白蛋白和放置时间对细胞因子诱导杀伤细胞活性的影响及简易检测方法

目的研究细胞因子诱导杀伤细胞(CIK)回输液中添加白蛋白和放置时间对其活性的影响,并建立简捷的CD3+CD56+细胞生成率及细胞死亡率的检测方法。方法(1)抗CD3-FITC和抗CD56-PE同时标记CIK细胞,或FQ-AE染色CIK细胞,荧光显微镜观察并记录;(2)悬浮液中加或不加白蛋白,Annexin V-FITC标记CIK细胞,不同时间段取样,流式细胞仪检测。结果(1)食道癌患者CIK细胞集落小,散在分布;胰腺癌患者CIK细胞集落大且集中;(2)显微镜可观察并计数CD3+CD56+细胞;(3)回输液中加与不加白蛋白的凋亡率及死亡率均无显著差异;(4)CIK细胞在培养箱外放置,0～90 min之间样品与150 min样品之间凋亡细胞数差异显著,细胞死亡率与放置时间无显著差异。结论(1)不同肿瘤患者CIK细胞的生长集落不同;(2)抗CD3和抗CD56标记可计数CD3+CD56+CIK细胞生成率,FQ-AE染色可计数死亡细胞比率,检测方法简便、快捷;(3)CIK细胞回输液中可不加白蛋白,对细胞存活率无影响;培养箱外放置时间90 min之内为宜,时间越短越好。     

细胞因子诱导的杀伤细胞免疫表型及其对EC9706细胞杀伤活性的影响

目的:探讨体外培养细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)过程中CD3+ CD56+、NKG2D的动态变化及其与CIK细胞对EC9706杀伤活性的关系.方法:流式细胞仪检测EC9706细胞NKG2D配体的表达:体外分离健康供者外周血单个核细胞,干扰素-γ、向细胞介素-2、CD3单克隆抗体诱导培养.流式细胞仪检测0、7及14 d的细胞CD3+CD56+、NKG2D的表达,乳酸脱氢酶释放法测定0、7及14 d的细胞在效靶比20:1和30:1时对EC9706细胞的杀伤活性.结果:EC9706细胞表达MICA和ULBP2,不表达MICB、ULBP1和ULBP3.0、7及14 d细胞表面NKG2D表达率分别为(26.3±1.1)%、(38.3±0.4)%和(67.1±1.3)%,差异有统计学意义(F＝1 393.352,P＜0.001);CD3+CD56+细胞分别为(0.7±0.1)%、(12.2±1.4)%和(56.5±2.0)%,差异有统计学意义(F=1 301.226,P＜0.001);0、7及14 d细胞对EC9706细胞的杀伤活性:效靶比20:1时分别为(7.1±2.0)%、(17.4±1.4)%和(37.7±0.2)%,差异有统计学意义(F=354.250,P＜0.001);效靶比30:1时分别为(8.7±0.8)%、(27.2±1.6)%和(44.3±1.1)%,差异有统计学意义(F=648.070,P＜0.001).相关分析表明CIK细胞的杀伤活性与细胞表面NKG2D表达及CIK细胞中CD3+CD56+细胞数有关(r分别为0.992、0.965、0.939和0.929,P＜0.001).结论:体外CIK细胞培养增殖过程中,NKG2D分子表达逐渐上调,CD3+CD56+细胞逐渐增多,CIK细胞对EC9706细胞的杀伤活性逐渐增强.     

大体系冻存对细胞因子诱导的杀伤细胞免疫表型及细胞杀伤活性的影响

目的探讨大体系(50 mL)冻存对细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞免疫表型及细胞杀伤活性的影响。方法采集6例健康志愿者的外周血,采用Ficoll法分离得到单个核细胞,用细胞因子诱导培养CIK细胞。收集冻存1个月后复苏的CIK细胞,采用流式细胞术检测其冻存前后的细胞活率和免疫表型;通过与乳腺癌细胞共培养(效靶比10∶1和40∶1)的方法测定其杀伤活性,与新鲜未冻存的细胞杀伤活性进行比较,同时并对不同效靶比冻存前后的细胞杀伤活性进行比较。结果 CIK细胞大体系冻存前平均细胞活率(97.79±1.92)%,显著高于复苏后的(83.61±3.42)%(P<0.05)。复苏后CIK细胞中CD3~+、CD3~+CD4~+、CD3~+CD8~+、CD3~+CD56~+表型CIK细胞所占比例虽较冻存前稍有降低,但差异均无统计学意义(P>0.05)。效靶比10∶1、40∶1时冻存前细胞和复苏后细胞杀伤率比较差异均无统计学意义(P>0.05);效靶比40∶1时冻存前细胞和复苏后细胞杀伤率均显著高于效靶比10∶1时(P<0.05)。结论大体系(50 mL)冻存对于CIK细胞活率虽有影响,但对免疫表型和细胞活性均未影响。     

细胞因子诱导的杀伤细胞研究进展

细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells,CIK)是将人外周血单个核细胞在体外用多种刺激因子,如抗cD3一McAb、IL．2、血清干扰素-γ(IFN-γ)、IL-1等共同培养一段时间后获得的一群异质性细胞。它兼有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点,比淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)、CTL、TIL的增殖能力和细胞毒性强,因而成为近10年肿瘤生物治疗的热点。现就CIK细胞的特点、诱导、杀瘤机制及应用前景等综述如下。     

银杏叶提取物增强细胞因子诱导的杀伤细胞杀伤肿瘤细胞活性的研究

探讨银杏叶提取物对人细胞因子诱导的杀伤细胞 ( CIK细胞 )杀伤肿瘤细胞活性的影响。在体外用不同浓度的银杏叶提取物诱导人 CIK细胞和肿瘤细胞 ,以观察银杏叶提取物对人 CIK细胞活性和对肿瘤细胞的影响。在银杏叶提取物浓度为 50 0μg/ ml,作用CIK细胞 4h后能明显增强 CIK细胞杀伤肿瘤细胞的活性 ,与对照组和其它浓度组相比 P<0 .0 1 ;CIK细胞对经银杏叶提取物处理后的 K562 (人红白血病细胞株 )和 SGC-790 1 (人胃癌细胞株 )杀伤活性也明显高于对照组 P<0 .0 1。银杏叶提取物在一定浓度时能明显提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性 ;经银杏叶提取物处理的 K562和 SGC-790 1更易被 CIK细胞杀伤     

细胞因子诱导杀伤细胞与抗原特异性细胞因子诱导杀伤细胞杀伤肿瘤效应比较的实验研究

目的：制备具有抗原特异杀伤活性的效应细胞。方法：反复冻融法提取肿瘤可溶性抗原，甲基噻唑基四唑（methyl thiazoly terrazolium,MTT)法检测效应细胞杀伤活性。结果：经树突状细胞（dendritic cell,DC)摄取肿瘤细胞抗原，并提呈给细胞因子诱导杀伤（cytokine induced killer,CIK)细胞所获得的DC－A－CIK细胞对同一种肿瘤靶细胞的杀伤活性，较CIK细胞、未摄取抗原的DC－CIK细胞及摄取不相同肿瘤抗原的DC－A不相同－CIK细胞具有更高的杀伤活性。结论：摄取肿瘤可溶性抗原的DC细胞可明显提高CIK细胞对相同肿瘤靶细胞的杀伤特性性和杀伤活性。     

抗原致敏的树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞对肝癌细胞杀伤活性的研究

目的：观察肝癌细胞抗原致敏的树突状细胞（Dendritic cells,DC）与细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine-induced killer cells,CIK）共培养后的细胞增殖活性、表型的变化及其对肝癌细胞HepG2的杀伤活性。方法：采集健康供者的外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMNC）,常规诱导出DC、CIK,用肝癌细胞HepG2抗原冲击DC（Ag-DC）,并将其与CIK共培养（Ag-DC-CIK）,观察CIK和Ag-DC-CIK的细胞表型及增殖活性,并以肝癌细胞HepG2作为靶细胞,用MTT法检测CIK和Ag-DC-CIK的杀伤活性。结果：肝癌细胞抗原致敏的DC与CIK细胞共培养后,Ag-DC-CIK细胞群增殖活性明显增强,且高表达CD3+CD8+、CD3+CD56+双阳性细胞,其增殖活性和杀伤活性较单纯的CIK细胞更高（P<0.05）。结论：肿瘤抗原致敏的DC与CIK共培养获得的Ag-DC-CIK增殖活性和对肝癌细胞的杀伤活性显著高于CIK细胞。     

细胞因子诱导的杀伤细胞的研究进展

细胞因子诱导的杀伤细胞 (cytokineinducedkiller ,CIK)是一种非MHC限制性的新型免疫活性细胞 ,其增殖能力强、杀瘤活性高、副作用小 ,优于淋巴因子激活的杀伤细胞 (LAK) ,对于提高患者自身抗肿瘤免疫能力有重要作用。本文就近年来有关CIK的基础研究和临床应用的进展作一综述     

肝癌患者自体细胞因子诱导杀伤细胞治疗后免疫活性细胞的检测及其临床意义

目的　观察肝癌患者自体细胞因子诱导杀伤细胞 (CIK细胞 )回输后 ,外周血中T细胞亚群及树突状细胞亚群的变化 ,评价CIK细胞治疗肝癌的临床效果。方法　采用成份血采血机采集13例肝癌患者的外周血单个核细胞 (PBMC) ,经多种细胞因子诱导后 ,于培养的第 4、7、10、13、15天流式细胞仪检测细胞表型 ;CIK细胞回输前及回输后取病人外周血 ,流式细胞仪测定Ⅰ型树突状细胞(DC1)和Ⅱ型树突状细胞 (CD2 )的比例。结果　诱导培养后 ,CD3+ CD8+ ,CD3+ CD5 6 + ,CD2 5 + 效应细胞的比例明显升高 ,分别由最初的 33 5 %± 10 1%、7 7%± 2 8%和 12 3%± 4 5 % ,上升至 36 6 %±9 0 %、18 9%± 6 9%和 16 4 %± 5 9% ,其中CD3+ CD8+ 可维持较高水平 ,CD2 5 + 和CD3+ CD5 6 + 比例分别于培养后的第 7天和第 13天开始下降。CD3+ CD4 + 和NK细胞比例略有下降 ,但差异无显著意义。CIK细胞回输后DC1和CD2细胞亚群的比例明显升高 ,分别由回输前的 0 5 9%± 0 2 3%和0 2 6 %± 0 12 %上升至回输后的 0 85 %± 0 2 7%和 0 4 3%± 0 2 0 %。CIK细胞治疗后患者临床症状明显改善 ,无明显副作用。结论　CIK细胞治疗可以提高肝癌患者的细胞免疫功能 ,提高对肿瘤细胞的杀伤作用。     

抗原负载的树突细胞对细胞因子诱导的杀伤细胞的影响

目的：研究树突细胞(DC)负载不同形式的抗原对其成熟和功能的影响,及DC对细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)增殖和功能的影响。方法：外周血单个核细胞(PBMC)经不同细胞因子作用后培养成DC和CIK细胞,将Bel 7402细胞制备成肿瘤细胞冻融物、坏死肿瘤细胞及正常生长的肿瘤细胞,并作为不同状态的肿瘤抗原刺激DC,以流式细胞仪检测DC表面分子的表达。应用MTT法检测肿瘤抗原负载的DC刺激的CIK对肿瘤细胞的杀伤力。结果：负载肿瘤细胞冻融物的Dc其表面cDla、CD80、CD83、HLA-DR高表达,促进CIK增殖和杀伤力的功能最强;与正常肿瘤细胞共培养的DC细胞成熟程度受到抑制;负载Bel 7402抗原的DC刺激的CIK对Bel 7402有较强杀伤力,而对HerpG2杀伤力弱。结论：肿瘤细胞冻融物预刺激的DC成熟程度最高,诱导抗原特异性CIK细胞的功能最强,为临床DC瘤苗和CIK的应用提供了实验依据。     

树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞治疗恶性肿瘤的护理干预

目的探讨护理干预对树突状细胞（DC）联合细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）治疗恶性肿瘤的临床疗效。方法选取我院2009年1月～2011年6月收治的恶性肿瘤患者164例,抽取患者外周静脉血80mL,经体外分离和培养DC＋CIK细胞后,使用带有滤过网的输血器进行静脉回输。将所有患者随机分为两组,采用常规护理患者82例为对照组,采刖护理干预患者82例为观察组。比较两组患者护理干预后的临床疗效。结果观察组总有效率（62．2％）明显高于对照组（45．1％）,观察组不良反应发生率（11．0％）明显低于对照组（23．2％）,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论对采用树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞治疗恶性肿瘤的患者进行有效的护理干预,不仅可以明显改善患者的生活质量,还能大幅降低不良反应发生率,值得临床推广。     

CIK细胞的制作及对不同肿瘤细胞株体外抗肿瘤作用的研究

目的:制备细胞因子激活杀伤(CIK)细胞并观察其生物学特性及对不同肿瘤细胞株的杀伤作用.方法:外周血单个核细胞用无血清培养基经干扰素γ(IFN-γ),CD3McAb,白介素2(IL-2),白介素1α(IL-1α)诱导,制作CIK细胞,以淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)作为对照,流式细胞仪检测CIK细胞的免疫表型,MTT法检测其对不同肿瘤细胞株的杀瘤活性.结果:CIK细胞与LAK细胞相比增殖速度快、最终增殖倍数高.CIK细胞主要由CD3和CD56双阳性细胞构成.CIK细胞对多种肿瘤细胞具有较强的杀伤活性.结论:CIK细胞过继免疫治疗是一种非常有前景的抗肿瘤治疗方法.     

一种培养鉴定风疹病毒的简便试验方法的建立

目的建立使风疹病毒(RV)在Vero细胞(非洲绿猴肾传代细胞株)上产生的细胞病变效应(CPE)易于观察的简便试验方法,以利于病毒的分离、培养与鉴定.方法在RV接种Vero细胞4天后,用不同pH值(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0)的融合营养液处理细胞,继续按常规条件培养1天后,在倒置显微镜下观察RV引起的特征性CPE-多核巨细胞,染色后计数多核巨细胞的形成率.同时检测在不同条件(融合时间、病毒接种初始滴度)下,多核巨细胞形成率的变化.结果感染RV的Vero细胞经过酸性融合营养液的处理,可出现RV特征性CPE-多核巨细胞.发现在37℃、pH 5.0的酸性融合营养液处理染毒细胞10 min后,继续培养1天,出现的细胞病变形态最典型,染色后计数发现多核巨细胞的形成率最高,为14.7%(P<0.01).融合处理的时间对多核巨细胞的形成率没有影响.随着病毒接种初始滴度的降低,多核巨细胞的形成率也相应降低.结论此方法简单、易行,使RV在Vero细胞上产生的细胞病变清晰易观察.     

抗原负载的DC和CIK共培养后对MGC-803的杀伤活性

【目的】研究负载抗原后的树突状细胞（DC）对细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）增殖活性、表型和功能的影响。【方法】分离外周血单个核细胞（PBMC），经不同细胞因子作用后定向分化成DC和CIK细胞，以胃癌细胞株MGC-803冻融物作为肿瘤抗原刺激DC后与CIK共培养，以流式细胞仪检测CIK细胞膜表面分子表达，MTT法检测共培养后CIK细胞对MGC-803杀伤活性的变化。【结果】CIK与负载MGC-803抗原的DC共培养后3d增殖活性开始显著提高，最高增殖倍数可达1179．5±1．29；CD3^＋CD8^＋和CD3^＋CD56^＋细胞较共培养前增多，且与负载抗原的DC共培养的CIK具有比单独培养的CIK更强的杀瘤活性。【结论】以肿瘤细胞冻融物诱导成熟的DC能进一步促进CIK增殖，提高其对胃癌细胞的杀伤活性，为指导临床应用DC和CIK联合治疗消化道肿瘤提供了实验依据。     

细胞因子诱导的杀伤细胞体外扩增及其生物学特性的研究

目的:观察细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)的体外增殖能力及其生物学特性。方法:取正常成人新鲜血,经密度梯度离心法,利用连续非贴壁的方法获得单个核细胞(PBMC),加入不同的细胞因子(IFN-γ、IL-1β、IL-2、CD3mAb),诱导生成CIK细胞,以LAK细胞作为对照。观察CIK细胞的扩增情况,用流式细胞仪检测其表面标志,MTT法测定其杀瘤活性。结果:诱导16d后,CIK细胞的增殖率达到高峰,具有较强的扩增能力,经过22d培养,总的细胞数可扩增至100多倍;CIK细胞和LAK细胞相比,在前期无明显差异,至18、21d时扩增能力显著高于LAK细胞的扩增倍数(P<0.01)。CIK细胞是一群异质细胞群,CD3 CD56 细胞为其主要的效应细胞,经过22d培养显著增加,为(55.15±5.49)%,其绝对值可增加1500多倍。CIK对A-549细胞的杀伤活性均显著高于LAK细胞(P<0.05),具有较强的杀瘤能力。结论:CIK细胞具有较强的扩增和杀瘤能力,是肿瘤过继免疫治疗中更为有效的杀瘤效应细胞。     

细胞因子诱导的杀伤细胞体外增及其生物学特性的研究

目的观察细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)的体外增殖能力及其生物学特性.方法取正常成人新鲜血,经密度梯度离心法,利用连续非贴壁的方法获得单个核细胞(PBMC),加入不同的细胞因子(IFN-γ、IL-1β、IL-2、CD3mAb),诱导生成CIK细胞,以LAK细胞作为对照.观察CIK细胞的扩增情况,用流式细胞仪检测其表面标志,MTT法测定其杀瘤活性.结果诱导16 d后,CIK细胞的增殖率达到高峰,具有较强的扩增能力,经过22 d培养,总的细胞数可扩增至100多倍;CIK细胞和LAK细胞相比,在前期无明显差异,至18、21 d时扩增能力显著高于LAK细胞的扩增倍数(P＜0.01).CIK细胞是一群异质细胞群,CD3 CD56 细胞为其主要的效应细胞,经过22 d培养显著增加,为(55.15 5.49)%,其绝对值可增加1500多倍.CIK对A-549细胞的杀伤活性均显著高于LAK细胞(P＜0.05),具有较强的杀瘤能力.结论CIK细胞具有较强的扩增和杀瘤能力,是肿瘤过继免疫治疗中更为有效的杀瘤效应细胞.     

应用自体肿瘤免疫细胞治疗中晚期肿瘤的意义

目的探讨树突状细胞（dendriticcells,DCs）和细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokineinducedkil—let,CIK）联合化疗治疗晚期实体瘤的临床意义。方法采用自体肿瘤免疫细胞治疗晚期实体瘤患者130例。分离外周血单个核细胞,其中贴壁细胞用粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、肿瘤坏死因子及白细胞介素4等诱导产生DCs,并用自体肿瘤细胞或外源性肿瘤细胞抗原致敏,获得Ag．DCs;悬浮细胞经干扰素-γ,IL2和CD3单克隆抗体（CD3 monoclonal antibody,CD3mAb）等诱导产生CIK细胞,将DCs与CIK细胞共同培养;采用FCM法检测DCs及CIK细胞表型,一次回输患者。结果130例中晚期肿瘤自体肿瘤免疫细胞联合化疗治疗后,完全缓解（CR）5例,部分缓解（PR）19例,稳定（SD）87例,疾病进展（PD）13例,6例晚期肿瘤进展死亡,疾病控制率85．38％。结论DCs—CIK细胞联合化疗治疗中晚期恶性实体瘤安全有效,具有重要的临床意义和应用前景。     

树突状细胞对CIK细胞中CD+4CD+25 T细胞数量及免疫调节作用的影响

目的探讨CD4+CD2+5调节性T细胞(Tregs)对细胞因子诱导的杀伤细胞(C IK)增殖及杀伤活性的影响;同时分析树突状细胞(DC)在逆转Tregs细胞免疫抑制效应中的作用。方法分别利用培养前分选去除CD4+CD25+T细胞的外周血单个核细胞和常规PBMC,分别培养C IK,检测细胞增殖和杀伤活性;同时在培养前去除Tregs组(C IK-Tregdel)中加入CD4+CD2+5T细胞,检测细胞杀伤活性的变化。利用DC诱导C IK细胞,分别检测DC+C IK及单纯C IK组中Tregs细胞的比例、细胞杀伤活性和TGF-β、IL-10等细胞因子的分泌水平。结果培养前去除Tregs组中增殖细胞比例、细胞杀伤活性均高于常规C IK组,在C IK-Tregdel组加入分选的CD4+CD25+细胞后,C IK的杀伤活性降低。DC诱导前后C IK中CD4+CD2+5细胞含量分别为13%±5%和10%±4%(t=3.977,P=0.001),证实经DC细胞诱导后C IK细胞中的Tregs数量减少,同时,观察到CD8+、CD3+CD5+6细胞增加;DC+C IK组对肺癌细胞系A549、乳腺癌细胞系MCF-7、结肠癌细胞系HCT-8和淋巴瘤细胞系Raji的杀伤活性分别为49.47%、32.78%、40.28%、47.11%,均高于单纯C IK组(P均<0.05);另外,C IK及DC+C IK组TGF-β分泌分别为546 pg/m l±134 pg/m l、489 pg/m l±132 pg/m l,IL-10分别为107 pg/m l±32 pg/m l和92 pg/m l±32 pg/m l,证实经DC诱导后C IK细胞TGF-β和IL-10分泌水平低于DC诱导前;同时,观察到DC+C IK组IFN-γ和IL-6分泌高于单纯C IK细胞(P<0.05)。结论DC细胞可以增强C IK的抗肿瘤活性,而其对Tregs细胞的影响很可能是DC活化C IK的机制之一。     

两种培养基的培养体系对CIK细胞增殖和功能的影响

目的 观察细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)增殖情况,检测CIK细胞的表面分子表型和体外对白血病细胞K562的杀伤作用.方法 通过用H3培养基培养的分别来源于脐带血和患者自体外周血分离的单个核细胞(PBMC),添加重组人γ干扰素(IFN-γ)与CD3单抗,体外诱导CIK细胞,在培养的第7天分别加入H3培养基和T551培养基继续诱导培养至14 d.计数观察CIK细胞增殖能力,流式检测细胞表面CD3、CD56的表达情况,CCK8法检测两组培养基条件下对白血病细胞K562的杀伤效果.结果 动态计数及表型分析结果表明,H3及H3+T551培养的CIK细胞扩增倍数(包括脐带血CIK总细胞数和自体CIK总细胞数)在第14天均分别达到76.9倍、62.3倍;两种培养条件下脐带血CIK细胞中CD3+ CD56+双阳性细胞含量分别是(16.70±2.72)％和(10.80±2.59)％,自体CIK细胞中CD3+ CD56+双阳性细胞含量分别是(11.23±6.64)％和(10.70±6.42)％;体外杀瘤实验表明,当效靶比为5∶1时,H3培养的脐带血CIK细胞杀伤率达到(33.50±9.99)％,显著高于H3+T551培养脐带血CIK细胞的(20.3±6.76)％,差异有统计学意义(P=0.011),而H3和H3+T551培养的自体CIK细胞杀伤率分别是(59.67±27.59)％和(42.13±19.47)％,差异无统计学意义(P=0.080).结论 H3培养的脐带血和自体CIK细胞具有较强的体外抗白血病癌细胞活性,可应用于临床上白血病的过继性免疫治疗.