重组质粒pEGFP-N2/XPD和Pifithrin-α对肝癌细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨人着色性干皮病基因D(xeroderma pigmentosum D,XPD)和P53对肝癌细胞HepG2.2.15增殖凋亡及P21等基因表达的影响.方法 用脂质体转染法将空载质粒pEGFP-N2和重组质粒pEGFP-N2/XPD转染HepG2.2.15,然后给予20 μmol/L的Pifithrin-α(P53抑制剂)孵育24 h.实验分为5组:空白对照组、pEGFP-N2组、pEGFP-N2/XPD组、pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α组和Pifithrin-α组.用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白报告基因表达情况;用RT-PCR和Western blot检测XPD、P53、磷酸化P53(phosphorylated P53,p-P53)、P21和乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)的表达;用MTT法检测细胞活力;用流式细胞仪检测凋亡率.结果 在荧光显微镜下,可在转染了空载质粒pEGFP-N2和重组质粒pEGFP-N2/XPD的细胞中观察到绿色荧光,即转染成功;RT-PCR和Western blot检测发现,重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染使XPD表达增高(P＜0.001);XPD表达升高使P53、p-P53(ser-15)、P21表达增高,同时使得HBx表达降低,而Pifithrin-α能抑制XPD这一作用(P＜0.001).MTT结果显示,XPD表达升高抑制了细胞活力,而Pifithrin-α能抑制XPD减弱细胞活力的作用(P＜0.001).流式细胞仪结果显示,XPD表达增高引起了细胞凋亡率增加,而Pifithrin-α能抑制XPD诱导细胞凋亡的作用(P＜0.001).结论 XPD能通过P53通路抑制肝癌细胞增殖并促进其凋亡,上调P21的表达以及下调HBx的表达.     

11,12-脱水-二(2-氯乙基)氨基-3,19-环磷酸酯穿心莲内酯抗胃癌细胞增殖、侵袭迁移的机制研究

目的研究脱水穿心莲内酯衍生物[11,12-脱水-二(2-氯乙基)氨基-3,19-环磷酸酯穿心莲内酯]抑制胃癌SGC7901细胞增殖、侵袭及迁移的作用,并探讨其可能的作用机制。方法取SGC7901细胞,加入11,12-脱水-二(2-氯乙基)氨基-3,19-环磷酸酯穿心莲内酯中,分别设置20、40、60、80和100μmol·L-1 5个药物浓度组;不加11,12-脱水-二(2-氯乙基)氨基-3,19-环磷酸酯穿心莲内酯的单纯细胞为空白对照组,分别置于培养箱孵育24、48、72h;采用MTT法检测细胞增殖与细胞活力;采用Transwell小室测定24h后SGC7901细胞的侵袭能力,并通过蛋白免疫印迹(Western blot)法检测48h细胞增殖与迁移相关蛋白Akt、p-AKT、JNK、p-JNK、MMP-2、MMP-9的表达情况。结果与空白对照组相比:20、40、60、80和100μmol·L-1 5个药物浓度组能明显抑制SGC7901细胞增殖,并呈时间和浓度依赖性(P<0.01)。空白对照组迁移和侵袭能力无显著变化,11,12-脱水-二(2-氯乙基)氨基-3,19-环磷酸酯穿心莲内酯(40μmol·L-1组)处理SGC7901细胞迁移和侵袭能力较空白对照组明显减弱(P<0.01)。采用11,12-脱水-二(2-氯乙基)氨基-3,19-环磷酸酯穿心莲内酯(40μmol·L-1)处理SGC7901细胞48h后,可明显抑制p-AKT、p-JNK、MMP-2及MMP-9的表达水平。结论 11,12-脱水-二(2-氯乙基)氨基-3,19-环磷酸酯穿心莲内酯可降低胃癌SGC7901细胞的增殖、侵袭和迁移能力,其作用机制可能是通过抑制p-AKT、p-JNK、MMP-2、MMP-9蛋白的表达。     

脑心清片对脂多糖诱导的BV-2 细胞的抗炎及抗凋亡作用

目的：通过研究脑心清片（NXQ）对脂多糖（LPS）诱导的小胶质细胞（BV-2）的炎症因子及凋亡细胞的表达作用,探讨脑心清片对脑卒中的抗炎及抗细胞凋亡的作用。方法：采用LPS 诱导的BV-2 细胞作为体外神经炎症模型,用脑心清片进行干预,用ELISA 检测促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α的含量水平;采用Western Blot 法检测IL-6、IL-1β和TNF-α、p-Akt、p-Erk、Bax、Bcl-2 的蛋白表达水平。结果：LPS 刺激BV-2 细胞24 h 之后,IL-6、IL-1β和TNF-α炎症因子表达水平明显升高（P<0.01）,NXQ 预处理后,IL-1β含量在10、20 μmol·L-1 时相对于LPS 处理组均有显著性的差异（P<0.05,P<0.05）,IL-6、TNF-α含量在20 μmol·L-1 时相对于LPS 处理组均有统计学意义（P<0.05）;LPS 刺激BV-2 细胞24 h 之后,IL-6、IL-1β和TNF-α蛋白表达水平明显升高（P<0.01）,NXQ 预处理后,能呈现浓度依赖性的降低这些蛋白的表达水平,并且在10、20 μmol·L-1 时相对于LPS 处理组均有显著性的差异（P<0.05,P<0.01）;LPS 刺激BV-2 细胞24 h 之后,p-Akt、p-Erk 蛋白表达水平明显降低（P<0.01）,NXQ 预处理后,能呈现浓度依赖性的升高这些蛋白的表达水平,并且在10、20 μmol·L-1 时相对于LPS 处理组均有显著性的差异（P<0.01,P<0.01）;LPS 刺激BV-2 细胞24 h 之后,促凋亡蛋白Bax 表达水平明显升高（P<0.01）,NXQ 预处理后,Bax 蛋白表达水平下降,
并且在20 μmol·L-1 时相对于LPS 处理组有统计学意义（P<0.05）。LPS 刺激BV-2 细胞24 h 之后,抗凋亡蛋白Bcl-2 表达水平明显降低（P<0.01）,NXQ 预处理后,Bcl-2 蛋白表达水平呈现浓度依赖性的升高,并且在10、20 μmol·L-1 时相对于LPS 处理组均有统计学意义（P<0.05,P<0.05）。结论：脑心清片对脂多糖诱导的小胶质细胞产生的炎症和毒性具有一定的调节作用,通过调节炎症因子的表达和激活Akt/Erk 通路,具有抗炎和抗细胞凋亡作用,进一步阐明了脑心清片抗脑卒中的作用机理。     

曲前列环素通过下调Erk磷酸化水平抑制血小板衍生生长因子诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖

目的: 探讨曲前列环素(Trep)对血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PAMSCs)增殖的影响及其潜在的机制。方法: 体外培养大鼠PASMCs,实验分2阶段进行。第1阶段将细胞分为4组：对照组、PD98059(Erk磷酸化抑制剂)组、PDGF组和PDGF+ PD98059组;第2阶段也分为4组：对照组、Trep组、PDGF组和PDGF+Trep组。PD98059组用50 μmol·L-1 PD98059处理,Trep组用5 μmol·L-1 Trep处理,PDGF组均用20 μg·L-1 PDGF处理, PDGF+PD98059组用50 μmol·L-1 PD98059+20 μg·L-1 PDGF共处理,PDGF+Trep组用5 μmol·L-1 Trep和20 μg·L-1 PDGF共处理。24 h后光镜下观察细胞形态;MTT法测定PAMSCs增殖活性;蛋白质印迹法测定各组细胞内增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、p-Erk1/2及t-Erk1/2蛋白的相对表达量,并计算p-Erk/t-Erk比值。结果： 第1阶段：PDGF组细胞密度、细胞增殖活性、PCNA表达量及p-Erk/t-Erk比值均明显高于对照组(P均<0.05);PDGF+ PD98059组细胞增殖活性、PCNA表达量及p-Erk/t-Erk比值明显低于PDGF组(P均<0.05)。第2阶段：PDGF组细胞密度、细胞增殖活性、细胞内PCNA表达量及p-Erk/t-Erk比值明显高于高于对照组;PDGF+Trep组细胞密度、细胞增殖活性、PCNA表达量及p-Erk/t-Erk比值明显低于PDGF组(P<0.05)。结论： 曲前列环素通过可抑制血小板衍生生长因子诱导的大鼠PASMCs增殖,与下调Erk1/2磷酸化水平有关。     

人剪切修复基因XPD对肝癌细胞中p8/TTDA基因的调控作用

目的 探讨人剪切修复基因XPD对p8/TTDA基因的调控作用.方法 用pEGFP-N2/XPD重组质粒、pEGFP-N2空载质粒分别稳定转染人肝癌细胞SMMC-7721,并用具有相同遗传背景和代数的SMMC-7721细胞作为空白对照.用RT-PCR、Western blot法检测转染前后p8、XPD、p53、c-myc表达量的变化,四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察细胞增殖活力.结果 (1)RT-PCR检测示:p8 mRNA在人肝癌细胞SMMC-7721是低表达的,稳定转染野生型XPD后,p8 mRNA和XPD mRNA表达量明显增高(P<0.001).稳定转染重组质粒细胞组p53 mRNA表达量亦明显增高(P<0.05),c-myc mRNA表达量则明显下降(P<0.001).(2)Western blot法检测示:p8蛋白在人肝癌细胞SMMC-7721是低表达的.稳定转染野生型XPD后,p8蛋白、XPD蛋白、p53蛋白表达量明显增高(P<0.05),c-myc蛋白表达量则明显下降,差异有统计学意义(P<0.001).(3)MTT检测示:稳定转染重组质粒细胞组细胞增殖率明显减弱(P<0.001).结论 人剪切修复基因XPD可调控p8/TTDA基因的表达.野生型XPD转染后亦可上调p53表达,下调c-myc表达,从而在分子途径上抑制SMMC-7721细胞增殖,促进其凋亡.     

矢车菊黄素诱导A549细胞凋亡及机制研究

目的研究矢车菊黄素对A549细胞增殖及凋亡的影响及其机制。方法采用MTT法测定A549细胞增殖,Hochest染色检测细胞凋亡,流式细胞仪分析细胞凋亡率及细胞周期,Western blot方法检测细胞中NF-κB P65蛋白的表达。结果矢车菊黄素剂量依赖性抑制A549细胞的增殖,半数抑制浓度(IC50)值为0.67μmol·L-1;剂量依赖性诱导A549细胞凋亡,0.15、0.30μmol·L-1矢车菊黄素处理时诱导细胞发生G1期阻滞;剂量依赖性上调A549细胞中NF-κB P65的表达。结论矢车菊黄素能诱导A549细胞的凋亡,其促凋亡作用可能与NF-κB信号通路激活有关。更多还原     

pEGFP-N1脂质体转染方法的优化及其应用

目的: 应用脂质体介导的转染方法将pEGFP-N1转染入Fisher大鼠甲状腺滤泡上皮细胞中,并获得较佳的优化方案,阐明该优化条件在转染其他目的基因时的适用性。方法: 分别选取不同配比的质粒和脂质体,将pEGFP-N1转入Fisher大鼠甲状腺滤泡上皮细胞。转染后36h,倒置荧光显微镜和流式细胞术检测细胞中增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达情况和转染效率;台盼蓝染色法检测细胞存活率,以此获得优化的转染条件。同时将pEGFP-Aquaporin2、pEGFP-Aquaporin4和pEGFP-Aquaporin5分别以上述条件转染,并获取相应优化的转染条件。结果: 在质粒质量固定的条件下,随着脂质体质量的增加,其转染效率和细胞存活率升高;但是当质粒:脂质体>1:4时,转染效率和细胞存活率下降。在质粒和脂质体比例固定而质量增加时,其转染效率和细胞存活率下降;当质粒:脂质体>3.2μg:12.8μL时,转染效率降低。应用脂质体介导的方法转染pEGFP-N1和转染pEGFP-Aquaporin2、pEGFP-Aquaporin4和pEGFP-Aquaporin5时,在质粒与脂质体的配比为1:4(3.2μg:12.8μL)时,转染效率达最高。结论: 在应用脂质体介导的目的基因转染时,pEGFP-N1优化的转染条件具有较为广泛的适用性,可用作后续目的基因高效转染优化条件。     

外源性PUMA对非小细胞肺癌A549细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨外源性p53上调凋亡调制因子(PUMA)对非小细胞肺癌A549细胞增殖、凋亡的影响。方法将肺癌A549细胞分为Control组、空载体组、PUMA组(转染pCEP4-(HA)2-PUMA质粒),DDP组(10μg·mL-1)和PUMA+DDP组(转染pCEP4-(HA)2-PUMA质粒,加10μg·mL-1顺铂)5个组。细胞生存率和凋亡率分别用MTT法和流式细胞仪检测,细胞PUMA、Bax及Bcl-2蛋白表达水平采用Western blot方法检测。结果与Control组比较:PUMA组、DDP组及PUMA+DDP组A549细胞增殖均显著降低(P<0.01),且PUMA+DDP组降低程度最强(P<0.01);凋亡率均显著升高(P<0.01);Bax蛋白水平呈显著性升高(P<0.01),Bcl-2蛋白呈显著性下降(P<0.01)。结论外源性PUMA可抑制肺癌A549细胞增殖,促进凋亡,其机制与增加细胞Bax蛋白表达,降低Bcl-2蛋白表达有关。 更多还原     

ET-1对高血压大鼠脑基底动脉血管平滑肌细胞增殖的作用

目的观察内皮素-1(ET-1)对高血压大鼠脑基底动脉血管平滑肌细胞增殖的作用。方法将高血压大鼠和正常血压大鼠按加入ET-1浓度的不同各分为6组:10%胎牛血清(对照组);10%胎牛血清+20μmol·L-1 ET-1(20μmol·L-1组);10%胎牛血清+40μmol·L-1 ET-1(40μmol·L-1组);10%胎牛血清+60μmol·L-1 ET-1(60μmol·L-1组);10%胎牛血清+80μmol·L-1 ET-1(80μmol·L-1组)及10%胎牛血清+100μmol·L-1 ET-1(100μmol·L-1组)。使用细胞计数试剂盒计数各组细胞个数;采用氚标胸腺嘧啶脱氧核苷([3 H]-TdR)掺入法测定各组血管平滑肌细胞的DNA的合成量作为细胞增殖的指标。结果 ET-1刺激高血压大鼠脑基底动脉平滑肌细胞增生。高血压大鼠20、40、60、80及100μmol·L-1各组脑血管平滑肌细胞数量及DNA合成量较对照组均增加,以80mol·L-1组细胞数量及DNA合成量增加最为明显(均P<0.05)。正常血压鼠各组脑血管平滑肌细胞数量变化及DNA合成量增加不明显(P>0.05)。结论 ET-1可明显促进高血压大鼠脑基底动脉血管平滑肌细胞增殖,提示ET-1可能促进高血压诱发的脑血管重构。更多     

吲哚美辛联合X线照射对人急性髓系白血病HL-60细胞的增殖抑制作用

目的：观察吲哚美辛联合X线照射对人急性髓系白血病HL-60细胞的增殖抑制作用,为抗肿瘤研究提供依据。方法：将HL-60细胞培养于含吲哚美辛的培养基中,终浓度分别为0、20、40、60、80和100 μmol·L^-1。同时给予3　Gy X线照射,继续培养24　h;MTT法检测细胞增殖抑制率;台盼蓝染色法检测细胞活力;实时荧光定量PCR检测细胞增殖和凋亡相关基因PCNA和Caspase-3 mRNA表达变化。结果：与对照组比较,不同浓度吲哚美辛联合照射组HL-60细胞增殖抑制率明显增加,80 μmol·L^-1吲哚美辛联合照射组HL-60细胞增殖抑制率最高（P<0.01）。与对照组、吲哚美辛（80 μmol·L^-1）组和照射组比较,80 μmol·L^-1吲哚美辛联合照射组HL-60细胞活力抑制程度最高（P<0.05或P<0.01）。与对照组、吲哚美辛（80 μmol·L^-1）组和照射组比较,80 μmol·L^-1吲哚美辛联合照射组PCNA mRNA表达水平明显降低（P<0.01）,Caspase-3 mRNA表达水平明显升高（P<0.01）。结论：吲哚美辛可显著增强照射对HL-60细胞的增殖抑制作用。
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人XPD基因转染对人肝癌细胞的生物学影响

目的：XPD基因作为TFIIH因子中一员,在基因修复中发挥重大作用。本实验构建带有绿色荧光蛋白表达人野生型XPD基因重组质粒pEGFP-N2-XPD,并将其稳定转染至人肝癌细胞株Hep3B细胞,探讨XPD基因与HBx,Cdk7的相互作用,以及细胞周期和凋亡机制。方法：从人宫颈鳞癌上皮细胞株HeLa细胞克隆出人全长XPDcDNA,构建了pEGFP-N2-XPD重组体质粒,并将其稳定转染入Hep3B并筛选单克隆稳定转染重组质粒Hep3B细胞（Hep3B-pEGFP-N2/XPD）和稳定转染空载质粒Hep3B细胞（Hep3B-pEGFP-N2）。利用荧光显微镜观测绿色荧光蛋白表达,检测转染XPD基因后细胞内XPD,HBx,cdk7的表达量变化,并检测细胞的增殖凋亡以及细胞周期变化。结果：（1）利用酶切和基因测序,成功构建了带有绿色荧光蛋白表达人野生型XPD基因重组质粒pEGFP-N2-XPD。（2）免疫荧光显微镜下,Hep3B-pEGFP-N2和Hep3B-pEGFP-N2-XPD细胞中可观察到绿色荧光蛋白表达。（3）RT-PCR检测：Hep3B-pEGFP-N2/XPD细胞与Hep3B和Hep3B-pEGFP-N2,两对照组相比,HBxmRNA表达明显降低（P〈0．001）XPDmRNA表达明显增高（P〈0．01）Cdk7mRNA表达明显降低（P〈0．001）。（4）MTT检测示Hep3B-pEGFP-N2/XPD与两对照相比,细胞增殖率减弱（P〈0．05）。TUNEL检测示Hep3B-pEGFP-N2/XPD与两对照组比较,细胞凋亡明显增加（P〈0．01）。流式细胞仪检测示Hep3B-pEGFP-N2/XPD进入S期出现障碍,停滞在Go＋G1期的细胞增多,细胞凋亡率逐渐增加。（5）Westernblot检测Hep3B-pEGFP-N2/XPD细胞中XPD蛋白相对表达量均比两对照组高,Cdk7蛋白相对表达量均比两对照组低,差异有统计学意义（P〈0．001）．结论：野生型XPD基因片段成功插入pEGFP-N2空载质粒中,将其稳定转染进人肝癌细胞株Hep3B细胞中,可以在转录和蛋白水平提高细胞XPD表达、降低细胞内HBxCdk7表达。野生型XPD基因过渡表达可能抑制HBxCdk7表达来改变细胞周期、抑制细胞生长、促使细胞凋亡。     

FuGene HD试剂转染GFP入A549细胞关键条件的优化

目的 优化FuGene HD试剂转染外源基因入A549细胞的实验条件.方法 培养A549细胞,改变FuGene HD试剂/质粒DNA比例以及转染GFP基因的时间,荧光显微镜观察和计数绿色荧光蛋白表达细胞以非表达细胞,并计算转染效率和细胞活力.结果 FuGene HD试剂(μL)/质粒DNA(μg)比例为2.5,转染时间12 h,转染效率为(84.6±5.2)%;而细胞活力为(94.8±4.7)%.结论 FuGene HD试剂/质粒DNA比例为2.5,而转染时间为12 h,可在A549细胞获得较高转染效率和细胞活力.     

红景天苷对TNF-α诱导的人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖的抑制作用及其意义

目的：探讨红景天苷对肿瘤坏死因子α（TNF-α）诱导的人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞（HFLS-RA）增殖的抑制作用,阐明其控制类风湿关节炎（RA）的分子机制。方法：体外培养HFLS-RA,采用TNF-α及不同浓度红景天苷处理细胞,分为正常对照组（0.0μg·L^-1TNF-α）、模型对照组（10.0μg·L^-1TNF-α）及12.5、25.0、50.0、100.0μmol·L^-1红景天苷组（10.0μg·L^-1TNF-α＋相应浓度红景天苷）。MTT法检测HFLS-RA的增殖活力,ELISA法检测细胞上清液中β-catenin、基质金属蛋白酶7（MMP-7）和Cyclin-D1表达水平,Western blotting法检测细胞中β-catenin蛋白表达水平。结果：与正常对照组比较,模型对照组HFLS-RA增殖活力明显升高（P<0.05）。与模型对照组比较,12.5和25.0μmol·L^-1红景天苷组HFLS-RA增殖活力虽降低,但组间比较差异无统计学意义（P>0.05）;50.0和100.0μmol·L^-1红景天苷组HFLS-RA增殖活力降低（P<0.05）。与正常对照组比较,模型对照组细胞上清液中β-catenin、MMP-7和Cyclin-D1表达水平明显升高（P<0.05）。与模型对照组比较,12.5和25.0μmol·L^-1红景天苷组细胞上清液中β-catenin、MMP-7和Cyclin-D1表达水平虽降低,但组间比较差异无统计学意义（P>0.05）;50和100μmol·L^-1红景天苷组细胞上清液中β-catenin、MMP-7和Cyclin-D1表达水平明显降低（P<0.05）。Western blotting法检测,模型对照组细胞中β-catenin蛋白表达水平明显高于正常对照组（P<0.01）;12.5和25.0μmol·L^-1红景天苷组细胞中β-catenin蛋白表达水平虽低于模型对照组,但组间比较差异无统计学意义（P>0.05）;50.0和100.0μmol·L^-1红景天苷组细胞中β-catenin蛋白表达水平低于模型对照组（P<0.05）。结论：红景天苷可抑制HFLS-RA的增殖,其控制RA的机制可能与Wnt/β-catenin信号通路的调控有关联。     

重组AQP9对L-02细胞脂质沉积的影响

目的构建人水甘油通道蛋白9(aquaglyceroporin9,AQP9)重组质粒,验证其在L-02肝细胞中的表达,并检测其对非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)细胞模型的作用。方法从人肝脏组织中提取总RNA,RT-PCR获得AQP9基因,克隆到载体pEGFP-N1上,构建重组质粒pEGFP-N1-AQP9。将其转染L-02细胞,通过荧光显微镜观察其转染情况,RT-PCR和Western blot检测AQP9基因在细胞中的表达。通过油红O染色,测定甘油三酯、游离脂肪酸及甘油含量,检测其对L-02细胞脂肪变性模型的作用。结果成功构建pEGFP-N1-AQP9重组质粒,并能在L-02细胞中表达,将其转染L-02细胞脂肪变性模型后,油红O染色可见油酸/pEGFP-N1-AQP9转染组较油酸组细胞内脂质含量明显升高,油酸/pEGFP-N1-AQP9转染组细胞内甘油三酯、游离脂肪酸及甘油含量分别为(5.435±0.337)、(2.016±0.144)、(1.485±0.113)mmol/L,而油酸组分别为(3.218±0.220)、(1.538±0.193)、(1.024±0.148)mmol/L,两者之间差异有统计学意义(P<0.01),说明上调AQP9表达量可使其脂肪变性程度加重。结论 AQP9异常升高能够引起或加重非酒精性脂肪肝病。     

淫羊藿苷对6- 羟基多巴胺诱导的PC12 细胞损伤的保护机制

目的：探讨淫羊藿苷（icariin,ICA）是否通过Nrf2 通路对6- 羟基多巴胺（6-hydroxydopamin,6-OHDA）诱导的PC12 细胞损伤的保护作用,从而为ICA 用于抗帕金森病（Parkinson’s disease,PD）的应用研究提供基础药理学依据。方法：细胞实验：选用PC12 细胞制备神经元损伤模型,实验随机分为空白组、ICA（0.5 μmol·L-1）组、6-OHDA+ICA（0.005 μmol·L-1）组、6-OHDA+ICA（0.05 μmol·L-1）组、6-OHDA+ICA（0.5 μmol·L-1）组。细胞按分组剂量给予ICA 处理12 小时后再加入6-OHDA（100 μmol·L-1）,采用蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测细胞胞核中Nrf2 的表达,及Keap1,HO-1,Gclc,Nqo1,Caspase 3,Bax,Bcl-2,Cytochrome C 的表达,采用脂质体转染,沉默Nrf2,再次观察以上蛋白的表达,从而进一步证实ICA 有可能通过Nrf2 通路进行保护。结果：Western Blot 结果提示：与空白组相比,模型组的Nrf2,Keap1,Gclc,Nqo1 的表达明显升高,相对的凋亡基因Caspase 3,Bax,Bcl-2,Cytochrome C 也随之升高,随着ICA 浓度的升高,核蛋白Nrf2 的表达升高,且HO-1,NQO1,Keap1,GCLC 的表达也随之升高,而对应的凋亡基因蛋白表达降低。结论：ICA 可能通过Nrf2 通路对6-OHDA 诱导的PC12 细胞损伤的保护作用,后期通过沉默Nrf2基因,进一步探讨ICA 是否通过Nrf2 通路对6-OHDA 诱导的PC12 细胞损伤的保护作用。     

穿心莲内酯对人前列腺癌DU145细胞的增殖抑制及凋亡诱导作用的体外研究

目的探讨穿心莲内酯(Andro)在体外对人前列腺癌DU145细胞抗肿瘤的作用及机制。方法倒置显微镜下观察DU145细胞在Andro(浓度为5.0μmol.L-1)作用24h前后细胞形态的变化;MTT法检测Andro(浓度为5.0、10、20、40和80μmol.L-1)作用于体外培养24、48和72h后DU145细胞的增殖抑制率;AnnexinV-FITC/PI双染后流式细胞术检测Andro(浓度为10、20和40μmol.L-1)处理24h后DU145细胞的凋亡率;Westernblotting法分析Andro(浓度为10、20、40μmol.L-1)处理DU145细胞24h后Bcl-2和Bax基因的表达。结果 Andro(5.0μmol.L-1)作用24h后,形态学改变可见细胞间开始失去连接,细胞变圆、体积缩小,数量明显减少;不同浓度Andro组DU145细胞生长受到明显抑制,且呈浓度和时间依赖性;经10、20、40μmol.L-1 Andro作用24h后,各组细胞凋亡率分别为(15.19±0.76)%、(29.37±1.75)%和(38.41±1.31)%,与空白对照组的(3.40±0.21)%比较,差异有统计学意义(P<0.05);10、20和40μmol.L-1 Andro组Bcl-2蛋白的表达强度分别为0.82±0.13、0.54±0.17、0.36±0.12,Bax蛋白的表达强度分别为0.69±0.06、0.74±0.11、0.93±0.18,随药物浓度增加Bcl-2的表达逐渐降低,而Bax的表达逐渐升高。结论 Andro可以抑制前列腺癌DU145细胞的体外增殖并促进其凋亡,其作用机制可能与下调Bcl-2和上调Bax有关。     

淫羊藿苷对NB4白血病细胞株增殖和凋亡的影响及其作用机制

目的:研究淫羊藿苷(ICA)对急性早幼粒细胞白血病NB4细胞株增殖和凋亡的影响,探讨其作用机制。方法:选取处于对数生长期的 NB4细胞,随机分为空白对照组和不同浓度(4、8、16、32和64 μmol·L^-1)ICA组,采用MTT法检测作用不同时间(24、48和72h)后各组 NB4细胞增殖活性,流式细胞术检测各组细胞24h时细胞周期进程及48h时凋亡情况,采用Western blotting法检测各组NB4细胞48h时凋亡相关蛋白的表达水平。结果:细胞培养不同时间(24、48和72h)后,各ICA组细胞增殖抑制率高于空白对照组(P<0.05),随ICA浓度增加和作用时间延长,细胞增殖抑制率升高(P<0.05)。各浓度ICA(4、8、16、32和64μmol·L^-1)组NB4细胞48 h后细胞凋亡率分别为(6.52±4.12)%、(10.07±2.36)%、(15.41±3.64)%、(25.18±1.24)%和(29.41±1.43)%,与空白对照组[(2.39±1.87)%]比较差异均有统计学意义(P< 0.05)。各浓度ICA(8、16、32和64μmol·L^-1)组NB4细胞24 h后 S期NB4细胞百分率降低,G₁期细胞百分率升高,与空白对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。Western blotting 检测,与空白对照组比较,各浓度ICA组NB4细胞Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P<0.05),而Bax蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。结论:ICA通过抑制Bcl-2蛋白表达水平和上调Bax蛋白表达水平诱导急性早幼粒细胞白血病NB4细胞株凋亡。     

补骨脂乙素对舌鳞状细胞癌Tca8113细胞增殖的抑制作用和凋亡诱导作用及其机制

目的：观察补骨脂乙素（IBC）对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞增殖和凋亡的影响,并阐明其可能的作用机制。方法：将体外培养的Tca8113细胞分为对照组（0 μmol·L^-1）和不同浓度IBC组（10、20、40及80 μmol·L^-1）。通过MTT法检测细胞增殖抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blotting法检测各组细胞中Akt、p-Akt、Erk、p-Erk、Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白的表达水平。结果：MTT法检测,随着IBC浓度的增加和作用时间的延长,Tca8113细胞的增殖抑制率逐渐增加,12、24和48h半数抑制浓度（IC₅₀）分别为（285.13±8.97）、（132.40±7.76）和（58.56±5.93） μmol·L^-1,不同时间点IC₅₀比较差异有统计学意义（P < 0.05）。流式细胞术检测,与对照组（1.69%±0.65%）比较,作用48h后20和40 μmol·L^-1 IBC组细胞凋亡率（分别为8.21%±2.32%和22.45%±1.18%）明显升高（P < 0.05）。Western blotting法检测,与对照组比较,作用48h后20和40 μmol·L^-1 IBC组细胞中Bcl-2、p-Akt和p-Erk表达水平明显降低（P < 0.05）,Bax表达水平明显升高（P < 0.05）;Akt和Erk蛋白表达水平无明显变化（P > 0.05）;与对照组比较,作用48h后40 μmol·L^-1 IBC组Tca8113细胞中Caspase-3蛋白表达水平明显升高（P < 0.05）。结论：IBC可抑制Tca8113细胞的增殖并诱导细胞凋亡,Akt和Erk通路可能是其诱导肿瘤细胞凋亡的途径。     

灵芝酸A对人炎性乳腺癌细胞体外增殖和凋亡的影响

目的：探讨灵芝酸A在体外对人炎性乳腺癌SUM149细胞增殖和凋亡的影响,阐明其可能机制。方法：人炎性乳腺癌SUM149细胞分为对照组和不同浓度（0.1、0.5、1.0、5.0和10.0 μmol·L^-1）灵芝酸A组,每组设4个复孔,分别于培养24、48和72h取样本。MTT法检测各组SUM149细胞增殖抑制率,流式细胞术检测各组SUM149细胞凋亡率和细胞周期,免疫细胞化学染色法检测各组SUM149细胞Ki67和Livin蛋白表达水平。结果：MTT法检测,与0.1μmol·L^-1灵芝酸A组比较,其他浓度灵芝酸A组SUM149细胞增殖抑制率明显升高（P<0.05或P<0.01）,并呈浓度和时间依赖性。流式细胞术检测,与对照组比较,不同浓度灵芝酸A组SUM149细胞凋亡率明显升高（P<0.05或P<0.01）,并呈浓度和时间依赖性;同时细胞周期发生明显变化,与对照组比较,随着灵芝酸A浓度的增加和作用时间的延长,不同浓度灵芝酸A组G₁期细胞百分率明显增加（P<0.05）,S期细胞百分率减少（P<0.05或P<0.01）。与对照组比较,不同浓度灵芝酸A组细胞中Ki67和Livin蛋白表达水平降低（P<0.05或P<0.01）。结论：灵芝酸A通过诱导细胞凋亡抑制人炎性乳腺癌SUM149细胞增殖。     

Nogo-66 调节神经细胞β淀粉样蛋白代谢的机制

目的：本文重点研究Nogo-66 对β淀粉样蛋白（Aβ）代谢的调节作用及其分子机制,对Nogo-66 作用机制进行完善;同时,探讨抑Nogo-66 作用对延缓和阻止AD 进程的影响。方法：①体外培养新生大鼠原代皮质神经元两天后,加入不同浓度的Nogo-66 处理,观察细胞形态及定量分析突起生长状况。②通过ELISA 检测不同浓度Nogo-66 作用原代皮质神经元后,Aβ的变化情况。提取新生大鼠原代皮质神经元后,培养两天,加入不同浓度的Nogo-66 处理,继续培养48 h,收集上清培养基,检测细胞分泌的Aβ40 和Aβ42 含量。③体外培养新生大鼠原代皮质神经元两天后,分别加入不同浓度的Nogo-66 受体阻断剂NEP1-40、受体下游信号分子ROCK（rho-associated coiledcoil-containing protein kinase）的抑制剂Y-27632 预保护1 h 后,用终浓度为1 μmol·L-1 的Nogo-66处理细胞,继续培养48 h,收集上清培养基,检测细胞分泌的Aβ40 和Aβ42 含量。④体外培养新生大鼠原代皮质神经元两天后,用2 μmol·L-1 的NEP1-40 和100 μmol·L-1 的Y-27632 进行预保护,采用1 μmol·L-1 的Nogo-66 处理细胞造模,Western Blotting 检测Nogo-66 下游信号ROCK 通路上各相关蛋白的表达及其磷酸化水平。结果：①形态学观测结果显示,当浓度为4 μmol·L-1、16 μmol·L-1时,神经元具有明显损伤。MAP2 免疫荧光结果显示,Nogo-66 能显著性抑制突起再生,0.25μmol·L-1、1 μmol·L-1 各剂量组皮质神经元平均突起长度显著性降低,具有效关系。表明Nogo-66能抑制原代皮质神经元突起的再生。②ELISA 结果显示,Nogo-66 能促进Aβ40 和Aβ42 含量。其中0.5 μmol·L-1、1 μmol·L-1 的Nogo-66 能显著增加原代皮质神经元培养基中的Aβ40 和Aβ42 含量,具有量效关系。③加入Nogo-66 受体阻断剂NEP1-40、ROCK 抑制剂Y-27632 后,ELISA 结果显示,与Nogo-66 模型组相比,2 μmol·L-1 的NEP1-40 能拮抗Nogo-66,显著性降低原代皮质神经元培养基中的 Aβ40 的含量;50 μmol·L-1、100 μmol·L-1 的 Y-27632 能拮抗Nogo-66,显著性降低培养基中的Aβ40 和Aβ42 的含量,但量效关系不明显。筛选出 NEP1-40 和Y-27632 最佳作用浓度分别为：2 μmol·L-1、100 μmol·L-1。④ELISA 结果显示,Nogo-66 模型组（只加Nogo-66,不加抑制剂）能显著增加原代皮质神经元和N2a 过表达细胞株（由澳门科技大学馈赠）培养基中Aβ40 和Aβ42 的含量。Nogo-66 受体阻断剂NEP1-40 和ROCK 抑制剂 Y-27632 能拮抗Nogo-66,显著性降低培养基中的Aβ40 和Aβ42 的含量。⑤Western Bolt 结果显示,0.5 μmol·L-1、1 μmol·L-1 的Nogo-66 能显著性增加原代皮质神经元细胞和 N2a 过表达细胞株的ROCK2 和磷酸化的CRMP2 的表达水平,且具有明显的剂量依赖性。结论：①Nogo-66 能抑制原代皮质神经元突起再生,且促进皮质神经元分泌Aβ40 和Aβ42;②Nogo-66 是通过激活Nogo-66 受体及下游信号分子ROCK2 和p-CRMP2 抑制原代皮质神经元突起再生并促进分泌 Aβ40 和Aβ42。