旋氧氟沙星（OFLX）的最低抑菌浓度（MIC） 分别为0.5、0.5、2.0 和8.0 μg/ml ;亚抑菌浓度的CAZ、CIP、GEN 和OFLX 与牡荆素联用时能协同抑制 PAO1 生物膜的形成,分别使生物膜的总量从100% 下降至（39.38±5.32）%、（40.31±2.95）%、（23.31±3.95） % 和（50.23±3.14）%。结论 牡荆素能抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成,且与抗生素联用时有协同作用。     

黏液型铜绿假单胞菌耐药性现状探讨

目的:探讨本地区黏液型铜绿假单胞菌的耐药现状,为临床选择敏感药物治疗提供参考。方法:对分离出的35株黏液型铜绿假单胞菌用药敏卡肉汤稀释法进行体外药敏试验,并进行统计分析。结果:黏液型铜绿假单胞菌对亚氨培南、哌拉西林/他唑巴坦敏感率最高(100%)、头孢吡肟(97.1%)、庆大霉素(91.4%)、左氧氟沙星(91.4%)、阿米卡星(87.5%)、环丙沙星(85.7%)、妥布霉素(83.0%)、头孢他啶(64.03%)、哌拉西林(56.7%)、头孢哌铜(51.4%)、头孢噻肟(61.4%)以及头孢呋辛(40.0.%)。结论:黏液型铜绿假单胞菌体外耐药性比较弱,可是由于能产生大量藻酸盐,而在菌体外形成生物膜,体内用药时耐药率较高,因此临床微生物室培养鉴定出铜绿假单胞时,特别注意黏液型,以便医生选择合理的抗生素进行治疗。