胚胎小鼠纹状体神经干细胞的体外培养和分化

目的：探索胚胎小鼠纹状体神经干细胞(striatum-neural stem cells，^strNSC)的体外培养和分化鉴定方法。方法：无菌条件下分离E15天胚胎小鼠纹状体，制成单细胞悬液，在bFGF和B27存在的培养基中培养扩增，通过免疫细胞化学显色鉴定神经干细胞及其子代细胞的分化方向。结果：培养的部分细胞在B27和bFGF存在的无血清培养基中可以在体外分裂增殖，同时表达神经干细胞特异性抗原nestin，并在撤出B27和bFGF的有血清培养基中向神经细胞和神经胶质细胞分化。结论：胚胎小鼠纹状体存在具有多分化潜能的神经干细胞，它们能在体外培养、传代和自然分化．     

人胚胎纹状体区神经干细胞体外生物学特性

目的探讨人胚胎纹状体区神经干细胞在体外的生物学特性。方法从16～20周人胚胎纹状体区分离培养神经干细胞,在体外进行传代、分化,应用免疫组织化学荧光染色等方法,对此区神经干细胞在体外增殖和分化等情况进行研究。结果纹状体区神经干细胞在体外原代培养扩增1月内分裂增殖速度快,在含有EGF和bFGF的培养基中生长最为良好,平均倍增时间为3～4d。分化培养后可以形成各种神经细胞,在原代培养后2周分化情况好,分化为神经元比例高,约占50％左右,在原代培养8周以后分化为神经元的比例下降,约占20％左右。结论人胚胎纹状体区的神经干细胞在体外有较强的自我更新和增殖能力,并表达了干细胞的原始特征,在体外传代过程中,增殖速度随着时间不断下降,其分化为各种神经细胞的能力也不同。培养基中的有丝分裂原对于神经干细胞的增殖和分裂的影响不同。神经球并非均质的,内部仅有部分细胞在分裂增殖。     

体外诱导人胚胎干细胞向神经细胞分化的研究进展

<正>胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES)是从着床前胚胎内细胞团(inner cell mass,ICM)中分离出来的能在体外培养的一种全能干细胞。它具有在体外可以大量增殖并保持未分化状态和在一定条件下能向内、中、外三个胚层组织和细胞分化的生物学特性。胚胎干细胞也易于进行基因改造操作和制造嵌合体动物,从而成为细胞与个体之间的桥梁以及临床移植治疗新的细胞来源。1998年Thomoson等与shanablott等分别建立了来源于人类胚细胞群和原始生殖细胞的人胚胎干细胞系,科学家们看到了在体外培育所需的组织细胞以取代患者体内的病损组织细胞来治疗多种疑难病的曙光。     

人胚胎纹状体组织提取液对人胚胎神经干细胞分化方向的影响

目的对人胚胎神经干细胞(NSCs)进行分离、培养,研究纹状体组织提取液对神经干细胞分化方向的影响。方法从临床因故引产的人胚胎(胎龄8~16周)海马组织中分离、培养人胚胎神经干细胞,将其分离纯化并进行抗Nestin染色鉴定后分为两组进行诱导分化实验。A组:以基础培养基作为对照组;B组:基础培养基 人胚胎纹状体组织提取液(50ml/L)。分化的第7d取出细胞爬片,分别进行抗神经特异性烯醇化酶(NSE)免疫细胞化学染色,抗5-羟色氨(TH)免疫荧光化学染色和RT-PCR方法检测TH-mRNA的表达。结果培养的海马细胞经抗Nestin染色后呈Nestin阳性,证明为神经干细胞。诱导分化后对照组与实验组的NSE阳性细胞率分别为(21.89±2.17)%和(23.50±1.60)%,两组比较结果无统计学差异(P>0.05)。TH阳性细胞率分别为(0.53±0.17)%和(7.38±0.84)%,两组比较有统计学差异(P<0.05)。RT-PCR检测结果表明,TH-mRNA在对照组中无明显表达,纹状体组织提取液组神经干细胞分化后,TH-mRNA表达明显,两组比较有统计学差异(P<0.05)。结论在体外培养中,人胚胎纹状体组织提取液对神经干细胞向神经元分化无明显促进作用,但能促进人胚胎神经干细胞向多巴胺能神经元分化。     

新生小鼠海马神经干细胞体外培养条件下的增殖与分化

背景：神经干细胞移植可用于中枢神经损伤的临床治疗。 目的：观察新生小鼠海马神经干细胞在体外培养条件下的增殖和分化。 方法：从新生昆明小鼠海马取材,采用机械分离法对原代细胞进行无血清培养,采用机械法复合酶消化法对原代细胞进行传代,以体积分数为10%胎牛血清诱导分化。免疫荧光行巢蛋白、β-微管蛋白Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白染色,对培养的细胞进行鉴定。CCK-8法检测神经干细胞增殖能力。 结果与结论：从新生小鼠海马分离得到的细胞具有连续传代形成克隆球的能力,克隆球呈巢蛋白免疫反应阳性;加入胎牛血清可诱导分化为β-微管蛋白Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞。提示实验成功建立了体外培养新生小鼠海马组织分离和培养神经干细胞的方法,培养的神经干细胞在体外培养条件下保持着自我增殖和分化的潜能。     

人胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

目的研究人胚胎神经干细胞的培养条件及体外分化情况。方法将新鲜分离的胚胎(自然流产胎儿4~6周,经志愿者知情同意)无菌条件下取海马,采用无血清培养基进行培养,原代培养的细胞增殖成神经干细胞球,倒置显微镜观察细胞的形态学,并用免疫荧光方法对神经干细胞进行自我更新能力(Brd U)的鉴定及特异性抗原Nestin的检测。结果培养5~7d的神经干细胞球呈桑葚样悬浮生长,呈明显的Brd U阳性反应,其具有增殖能力;神经干细胞表达了Nestin抗原阳性。结论人胚胎神经干细胞具有神经干细胞的基本特征,可进一步用于基础及临床研究。     

人胚胎干细胞体外培养和扩增的研究进展

体外维持人胚胎干细胞未分化的增殖状态受细胞生长环境和内源性调节因子的控制。本文阐述了目前体外培养和扩增人胚胎干细胞细胞的各种系统,分析了影响细胞增殖和不分化的因素及其信号转导机制,指出了为临床细胞替代治疗疾病提供细胞来源的人胚胎干细胞培养系统的发展趋势。     

小鼠胚胎干细胞的生物学特性和体外诱导分化进展

小鼠胚胎干细胞可在体外无限增殖,且具有多向分化潜能,已被广泛用于克隆动物制作、转基因动物生产、动物医学模型建立、人类基因的功能研究、真核细胞基因表达与调控的研究、细胞分化机制的探索以及细胞、组织和器官的修复与移植等领域,具有广阔的应用前景.     

小鼠胚胎干细胞的生物学特性和体外诱导分化进展

小鼠胚胎干细胞可在体外无限增殖 ,且具有多向分化潜能 ,已被广泛用于克隆动物制作、转基因动物生产、动物医学模型建立、人类基因的功能研究、真核细胞基因表达与调控的研究、细胞分化机制的探索以及细胞、组织和器官的修复与移植等领域 ,具有广阔的应用前景 .     

小鼠胚胎干细胞来源的神经干细胞的稳定传代体系探索

目的探讨体外诱导、获取均一的神经干细胞群(NSCs)的有效方法,并建立神经干细胞体外稳定传代扩增体系。方法首先采用无血清的诱导培养基贴壁诱导mESCs形成神经上皮祖细胞(NPCs)。然后将经添加表皮生长因子(EGF)和成纤维细胞生长因子-2(FGF2)的无血清培养基短暂悬浮培养后的NPCs再贴壁培养,诱导形成NSCs。通过细胞系46C监测NPCs的形成,同时对分化细胞进行定量PCR和免疫荧光染色,在不同水平检测细胞分化效果。结果 mESCs神经诱导5 d出现大量Sox1+的NPCs;NPCs悬浮培养后,进一步诱导可得到形态均一的NSCs。第2代和第6代NSCs的神经干细胞标志定量PCR检测结果为:Pax6、Nestin、Mash1、BLBP高表达。第8代NSCs免疫荧光染色显示90%以上的细胞均为Nestin、RC2和Pax6阳性。结论成功诱导mESC生成神经干细胞群,并且可以在体外连续稳定的传代。     

体外直接诱导人胚胎干细胞向神经细胞分化的研究

目的探讨体外直接诱导HSF6人胚胎干细胞（humanem bryonic stem cells,hESCs）分化为神经细胞的方法。方法采用直接的方法,在1%血清培养条件下,顺序添加bFGF、RA和Forskolin,诱导HSF6人ESCs分化为神经细胞。结果细胞发生神经样形态学改变,免疫荧光细胞化学分析结果显示,分化细胞表达神经干细胞特异性标志分子——巢蛋白（nestin）,以及神经元标志分子——β微管蛋白Ⅲ（neuron-specific class Ⅲ beta-tubulin,TuJ1）。实验组nestin阳性细胞数占（95.2±3.03）%,明显高于未添加诱导因子组的（31.6±4.93）%,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论本研究直接诱导hESCs分化为神经细胞,减少了常规经胚胎体（embryoid body,EB）的诱导方法而产生其它胚层细胞的机会,为进一步探索hESCs源性神经细胞的功能,以及为细胞替代治疗提供高纯度的hESCs源性神经细胞奠定了基础。     

乳鼠肌源性干细胞向许旺样细胞的诱导分化

背景：有证据显示,肌源性干细胞能够促进肌纤维的再生,增强再生肌组织的功能,并具有分化为神经外膜组织细胞和具有许旺细胞表型细胞的潜能。 目的：分析许旺细胞条件培液诱导小鼠乳鼠源肌源性干细胞向许旺细胞的分化,探讨其作为神经组织工程的种子细胞的可行性。 方法：取C57BL/6乳鼠四肢骨骼肌,采用改良的Preplate技术纯化培养肌源性干细胞,利用抗体Desmin和Sca-1对纯化后的细胞进行免疫细胞化学鉴定。采用许旺细胞条件培液诱导其向许旺细胞分化,并行许旺细胞特异性抗体S100β、P75NTR免疫细胞化学鉴定。 结果与结论：从小鼠骨骼肌中分离得到肌源性干细胞,能在体外稳定增殖传代,Desmin和Sca-1免疫细胞化学染色阳性。肌源性干细胞经体外诱导分化后部分细胞S100β、P75NTR染色阳性。说明应用改良的Preplate方法,可从新生小鼠骨骼肌中分离得到肌源性干细胞;采用许旺细胞条件培液能将其诱导分化为许旺样细胞,有可能成为神经组织工程神经较理想的许旺细胞替代物。     

人胰岛素样生长因子1基因转染脂肪源性干细胞的效应

背景：人胰岛素样生长因子1基因对脂肪源性干细胞的增殖和分化也可能会产生有效作用。 目的：验证人胰岛素样生长因子1基因转染对体外培养的脂肪源性干细胞的效应。 方法：构建含人胰岛素样生长因子1基因的双顺反子真核表达载体pIRES2-EGFP-hIGF-1,利用阳离子脂质体Lipofectamine 2000介导转染体外培养的人脂肪源性干细胞。观察基因转染后细胞增殖及形态的变化,倒置荧光显微镜观测标记基因增强绿色荧光蛋白的表达并计算转染效率,酶联免疫吸附试验检测培养上清中人胰岛素样生长因子1的浓度,免疫组织化学染色及RT-PCR检测人胰岛素样生长因子1的表达,流式细胞仪检测转染前后细胞周期的变化。 结果与结论：测序及酶切证实真核表达载体pIRES2-EGFP-hIGF-1构建正确。体外培养的脂肪源性干细胞为多种形态并存,转染后6 h检测到有EGFP的表达,至60 h达到高峰,转染效率为(16±3)%。细胞上清中人胰岛素样生长因子1的浓度在60 h达到22.65 μg/L。免疫组织化学染色及RT-PCR均检测到人胰岛素样生长因子1的表达。转染后的细胞分裂增殖加快,细胞群体倍增时间缩短,S期细胞比例增多。证实人胰岛素样生长因子1基因可有效转染脂肪源性干细胞并表达人胰岛素样生长因子1蛋白质,同时可促进细胞增殖。     

X染色体倾斜失活人胚胎干细胞的拷贝数变异

背景：倾斜性与随机X染色体失活的人胚胎干细胞拷贝数变异是否存在差异不清楚。 目的：在全基因组水平分析倾斜性X染色体失活的人胚胎干细胞的拷贝数变异情况,分析其涵盖基因及其对细胞功能产生的影响。 方法：3株倾斜性X染色体失活细胞为研究组,两株随机X染色体失活细胞为对照组。运用美国Affymetrix公司Cytogenetics Whole-Genome 2.7M 芯片对其进行全基因组拷贝数变异分析,数据经ChAS软件、OMIM等工具分析,在3株倾斜性X染色体失活细胞中寻找相同拷贝数变异区域及其涵盖基因。 结果与结论：①研究组中大于50 kb的拷贝数变异数均超过130个,高于对照组的平均36个,两组中拷贝数变异改变均以重复为主(> 70%)。②研究组中共发现9个共同拷贝数变异区域,分布于1q22、1p34.1、6q16.3、7q31.32、11q13.1、16q12.2、19p13.12、Xp22.33及Xq26.2,均为3个拷贝的重复,总共涵盖19个基因。对照组中这些区域及基因均为正常2个拷贝。③拷贝数变异涵盖基因多与DNA及核苷酸结合等功能相关,Xq26.2区域的GPC3基因突变与倾斜性X染色体失活可能有关联。结果表明倾斜性X染色体失活细胞相对随机失活细胞具有更多的微小基因组改变,拷贝数变异涵盖的重要基因可能对人胚胎干细胞功能产生不利影响。     

无血清培养体系原代培养脐带间充质干细胞

背景：以含血清培养基培养的脐带间充质干细胞,存在着进一步应用的障碍。 目的：建立无血清培养体系原代培养脐带间充质干细胞。 方法：取脐带华通氏胶(Wharton’s Jelly),采用机械法将组织胶切碎,1-3 mm3大小,分别培养到含胎牛血清完全培养液中以及无血清培养液中。培养第11,14,17天收获细胞并进行相关检测。在符合2006年制定的干细胞最低评估标准的基础上,以集落形成单元指标评估何种培养体系能获得较多高质量的原代细胞。 结果与结论：无血清培养体系相对于经典的含血清的培养体系而言,细胞生长速度更快。另外,培养第11天,集落形成实验表明无血清培养体系下能获得更多的集落。因此,无血清培养体系可以保持间充质干细胞的特性,为替代含血清培养体系进行脐带间充质干细胞原代培养提供了可能。     

以4种基因诱导产前诊断绒毛细胞建立诱导性多能干细胞

背景：诱导性多能干细胞因具有多能性特征,可以诱导分化为特定的细胞,包括神经细胞、造血细胞等。 目的：建立产前诊断绒毛细胞来源的诱导性多能干细胞。 方法：运用反转录病毒介导4种基因hOct4、hSox2、hc-Myc、hKlf4诱导产前诊断绒毛细胞,对建立的诱导性多能干细胞进行多能性、体内外分化能力、核型等鉴定。 结果与结论：建立的诱导性多能干细胞能维持自我更新状态,在蛋白和mRNA水平上高表达全能性的标志基因,具有体内、外分化潜能;在体外长期培养能维持正常核型。说明4种全能性基因转入绒毛细胞可获得具有多能性的诱导性多能干细胞,这为胎儿的细胞自体移植治疗提供理想来源,为产前诊断疾病机制研究提供很好的细胞模型。     

大鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离培养与鉴定

背景：内皮祖细胞因其分离与培养的方法各不相同,在实验中难以重复。 目的：探讨大量获取骨髓源性内皮祖细胞分离与培养的方法。 方法：通过密度梯度离心法从4周龄SD大鼠骨髓中分离单个核细胞,使用EGM-2 MV培养基进行诱导培养,采用形态学特征观察、摄取Dil-Ac-LDL与结合FITC-UEA-1实验、免疫荧光化学鉴定其表面抗原CD133与VEGFR2等方法对其进行鉴定,并通过管腔形成实验观察形成管腔的能力。 结果与结论：①形态学观察：分离的骨髓单个核细胞经诱导培养后,在生长的早期(8 d左右)、晚期(15 d左右)其细胞形态有一定差异,早期以纺锤形、三角形、圆形细胞多见,晚期以圆形、短梭形细胞多见。②摄取Dil-Ac-LDL与结合FITC-UEA-1实验：显示8,21 d的细胞均为阳性。③免疫荧光化学染色：8 d的细胞表达CD133、VEGFR2。④管腔形成实验：在Matrigel基质上15 h左右能够生成血管样结构。结果表明：利用密度梯度离心法分离大鼠骨髓单个核细胞后以EGM-2 MV进行诱导培养,经过鉴定证明获得的细胞符合内皮祖细胞的特征。这种方法能够简单、快速、可靠、大量地获取内皮祖细胞。     

神经干细胞培养及其影响因素

背景：神经干细胞移植治疗是中枢神经系统损伤性、难治性疾病研究的热点。如何有效提高神经干细胞存活率、克隆形成率将是其应用的重要基础和前提。 目的：探讨影响神经干细胞培养质量的可能因素,为神经干细胞的基础和临床应用研究提供参考。 方法：①神经干细胞分离和培养：分离出生24 h内SD大鼠的大脑,剪碎离心后以1×10⁸ L^-1的浓度接种,经含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基预培养4 h后改用无血清条件培养基(DMEM/F12,碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、B27)培养,2 d或3 d换液1次,6 d时传代。②神经干细胞鉴定：倒置显微镜下观察细胞形态及生物学特性;免疫组化检测第3代细胞神经巢蛋白表达和诱导分化后神经元特异性烯醇化酶和神经胶质酸性蛋白的表达。 结果与结论：出生24 h的新生大鼠可获得足量的神经干细胞;血清预培养可提高神经干细胞的增殖和存活率;免疫组化结合血清诱导分化可对培养的神经干细胞进行定性鉴定。取材时间、细胞接种密度、传代时间、细胞因子、血清等多种因素都将影响神经干细胞的培养质量。     

体外定向诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛样细胞

背景：人脐带间充质干细胞具有获取容易、免疫原性低等优点,目前尚缺乏体外诱导其分化为胰岛样细胞的成熟方案。 目的：探讨人脐带间充质干细胞在体外一定条件下分化为胰岛样细胞的可能性。 方法：无菌条件下分离培养人脐带间充质干细胞,细胞传3代后,采用两步法诱导其向胰岛样细胞分化：第1步,加入含100 μg/L β-神经生长因子,4 nmol/L ActivinA,10 mmol/L 尼克酰胺,25 μg/L表皮生长因子,体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养7 d;第2步,将诱导液换为含10 mmol/L尼克酰胺,10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子,1%胰岛素-转铁蛋白-硒的DMEM/F12培养基,诱导时间为14 d。对照组单纯加入DMEM/F12培养基进行培养。 结果与结论：诱导2周后脐带间充质干细胞开始聚集成团,诱导3周后,葡萄糖刺激试验阳性、PDX-1和Insulin基因表达。而对照组细胞无胰岛素分泌,胰岛细胞相关基因表达阴性。实验成功地将脐带间充质干细胞诱导成了胰岛样细胞。