基质细胞在因细胞体外扩增中的作用及其分？…

造血干／社细胞在细胞因子联合应用条件下,经体外扩增后其功能活性往往受到损伤,而一些研究表明造血基质细胞存在时,可或维持外扩增造血细胞的功能活性,其作用的分子机制目前也已开始研究。     

基质细胞在造血细胞体外扩增中的作用及其分子机制

造血干/祖细胞在细胞因子联合应用条件下,经体外扩增后其功能活性往往受到损伤,而一些研究表明造血基质细胞存在时,可促进或维持体外扩增造血细胞的功能活性,其作用的分子机制目前也已开始研究。基质细胞在造血细胞体外扩增中的作用及其分子机制的阐明,将推动造血细胞体外扩增技术研究及应用的进一步深入。     

前列腺素E1对人类脂肪源性基质细胞体外增殖的影响

背景：近年来脂肪源性基质细胞成为研究与应用的热点之一,但前列腺素E1对脂肪源性基质细胞增殖的作用影响尚未见报道。 目的：观察前列腺素E1对人类脂肪源性基质细胞体外增殖的影响。 方法：从人正常脂肪组织分离培养脂肪源性基质细胞,用5种不同浓度的前列腺素E1处理培养的细胞,其中3×10^-6,6×10^-6,9×10^-6,12×10^-6 mol/L作为实验组,0×10^-6 mol/L作为对照组,观察经不同浓度前列腺素E1处理后细胞的增殖情况。 结果与结论：不同浓度实验组的细胞数量与对照组相比均显著升高,差异有显著性意义(P < 0.05),各实验组内相比,细胞数量增殖无显著性差异(P  > 0.05)。提示前列腺素E1具有促进脂肪源性基质细胞的增殖作用,且前列腺素E1的影响效果无剂量依赖性。     

脂肪基质干细胞和骨髓基质干细胞的体外分化能力

背景：脂肪基质干细胞和骨髓基质干细胞具有很多相似的生物学特性。 目的：比较脂肪基质干细胞和骨髓基质干细胞与受损PC12细胞分别共培养后定向分化能力的差异。 方法：分别分离培养脂肪组织来源和骨髓组织来源的基质干细胞,取第5代细胞进行实验,2种细胞分别与正常或受损PC12细胞培养上清液共培养,或仅单独培养。 结果与结论：脂肪基质干细胞和骨髓基质干细胞均表达较高水平的CD44和CD29,而后者表达的CD45、CD56在前者几乎未检测到。单独培养的2种细胞均表达较高水平的Nanog、Oct4、Sox2,不表达神经元特异性烯醇酶。其中经受损PC12细胞干预的2种细胞Nanog、Oct4、Sox2表达水平显著降低,而脂肪基质干细胞中神经元特异性烯醇酶阳性细胞数更多,提示受损PC12细胞对于脂肪基质干细胞可能具有更强的诱导分化作用。     

神经干细胞克隆在不同细胞外基质上的生长特性

目的：观察不同细胞外基质对培养神经干细胞生长特性的影响。方法：经体外扩增和传代,神经干细胞克隆被接种于多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸和鼠尾胶原形成的细胞外基质上,观察其增殖和迁移特性。结果：未经包被的塑料培养板作为基质时,体积较大的神经干细胞克隆才能贴壁,贴壁后的克隆仍呈球形,在其底部有细胞呈放射状迁出,数量逐渐增多,以梭形为主,细胞排列稀疏;多聚鸟氨酸和多聚赖氨酸作为细胞外基质时,迁移细胞排列密集,形态多样;鼠尾胶原作为细胞外基质时,促贴壁迁移的作用最差。当多聚赖氨酸和鼠尾胶原形成界限时可明显观察到鼠尾胶原对细胞迁移的抑制作用。结论：在各种基质上,克隆体积均可继续增长,但在鼠尾胶原上增长较慢。     

脂肪基质干细胞复合小肠黏膜下层治疗家兔生长板缺损

背景：小肠黏膜下层具有良好的生物相容性,与其主要的胶原成分在进化上的高度保守性及其快速降解性有关。 目的：观察经体外成软骨诱导的脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物用于治疗家兔胫骨近端内侧生长板缺损的疗效。 方法：36只新西兰大耳白兔随机分为3组,均造成右侧胫骨近端内侧生长板50%的缺损。空白组不植入填充物,小肠黏膜下层支架组缺损填充空白小肠黏膜下层支架材料,脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层组填充在体外进行成软骨诱导14 d的脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物。 结果与结论：X射线片测量结果：16周时胫骨近端关节面成角差值,空白组>小肠黏膜下层支架组>脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层组(P均 < 0.05)。胫骨长度差值空白组>小肠黏膜下层支架组>脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层组(P均 < 0.05)。苏木精-伊红染色显示：16周时,空白组生长板骨桥未被吸收,生长板外侧闭合,小肠黏膜下层支架组生长板缺损内骨桥致密,生长板软骨中断,生长板外侧闭合;脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层组生长板为软骨性修复,软骨呈柱状排列,生长板未闭合。提示,体外成软骨诱导分化后的脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物,用于治疗家兔胫骨近端生长板缺损,有效避免了肢体的成角和短缩畸形,并且能够修复生长板软骨。     

体外诱导脂肪干细胞向内皮细胞及成血管的分化

背景：脂肪干细胞作为组织工程中种子细胞的选择,可以诱导为内皮细胞从而有效解决材料血管化困难的难题。 目的：体外观察脂肪干细胞经诱导向内皮细胞转分化的可能性、以及在立体培养基上的血管形成情况。 方法：切取人皮下脂肪,用酶消化法分离和培养脂肪干细胞,将传至第3代或第4代的脂肪干细胞用内皮细胞诱导液、同时在Matrigel三维培养基内诱导培养,观察细胞生长情况及变化。对脂肪干细胞和诱导细胞行免疫组织化学检查CD31的表达。 结果与结论：免疫组织化学检测脂肪干细胞的CD31表达阴性,诱导细胞CD31可见阳性表达。在三维立体培养基内诱导的细胞24 h逐渐迁徙成团,伸出伪足,诱导1周细胞形成网格样交叉,2周形成较长血管,后血管增粗,并出现分叉,CD31阳性表达。因此,脂肪干细胞体外可以被诱导向内皮细胞表型转分化,并形成血管,提示脂肪干细胞可以作为促进组织工程移植物血管化的种子细胞的理想选择。     

脂肪源干细胞向血管内皮细胞的分化

背景：脂肪来源干细胞在体内储备丰富,体外增殖快速,具有多向分化潜能,是目前组织工程种子细胞的研究热点。近年来越来越多的研究表明脂肪干细胞在一定条件下可被诱导分化为内皮细胞,促进血管生成。 目的：观察兔脂肪干细胞体外分离培养及诱导分化为血管内皮细胞的生物学特性。 方法：取兔附睾处脂肪,采用胶原酶消化分离获得脂肪干细胞,体外培养至第3代后加入血管内皮细胞生长因子与碱性成纤维细胞生长因子联合诱导分化,对诱导前后细胞进行形态学观察、生长曲线测定、免疫组织化学染色及流式细胞仪表型检测。 结果与结论：兔脂肪干细胞生长旺盛,第3代兔脂肪干细胞呈成纤维细胞样,生长曲线呈“S”型,15代以内细胞形态未见明显变化。免疫荧光法检测Vimentin阳性,流式细胞仪检测CD44表达阳性,CD31表达阴性;诱导后细胞CD31表达阳性,CD44表达阴性。第3代兔脂肪干细胞向血管内皮细胞诱导分化21 d显微镜下呈铺路石样形态,血管内皮细胞第Ⅷ因子相关抗原染色细胞阳性,透射电镜下可见W-P小体。提示脂肪干细胞在体外可诱导分化为血管内皮细胞,可为组织工程血管提供理想的种子细胞。     

联合诱导兔脂肪源性基质细胞的成肌潜能

背景：成肌种子细胞是构建工程化成肌复合物的基础,如何优化其扩增是过渡到临床应用的核心。 目的：分析将MyoD、转化生长因子β1及5-氮杂胞苷不同模式下联合诱导兔脂肪源性基质细胞体外成肌潜能的变化。 方法：取兔腹部脂肪,采用胶原酶消化法分离获取脂肪源性基质细胞,分别以不同方式进行成肌细胞诱导：5-氮杂胞苷诱导组;MyoD+转化生长因子β1诱导;5-氮杂胞苷+ MyoD+转化生长因子β1联合诱导组;并设空白对照。于诱导第1,4,8,12,16,20,24,28天观察细胞形态学特点,行MTT比色法、流式细胞仪和免疫组织化学检测鉴定细胞,检测Ⅲ型胶原含量。 结果与结论：联合诱导组与其他组相比,细胞生长迅速,16 d增殖达高峰,20 d肌管数量增多,体积增大,排列规则,呈结蛋白强阳性表达,细胞周期显示联合诱导组脂肪源性基质细胞的DNA复制期细胞比例增加,间隙期细胞减少,Ⅲ型胶原含量明显增高,差异有显著性意义。结果提示,多因子联合5-氮杂胞苷模式能有效促进脂肪源性基质细胞向成肌细胞定向分化,细胞增殖显著,是成肌细胞体外诱导的理想方法。     

骨髓基质细胞-成骨细胞复合培养体系的建立

背景：在骨修复和重建过程中,成骨细胞和骨髓基质细胞是主要功能细胞,二者存在着密切的功能联系。 目的：通过骨髓基质细胞-成骨细胞共育体系的建立,观察共育体系中两种细胞之间的功能影响及生物学特点。 方法：原代分离人骨髓基质细胞和人成骨细胞,将2种细胞置于Transwell共育环境中共同培养,建立人骨髓基质细胞-成骨细胞共育体系。分别采用MTT、丫啶橙染色、碱性磷酸酶活性检测等方法初步评价共育体系中两种细胞增殖、凋亡及功能改变情况。 结果与结论：在复合培养体系中,骨髓基质细胞-成骨细胞共育体系能够促进成骨细胞的增殖与碱性磷酸酶的活性,同时抑制骨髓基质细胞的凋亡,促进骨髓基质细胞的趋化聚集。结果提示在复合培养体系中, 骨髓基质细胞能够加速成骨细胞的增殖及成骨活性,另外成骨细胞也可减少骨髓基质细胞的凋亡,并加强其成骨性分化的作用。两者之间具有较为紧密的影响和功能联系。     

Conophylline与尼克酰胺联合诱导脂肪源干细胞为功能性类胰岛细胞

背景：1型糖尿病的胰岛移植治疗一直面临供体来源不足与免疫排斥两大关键问题,寻找一种自体来源的种子细胞通过组织工程方法制备类胰岛组织可以提供充足新型供体、降低异基因供体移植的不良反应。 目的：分析成人脂肪干细胞体外分化为对葡萄糖敏感、可分泌胰岛素的功能性胰岛样细胞团的能力,探索体外制备类胰岛组织的技术路线。 方法：首先分离纯化人体脂肪干细胞,采用新型植物诱导剂Conophylline与其他诱导因子的不同组合将脂肪干细胞诱导分化为胰岛样细胞团,观察不同组合的诱导分化效率,并利用特异性染色、RT-PCR,免疫细胞化学等方法对诱导分化后的细胞团在基因水平与蛋白水平上进行鉴定,最后用ELISA法检测细胞团在不同浓度葡萄糖刺激下胰岛素的分泌情况。 结果与结论：脂肪干细胞具有多能干细胞特性,可诱导分化为具有胰岛素分泌和葡萄糖浓度反应性类胰岛细胞团;Conophylline与尼克酰胺联合诱导可大幅度提高诱导分化效率。     

脂肪源性干细胞的体外分离培养与鉴定

背景：脂肪间充质干细胞来源丰富、取材方便、体外有较强增殖能力并具有多向分化的潜能,有望成为组织工程的种子细胞。 目的：体外分离培养SD大鼠脂肪干细胞并进行鉴定。 方法：取SD大鼠腹股沟区皮下脂肪组织,0.075%I型胶原酶消化分离、培养脂肪源性干细胞,倒置相差显微镜下观察脂肪源性干细胞的细胞形态和增殖特征。取第3代细胞用MTT比色法描绘生长曲线,免疫荧光法鉴定干细胞标志物CD44,含有体积分数10%胎牛血清、地塞米松和胰岛素的DMEM/F12定向诱导成脂分化,油红“O”染色成脂分化鉴定。免疫组化法鉴定向神经细胞诱导分化的结果。 结果与结论：分离出的大鼠脂肪源性干细胞生长曲线呈“S”形,强烈表达干细胞标志物CD44。成脂诱导分化经油红“O”染色呈橘红色。向神经细胞诱导分化后表达神经元标志物神经元特异性烯醇化酶。说明SD大鼠脂肪源性干细胞在体外具有易于分离培养和扩增,表达间充质干细胞相关表型,特定条件下可诱导分化的特点。     

人参皂苷Rb1对体外培养人脂肪干细胞增殖与成骨分化的影响

背景：脂肪干细胞成骨分化受多种因素的影响,中药成骨诱导活性因子在脂肪干细胞研究中有重要意义。 目的：观察人参皂苷Rb1在体外培养条件下对人脂肪干细胞增殖和成骨分化的影响。 方法：体外分离培养人脂肪干细胞,传至第3代后,按2×10³/孔接种至96孔板,分别加入0.5,1.0,2.0,4.0,6.0 μmol/L人参皂苷Rb1培养基200 μL进行培养;设立对照组,仅加入等量普通DMEM培养基。采用XTT比色法测定大鼠脂肪干细胞的生长增殖曲线。通过碱性磷酸酶试剂盒测定细胞碱性磷酸酶活性,放射免疫法检测骨钙素含量,茜素红染色观察钙化结节形成能力。 结果与结论：0.5 μmol/L人参皂苷Rb1可明显促进人脂肪干细胞增殖;随着人参皂苷Rb1浓度的增加,促细胞增殖活性降低,6.0 μmol/L人参皂苷Rb1表现为明显的抑制细胞增殖作用。人参皂苷Rb1呈剂量依赖性促进人脂肪干细胞碱性磷酸酶活性和骨钙素表达。4.0,6.0 μmol/L人参皂苷Rb1诱导钙化结节形成能力优于0.5,1.0和2.0 μmol/L人参皂苷Rb1,对照组人脂肪干细胞未见钙化结节形成。提示人参皂苷Rb1在一定浓度范围内对体外培养条件下的人脂肪干细胞具有促生长增殖作用,但在高浓度时,人参皂苷Rb1对人脂肪干细胞的成骨分化具有促进作用,因此可作为一种良好的成骨诱导活性因子。     

不同部位脂肪源性干细胞的生物学特性比较

背景：大鼠不同部位来源的脂肪源性干细胞在体外培养时的特性是否存在差异目前尚无定论。 目的：比较同一只大鼠不同部位来源的脂肪源性干细胞在体外培养时的生长特性和成脂诱导分化能力的差异。 方法：无菌操作下取F344大鼠腹股沟及腹腔大网膜脂肪组织各5 mL,Ⅰ型胶原酶酶解法分离出脂肪源性干细胞,细胞计数后进行体外培养,观察其形态特征和生长状态,MTT法测定不同部位细胞的倍增时间。取不同部位来源的第2代脂肪源性干细胞进行成脂诱导,诱导14 d进行油红O染色,观察不同部位来源的脂肪源性干细胞的成脂分化能力。 结果与结论：在同一只大鼠内脏大网膜脂肪获得的脂肪源性干细胞数目为(281±10)×107 L-1,明显多于腹股沟皮下脂肪的(85±5)×107 L-1(P < 0.01)。从内脏大网膜脂肪与腹股沟皮下脂肪获得的脂肪源性干细胞分别于第5,6天进入指数增长期;第9,10天到达平台期;倍增时间为50 h和60 h左右。传代后的细胞生长分化活跃,呈成纤维细胞样,成脂诱导后,大网膜组织来源的脂肪源性干细胞的成脂诱导分化率明显高于腹股沟组织来源的脂肪源性干细胞[(38.90±2.86)%,(35.30±3.29)%,P < 0.01]。可见同一只大鼠不同部位脂肪组织分离得到的脂肪源性干细胞数目不同,体外成脂诱导分化能力亦存在差异。     

雌激素影响冻存肾脂肪囊来源脂肪间充质干细胞的成脂分化

背景：雌激素对脂肪干细胞向脂肪细胞诱导分化会有负向调节作用,但对长期深低温保存的肾脂肪囊来源脂肪间充质干细胞向脂肪细胞分化的效果尚未见报道。 目的：探讨雌激素对长期深低温保存的及新鲜提取的肾脂肪囊来源脂肪间充质干细胞成脂分化能力的影响。 方法：将长期深低温保存后复苏的及新鲜提取的第3代肾脂肪囊来源脂肪间充质干细胞分为4组进行成脂诱导分化,新鲜+雌激素组和冻存+雌激素组诱导时添加10-7 mol/L雌激素,新鲜组和冻存组不添加。成脂诱导分化14 d进行油红O染色及成脂量定量检测。 结果与结论：长期深低温保存后复苏的第3代肾脂肪囊来源脂肪间充质干细胞与新鲜提取的细胞形态和排列无差异;长期深低温保存后复苏的与新鲜提取的第3代肾脂肪囊来源脂肪间充质干细胞表面抗原分子CD29、CD44均呈阳性,CD31均呈阴性表达。成脂诱导后可观察到细胞内有脂滴形成,油红O 染色呈阳性。在成脂诱导分化14 d对各组进行成脂量比较,新鲜组与新鲜+雌激素组,冻存组与冻存+雌激素组的吸光度之间比较,差异有显著性意义,但新鲜组与冻存组之间差异无显著性意义。结果表明：小剂量雌激素可抑制长期深度低温保存后复苏的肾脂肪囊来源脂肪间充质干细胞的成脂分化;长期深低温保存后复苏的与新鲜提取的第3代肾脂肪囊来源脂肪间充质干细胞在成脂诱导方面无显著性差异。     

重组人骨形态发生蛋白2调节人脂肪间充质干细胞表达血管内皮生长因子

背景：重组人骨形态发生蛋白2可以促进组织工程骨血管化,但是对于其作用于人体细胞时的生物学规律不明确。目前对于重组人骨形态发生蛋白2调节人体细胞血管内皮生长因子表达的规律国内还未见相关报道。 目的：从基因和蛋白水平观察比较不同时间点重组人骨形态发生蛋白2诱导下人脂肪间充质干细胞血管内皮生长因子的表达。 方法：从成人脂肪组织中分离培养脂肪间充质干细胞,取第3代细胞用于实验,分为诱导组和对照组。诱导组采用终浓度为100 μg/L重组人骨形态发生蛋白2诱导人脂肪间充质干细胞,分别诱导3,6,12,18,24,36,48 h后收集样本,用RT-PCR和ELISA分别从基因水平和蛋白水平检测血管内皮生长因子的表达,并与空白对照组比较。 结果与结论：重组人骨形态发生蛋白2调节人脂肪间充质干细胞表达血管内皮生长因子具有时间依赖性,在不同时间点血管内皮生长因子表达量不同。与空白对照组相比,3-6 h时间段重组人骨形态发生蛋白2抑制血管内皮生长因子表达(P < 0.05),18-24 h时间段重组人骨形态发生蛋白2促进血管内皮生长因子表达(P < 0.05),当利用重组人骨形态发生蛋白2促进组织工程骨血管化时这两个时间段应当引起特别关注。     

星形胶质细胞瘤干细胞的体外分离、培养与鉴定

背景：肿瘤干细胞理论认为肿瘤中存在一小部分具有无限增殖潜能和自我更新能力,能够分化为成熟细胞表型的干细胞样细胞,对肿瘤发生、增殖、侵袭起关键作用。 目的：建立体外分离、培养与鉴定星形胶质细胞瘤干细胞的方法。 方法：采用直接培养法分离培养星形胶质细胞瘤干细胞。参照神经干细胞培养条件,进行体外培养。观察其增殖、分化并进行巢蛋白、CD133免疫细胞化学鉴定和诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白及O4免疫细胞化学鉴定。 结果与结论：培养7-10 d,可形成大量悬浮生长巢蛋白及CD133免疫阳性的神经球,经诱导分化后细胞呈神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白或O4免疫阳性。提示星形胶质细胞瘤中存在具有神经干细胞特性的肿瘤干细胞。CD133和巢蛋白是星形胶质细胞瘤干细胞重要的表面标记,可以用于星形胶质细胞瘤干细胞的分离。