新生大鼠心肌成纤维细胞培养方法的比较

 目的:建立并比较新生大鼠心肌成纤维细胞的培养方法。方法:分别通过胶原酶+胰酶消化法和胰酶消化法对新生大鼠心肌组织进行消化,利用贴壁时间差分离心肌细胞和心肌成纤维细胞,然后对收集的心肌成纤维细胞进行形态、纯度及对药物反应方面的检测。结果:在细胞形态和纯度方面,2种方法收集的心肌成纤维细胞没有明显差异,但用胶原酶+胰酶消化法可以获得更多数量的心肌细胞;在药物反应方面,采用胰酶消化法获得的心肌成纤维细胞比胶原酶+胰酶消化法具有更强的增殖能力。结论:采用胶原酶+胰酶消化法和胰酶消化法可以获得相同形态和纯度的心肌成纤维细胞,但是采用胰酶消化法获得的心肌成纤维细胞对药物具有更强的增殖反应能力。     

新生大鼠心肌成纤维细胞的内皮细胞分化潜能

目的 探讨心肌成纤维细胞（CFs）向内皮细胞分化以及成血管潜能。方法 新鲜左心室组织,体外分离、培养、纯化CFs,利用内皮细胞诱导液对第3代 CFs诱导培养,连续诱导培养28 d后,换用内皮细胞培养基（ECM）,并消化传代扩增至第3代。观察诱导细胞生长情况和形态变化,利用免疫细胞化学法、流式细胞术和血管形成分析实验对诱导后细胞的内皮细胞标志物的表达和功能特性进行评价。结果 新生大鼠第3代CFs,呈三角形、梭形和多边形,增殖速度迅速;波形蛋白（vimentin）、盘状结构受体2（DDR2）均呈阳性表达。诱导第3天细胞开始汇合,21 d部分细胞形成串珠样连接,28 d出现细胞汇集成环状样形状;免疫组织化学标记vWF和CD31呈阳性表达;细胞免疫荧光标记vWF、CD34、CD105均呈阳性表达;流式细胞术检测诱导后细胞表面标志物CD31表达率为50.5%,对照组CD31表达率为5.82%。结论 血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）体外定向诱导CFs可使其向血管内皮细胞分化,并表现其功能特征。     

成年大鼠心脏成纤维细胞的分离培养

目的;建立成年大鼠心脏成纤维细胞的离体培养模型。方法：以组织块消化法分离细胞,以差数贴壁法去除其它细胞,常规培养、传代、免疫组化染色进行细胞鉴定并绘制生长曲线观察细胞传代后成纤维细胞的基本特征及生长特性的变化。结果：第2－4代细胞生长良好、稳定,波形蛋白染色阳性,VⅢ因子相关抗原及肌动蛋白染色阴性。结论：组织块消化法是一种适用于成年大鼠心脏成纤维细胞分离培养的简便方法,第2－4代细胞适于实验。     

醛固酮降低新生大鼠心肌成纤维细胞iNOS表达和NO含量

目的为探讨醛固酮诱导心肌成纤维细胞(CFs)增殖及其对诱导型一氧化氮合酶 一氧化氮(iNOS NO)系统活性的影响。方法用胰酶消化法分离、培养新生SD大鼠CFs,采用MTT比色法、硝酸还原酶法、分光光度法和半定量RT PCR技术,观察不同浓度醛固酮对CFs的增殖、NO含量、iNOS活性和iNOSmRNA表达的影响。结果醛固酮(10 -11～10 -7mol/L)能剂量依赖性促进CFs的增殖,降低CFs的NO含量、iNOS活性及iNOSmRNA的表达(均P <0 .0 5 ) ,且螺内酯能逆转醛固酮的上述作用。醛固酮干预下CFs增殖数目与NO含量和iNOS活性呈显著负相关(r分别为- 0 . 94 2、- 0 . 978,均P <0 . 0 1)。结论醛固酮能剂量依赖性降低CFs的iNOS -NO系统活性,促进CFs增殖;螺内酯能逆转此作用。     

miR-21对人心肌成纤维细胞MMP2表达和大鼠心肌细胞凋亡的影响

目的探讨mi R-21对人心肌成纤维细胞MMP2表达和大鼠心肌细胞凋亡的影响。方法采用实时荧光定量PCR方法检测MMP2 m RNA表达水平,应用Cell Titer-Fluor?细胞活力检测试剂盒测定心肌细胞增殖,Caspase-Glo试剂盒检测心肌细胞半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)的活力。结果 mi R-21上调人心肌成纤维细胞MMP2 m RNA的表达,促进大鼠心肌细胞增殖,抑制caspase-3在大鼠心肌细胞的活力。结论 mi R-21可能是参与心肌重构调控的重要基因。     

心肌成纤维细胞的来源、特征及意义

1导言 心肌成纤维细胞约占正常心肌组织细胞总数的60％～70％，是心脏中非心肌细胞的主要组成部分，广泛存在于心脏组织中，包绕心肌细胞，连接心肌细胞间质，与缺血性心脏病、炎症、肥大、梗死等病理状态密切相关。成纤维细胞增殖以及合成细胞外基质（extracellular matrix，ECM）增加将导致纤维组织增生，心肌纤维化。     

心脏成纤维细胞在心肌纤维化中的作用

心脏成纤维细胞(CFB)调节细胞外基质(ECM)合成和降解,是参与心脏损伤修复和心肌纤维化(MF)的关键细胞。多种来源的CFB聚集到损伤区域并活化,通过分化为肌成纤维细胞(MFB)、分泌多种生物活性因子,影响基质金属蛋白的酶/组织金属蛋白酶抑制(MMP/TIMP)系统,引起MF。本文综述了CFB来源、CFB对ECM的调节及CFB对MF作用的研究进展。     

miR-1、miR-16和miR-208前体在乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞中的表达

目的检测心肌特异的miR-1、miR-16和miR-208前体在乳小鼠、乳大鼠心肌细胞及心肌成纤维细胞中的表达。方法利用出生1～3d的Sprague-Dawley（SD）大鼠和C57BL/6小鼠,采用2.5%胰酶消化和差速贴壁法分离心肌细胞和心肌成纤维细胞。提取原代的乳小鼠、乳大鼠心肌细胞及P1代的心肌成纤维细胞总RNA,以β-actin为内参照,逆转录酶-聚合酶链式反应（RT-PCR）分别检测miR-1、miR-16和miR-208的前体表达水平。用FluorChem8900软件分析琼脂糖凝胶电泳后PCR产物条带的灰度值,计算出表达的目的miRNA前体与β-actin的比值。结果有效分离并培养了乳C57BL/6小鼠、乳SD大鼠心肌细胞及心肌成纤维细胞。RT-PCR结果显示,在乳SD大鼠心肌细胞及心肌成纤维细胞中miR-1和miR-16均有相近水平的表达;心肌细胞中miR-208的表达显著低于miR-208b（P〈0.01）,miR-208b在心肌细胞中的表达显著高于其在心肌成纤维细胞中的表达（P〈0.05）。乳C57BL/6小鼠心肌细胞中miR-1a-1的表达显著低于miR-1a-2（P〈0.01）,而miR-1a-2在心肌细胞和心肌成纤维细胞中的表达水平一致;miR-16-1在心肌细胞和心肌成纤维细胞中表达水平相近,而miR-16-2在两种细胞中均不表达;心肌细胞中miR-208a和miR-208b表达水平差别不明显,心肌成纤维细胞中只有miR-208a表达,并且在水平上低于其在心肌细胞中的表达（P〈0.05）。结论 miR-1、miR-16和miR-208前体在乳小鼠、乳大鼠心肌细胞及心肌成纤维细胞中呈细胞特异性的表达。     

大鼠成纤维细胞生长因子对心肌成纤维细胞增殖和转分化的作用机制

目的 探讨成纤维细胞生长因子（FGF）对心肌成纤维细胞(CFs)在增殖和转分化为肌成纤维细胞（MFs）中的作用。 方法 分离、培养大鼠CFs,利用FGF对其进行诱导培养,CCK-8技术检测细胞活性和增殖状况,免疫荧光和Western blotting技术测定α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和Ⅰ型胶原（ColⅠ）的表达量。 结果 随大鼠CFs培养代数的增加,其α-SMA、ColⅠ的表达和活化为MFs的数量增加。加入FGF诱导培养的大鼠CFs数量没有明显增加;加入FGF1、FGF2诱导的CFs表达α-SMA减少,活化为MFs 数量减少。 结论 FGF家族对大鼠CFs没有促增殖作用,但FGF1和FGF2可以抑制CFs活化,减少其向MFs的分化。     

改构型酸性成纤维细胞生长因子抑制新生大鼠心肌缺氧/复氧模型细胞的凋亡*

背景：酸性成纤维细胞生长因子对缺血及再灌注心肌具有较好的保护作用,删去N 端第21~27位的氨基酸序列后的改构型酸性成纤维细胞生长因子诱导的细胞增殖能力明显降低。 目的：观察改构型酸性成纤维细胞生长因子对心肌缺氧/复氧后细胞凋亡的影响。 方法：利用原代培养的SD新生大鼠心肌细胞建立体外心肌缺氧/复氧模型,分别用酸性成纤维细胞生长因子和改构型酸性成纤维细胞生长因子对此细胞模型进行干预。锥虫蓝拒染法检测心肌细胞存活率,流式细胞术检测心肌细胞凋亡率。 结果与结论：改构型酸性成纤维细胞生长因子及酸性成纤维细胞生长因子均能显著降低缺氧/复氧后心肌细胞存活率及凋亡率(P < 0.01)。证实,改构型酸性成纤维细胞生长因子能有效抑制缺氧/复氧后心肌细胞凋亡。      

Purification of neonatal rat cardiac cells by centrifugal elutriation

Summary A method utilizing centrifugal elutriation to obtain a highly purified (95 ± 2% after 3 d in culture) preparation of beating cardiac myocytes from enzyme-dissociated neonatal rat heart is described. An additional fraction enriched for nonmuscle cells is also obtained. Purity of myocyte cultures is determined by Coomassie blue R250 staining of the cytoskeleton; this procedure is also described.     

增龄对大鼠心成纤维细胞生长和增龄对大鼠心成纤维细胞生长和功能的影响*功能的影响*

目的： 探讨增龄对大鼠心成纤维细胞（CFs）生长和功能的影响。方法：体外培养新生、1 月龄、3 月龄 大鼠CFs,利用MTT法检测细胞生长能力变化;免疫荧光、免疫细胞化学检测干细胞表面标志物nanog、sox2、 oct4、scal-1 和c-kit 的表达差异,利用成脂、成骨、成心肌诱导液检测各组CFs 多向分化能力差异。结果： 培 养的各组CFs 均表达盘状结构域受体2（DDR2）,符合心成纤维细胞特性;贴壁2 ～ 4 d 时,各组CFs 处于对数 生长期,4 ～ 5 d 时处于平台期,5 ～ 6 d 时处于下降期;贴壁2 ～ 6 d 时,新生组CFs 生长速度高于1 月龄组, 1 月龄组CFs 生长速度高于3 月龄组;各组 CFs 均表达nanog、 sox2、 oct4、 scal-1、 c-kit,nanog 的荧光定量结果为 新生组>3 月龄组>1 月龄组,sox2 的荧光定量结果为新生组>1 月龄组>3 月龄组,oct4 的荧光定量结果为新生组 >1 月龄组>3 月龄组,scal-1 的荧光定量结果为1 月龄组> 新生组>3 月龄组,c-kit 的荧光定量结果为1 月龄组和 3 月龄组> 新生组,而1 月龄组和3 月龄组间差异无统计学意义。各组CFs 在多向诱导分化后,均有成脂、成骨、 成心肌能力。结论：增龄可影响 CFs 的生长速度和多种表面标志物表达量,但对其多向分化潜能并无明显影响。     

组织工程化心肌片层移植心肌梗死大鼠的心功能及电生理变化

背景：组织工程化心肌组织在组成结构上类似于心脏组织的三维电偶联网络和肌肉横纹,而且具有心肌组织样收缩功能,为病损心肌提供了修复的可能性。 目的：观察心肌细胞/胶原复合体移植后心肌梗死大鼠心室肌的心功能及电生理变化。 方法：将成年SD大鼠分为假手术组、模型组、移植组,后2组制作心肌梗死动物模型,假手术组仅开胸,不结扎冠状动脉。移植组移植心肌细胞与胶原材料复合组织,其他2组不进行移植。 结果与结论：①左室心功能：与假手术组相比,模型组左室舒张末期内径、左室收缩末期内径均显著增大(P < 0.01),左室射血分数和左室短轴缩短率显著降低(P < 0.01);移植组左室舒张末期内径、左室收缩末期内径、左室射血分数和左室短轴缩短率均未见明显增大或降低(P > 0.01)。②左室有效不应期变化：与假手术组相比,模型组梗死周边区有效不应期显著缩短(P < 0.01);移植组梗死周边区有效不应期较模型组延长,差异有显著性意义(P < 0.01)。③Cx43免疫荧光结果：假手术组、模型组和移植组大鼠缝隙连接蛋白43阳性表达依次呈现阳性,弱阳性,弱阳性。但移植组缝隙连接蛋白43阳性表达高于模型组。结果可见移植的心肌细胞/胶原复合体在组织和结构上形成电偶联网络和收缩偶联,能改善心肌梗死大鼠心室肌的收缩功能及电生理特性。     

新生大鼠心祖细胞原代分离培养及鉴定

目的原代分离培养及鉴定新生大鼠心祖细胞(CPCs)。方法利用差速贴壁原代分离培养CPCs,形态观察和二乙酸羧基荧光素-琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE)示踪法检测细胞增殖。使用Fluo-3/AM钙离子检测法,检测集落增殖细胞中钙离子浓度变化。免疫荧光技术检测集落增殖细胞的干细胞标记物及心肌细胞标记物的表达。结果差速贴壁法获得细胞培养1周左右即观察到集落增殖的细胞,圆/椭圆形或不规则多边形细胞呈铺路石样排列。随培养时间延长,细胞集落增大。培养3周左右,细胞集落中细胞形态发生改变(分化),逐渐出现突起或呈梭形等,集落中出现波动/跳动的心肌细胞。用CFDA SE示踪显示,细胞呈集落增殖特点;Fluo-3/AM钙离子检测显示,集落增殖细胞中分化细胞的钙离子浓度增高。免疫荧光检测显示,不同的集落增殖细胞具异质性,存在c-kit~+/CD34~-、Nanog~+/CD34~-和c-kit~-/Nanog~-细胞集落;增殖的细胞集落存在c-kit和Gata4阳性共表达,随细胞分化出现心肌肌钙蛋白T(c Tn T)细胞集落。结论差速贴壁法原代分离培养的心祖细胞具有集落增殖和分化为心肌细胞的能力,是研究心祖细胞表面标记物、增殖和调控机制的理想材料。     

原代培养人增生性瘢痕成纤维细胞的生物学行为

背景：增生性瘢痕组织的形成是创面愈合过程中不可避免的,但是增生性瘢痕组织的形成产生很多不良的影响。 目的：建立可靠的人增生性瘢痕成纤维细胞的原代培养方法。 方法：采用组织贴壁法和消化法分别进行人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞的原代培养,使用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基,37 ℃,体积分数5%CO2,饱和湿度下培养,分别描述其生长曲线、形态及波形蛋白的表达。 结果与结论：组织贴壁法人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞培养成功,20-40 d可传第1代,以后每7-10 d可传1代,细胞为长梭形,波形蛋白表达阳性;消化法培养人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞成功,15-20 d细胞可融合成片,细胞为长梭形,波形蛋白表达阳性。进一步证实两种方法进行人增生性瘢痕成纤维细胞的原代培养均培养成功。     

基质细胞衍生因子1α培养心肌细胞和成纤维细胞的增殖与迁移

背景：在心脏缺损边缘造成新创面能够促进缺损自愈,基质细胞衍生因子1α能够促进血管生成以及心脏功能。 目的：探讨物理损伤及基质细胞衍生因子1α对心肌细胞增殖的影响及心肌细胞对心脏成纤维细胞迁移的趋化作用。 方法：原代分离培养大鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞,采用刮伤法建立物理损伤模型,并应用10- 160 μg/L的基质细胞衍生因子1α进行干预;CCK-8法检测心肌细胞的增殖能力;Transwell法检测心肌细胞趋化下心脏成纤维细胞的迁移能力。 结果与结论：不同浓度的基质细胞衍生因子1α均可提高物理损伤下心肌细胞的增殖能力,尤以80 μg/L基质细胞衍生因子1α作用下心肌细胞增殖最明显。同时,物理损伤联合基质细胞衍生因子1α培养的心肌细胞可显著增加心脏成纤维细胞的迁移能力,并且随着趋化培养时间的延长,迁移能力增加更明显。可见基质细胞衍生因子1α能提高物理损伤心肌细胞的增殖能力,物理损伤联合基质细胞衍生因子1α培养的心肌细胞对心脏成纤维细胞的迁移具有促进作用。     

新生小鼠海马神经干细胞体外培养条件下的增殖与分化

背景：神经干细胞移植可用于中枢神经损伤的临床治疗。 目的：观察新生小鼠海马神经干细胞在体外培养条件下的增殖和分化。 方法：从新生昆明小鼠海马取材,采用机械分离法对原代细胞进行无血清培养,采用机械法复合酶消化法对原代细胞进行传代,以体积分数为10%胎牛血清诱导分化。免疫荧光行巢蛋白、β-微管蛋白Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白染色,对培养的细胞进行鉴定。CCK-8法检测神经干细胞增殖能力。 结果与结论：从新生小鼠海马分离得到的细胞具有连续传代形成克隆球的能力,克隆球呈巢蛋白免疫反应阳性;加入胎牛血清可诱导分化为β-微管蛋白Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞。提示实验成功建立了体外培养新生小鼠海马组织分离和培养神经干细胞的方法,培养的神经干细胞在体外培养条件下保持着自我增殖和分化的潜能。     

糖尿病与正常大鼠骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死的比较

背景：目前国内外在干细胞移植治疗心肌梗死的研究中,大多采用正常或者年轻的骨髓间充质干细胞作为移植细胞来源。 目的：比较糖尿病和正常大鼠骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死的疗效差别。 方法：无菌条件下获取正常大鼠及糖尿病大鼠的骨髓间充质干细胞,建立大鼠心肌梗死模型并随机分为3组,分别于心肌梗死病灶区注射100 μL含有105-106个F2代正常大鼠或糖尿病大鼠来源骨髓间充质干细胞的细胞混悬液,空白对照组注射100 μL含体积分数20%胎牛血清的DMEM。移植后1个月行苏木精-伊红染色检测各组梗死区域心肌组织形态的变化;通过免疫组化方法检测Bcl-2的表达。 结果与结论：通过对细胞形态观察及流式细胞术鉴定,大鼠股骨骨髓贴壁培养可获取纯度较高的骨髓间充质干细胞,绘制细胞生长曲线结果显示正常大鼠骨髓间充质干细胞较糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞生长快。移植后1个月,正常大鼠干细胞移植组梗死区域心肌组织形态较糖尿病大鼠干细胞移植组及空白对照组明显改善,梗死区域心肌组织Bcl-2的表达也高于其他2组。证实正常大鼠来源骨髓间充质干细胞较糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞生长明显加快,且糖尿病使骨髓干细胞移植治疗心肌梗死的疗效降低。     

成年小鼠神经干细胞体外培养、鉴定及分化

目的:建立一种简便易行的从成年小鼠脑组织分离、培养和鉴定神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的方法,为相关研究提供新的研究手段。方法:采用机械分离和酶消化结合方法分离成年昆明种小鼠的脑组织,用无血清培养基悬浮培养;倒置相差显微镜观察细胞形态;MTT法(四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法)观察NSCs的自我增殖能力;免疫荧光细胞化学技术检测NSCs标志物巢蛋白(Nestin)的表达;多聚赖氨酸铺板和撤除培养基中FGF和EGF的条件下,给予5%血清和1μm维甲酸诱导NSCs分化,免疫荧光细胞化学技术检测GFAP(标记胶质细胞),β-tubulin Ⅲ(标记神经元)蛋白的表达来测定NSCs的分化能力。结果:从成年小鼠脑组织分离的细胞,在无血清培养液中可形成神经球,并可在体外扩增和连续传代,免疫荧光细胞化学表明神经球Nestin阳性表达,在给予血清和维甲酸条件下神经球可表达GFAP和β-tubulin Ⅲ。结论:本研究成功建立了体外培养成年小鼠脑组织分离和培养NSCs的方法,培养的NSCs具有自我更新、增殖及多向分化潜能。此方法是一个稳定、简便易行的方法,可广泛用于神经干细胞相关的基础和应用研究。     

Characterization of contractions in mechanically and enzymatically isolated myocardial cells from the rat heart ventricles

Single spontaneously beating myocardial cells were prepared by mechanical or enzymatical isolation. Using a TV camera and videotape recorder, beating parameters were characterized in different buffer solutions in regard to temperature and integrity of sarcolemma, which was tested by ability of cells to exclude a vital stain, Evans blue. The mechanically disaggregated cells were totally permeable to this stain, but about 60% of the enzymatically isolated myocytes were able to exclude the stain. The myocytes prepared in the presence of calcium were most tolerant to physiological concentration of calcium. Contractions were mainly of phasic type where the velocity of contraction wave was very slow (50–330 μm/s). The velocity was not correlated to the beat rate. Temperature dependence of the velocity was positively correlated with the integrity of sarcolemma. Beat rate was inversely related to the integrity of sarcolemma being slowest in calcium tolerant enzymatically isolated cells. Beat rate of calcium sensitive myocytes was higher but unstable and the temperature dependence of the rate was steeply reduced and even reversed during the incubation. Some calcium tolerant myocytes generated occasionally an electric type of contraction which came in bursts and was characterized by synchronous sarcomere shortening without any contraction wave.