人外周血与脐血内皮祖细胞生物学特性的比较

背景：内皮祖细胞可从外周血与脐血中获取,是修复各种疾病所致损伤的血管内皮细胞不可或缺的细胞来源。 目的：比较人外周血与脐血来源的内皮祖细胞经体外培养后生物学特性的差异。 方法：通过密度梯度离心法和6%羟乙基淀粉结合密度梯度离心法分别分离人外周血与脐血中的单个核细胞,分别设为脐血源组和外周血源组,计数各组单个核细胞数量,按1.0×106/cm2接种于大鼠尾胶包被的培养皿中,用内皮细胞培养基进行诱导,共培养7 d。 结果与结论：外周血与脐血体外培养分离出内皮祖细胞具有类似的形态学特征。光学显微镜下观察,随着培养天数的增加,大多数细胞由早期的贴壁圆形转变为梭形。外周血源组内皮祖细胞有细胞集落形成,脐血源组可见梭形细胞自行排列生长为典型的线样结构。锥虫蓝染色及绘制细胞生长曲线后发现,外周血源组单个核细胞及内皮祖细胞数量、内皮祖细胞活率及增殖能力均低于脐血源组(P < 0.05)。外周血源组和脐血源组内皮祖细胞在接种后第3天增殖速度达到峰值,在随后的培养中细胞增殖呈衰减态。流式细胞仪及免疫荧光染色检测结果显示,外周血源组和脐血源组内皮祖细胞均可表达具有内皮祖细胞表型的CD133、CD34和血管内皮细胞因子受体2表面标志物,两组既摄取Dil标记乙酰化低密度脂蛋白,也能标记体外内皮祖细胞的标志物荆豆凝集素Ⅰ。结果证实,脐血来源的内皮祖细胞与外周血来源的内皮祖细胞生物学特性相近,脐血来源的内皮祖细胞增殖能力更强。     

大鼠骨髓内皮祖细胞的分离培养与鉴定

背景：内皮祖细胞参与血管新生,但其分离、培养、鉴定方法目前并不统一。 目的：探索大鼠骨髓内皮祖细胞的分离培养及鉴定方法。 方法：使用密度梯度离心法及差速贴壁法联合的方法培养内皮祖细胞,在倒置显微镜下观察细胞生长情况及形态变化,使用Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的荆豆凝集素1双荧光染色、流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34、CD133表达情况。 结果与结论：培养前4 d细胞增殖不明显,第5~10天迅速增殖,并可见细胞集落及线状结构形成。培养第7天的内皮祖细胞具有吞噬Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的荆豆凝集素1的功能。流式细胞仪检测体外培养第10天的细胞,CD133+ 细胞占19.2%,CD34+ 细胞占28.7%,CD34+/CD133+ 细胞占19.1%。说明密度梯度离心法联合差速贴壁法可在体外有效分离培养大鼠骨髓内皮祖细胞。 关键词：内皮祖细胞;细胞分离;细胞培养;骨髓;细胞鉴定 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.10.006     

人脐血中分离培养扩增内皮集落形成细胞及其生物相容性

背景：内皮集落形成细胞是内皮祖细胞的一种亚型,体外培养扩增及其在组织工程中的应用尚不明确。 目的：探索从人脐血中分离培养扩增内皮集落形成细胞并观察其生物相容性。 方法：采用密度梯度离心法从人脐血中分离单个核细胞,接种于Ⅰ型鼠尾胶原包被的培养板上,采用内皮祖细胞专用EGM-2培养基诱导培养,早期传代后扩增,免疫荧光鉴定细胞,并检测其体外成血管和增殖能力,与纳米羟基磷灰石/磷酸三钙材料复合培养后的生物相容性。 结果与结论：脐血来源内皮集落形成细胞呈铺路石样集落生长,吞噬Dil-Ac-LDL并结合FITC-UEA-1,表达CD31,vWF,KDR和Tie-2,早期传代后拥有较强增殖潜能,可在体外大量扩增,在体外基质胶上可形成闭合管腔样结构,复合纳米羟基磷灰石/磷酸三钙材料后生物学特性不受影响。提示可从脐血中分离并体外大量扩增内皮集落形成细胞。     

人脐血和外周血内皮祖细胞的分离培养和鉴定

背景：国内外有关内皮祖细胞的分离培养和鉴定方面的文章很多,但是人脐血和外周血内皮祖细胞的鉴别方面文章不多。 目的：从人脐血和外周血中分离出内皮祖细胞,并对其进行培养和鉴定。 方法：选取密度梯度离心法从脐血和外周血中分离获得单个核细胞,按照1× 10⁶/cm²的浓度种植于预先铺有纤维连接蛋白的培养板中,用含血管内皮生长因子的M199培养基进行诱导培养。 结果与结论：人脐血和外周血中存在内皮祖细胞,浓度梯度离心联合贴壁筛选获得的单个核细胞在血管内皮生长因子的诱导培养下可分化成内皮祖细胞,内皮祖细胞表达CD34、CD133、CD105、KDR和CD31,能吞噬乙酰化低密度脂蛋白,结合荆豆凝集素1,它们可作为体外分选内皮祖细胞的标志。     

人脐带血内皮祖细胞与血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子共培养及其增殖和迁移能力

背景：目前组织工程心脏瓣膜再内皮化种子细胞主要来源于成熟内皮细胞,内皮祖细胞作为内皮细胞的前体细胞越来越受到人们的关注。 目的：分离和扩增人脐带血内皮祖细胞,观测其体外生物学特性。 方法：密度梯度离心法分离新鲜的脐血中单个核细胞,在含血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的培养液中培养扩增,通过形态学、免疫荧光和流式细胞仪等对贴壁细胞进行鉴定;并与脐静脉内皮细胞进行增殖和迁移能力比较。 结果与结论：随着培养和诱导时间延长,贴壁细胞形态发生明显的改变,从小圆形变成梭形,逐渐分化成典型成熟内皮细胞的鹅卵石样形态,并可形成特征性的克隆;体外诱导7 d后90%以上贴壁细胞呈Dil-ac-LDL和FITC-UEA-I双阳性;贴壁细胞流式细胞仪分析显示：培养7 d的细胞VEGFR-2、CD34和CD133表达分别占(77.4±4.9)%、(52.4±6.6)%和(19.4±2.1)%,培养28 d的细胞VEGFR-2和CD34表达分别占(81.1±7.4)%和(7.6±3.1)%,而未检测到CD133表达;人内皮祖细胞增殖和迁移能力明显高于人脐静脉内皮细胞(P < 0.05),并且细胞数量可扩增达10⁹ L^-1。结果显示用密度梯度离心法和贴壁筛选法,可从人脐带血分离、纯化内皮祖细胞;内皮祖细胞可诱导分化为内皮细胞,增殖和迁移能力都很强。     

人外周血单个核细胞来源内皮祖细胞的生物学性状

目的 探讨从成人外周血单个核细胞中分离、培养内皮祖细胞（EPCs）的方法以及EPCs的生物学特征。方法 密度梯度离心法获得单个核细胞（MNCs），种植于纤连蛋白包被的培养板中。每2h去除1次未黏附细胞共2次，然后隔日换液1次，7d后计数早期集落。每例血样均分为2等份，1份在获得早期集落后进行实验；另1份持续培养至晚期集落出现进行相同实验。流式细胞技术检测细胞表面抗原表达，ELISA法测定上清液中血管内皮生长因子（VEGF）浓度。胶原凝胶细胞种植实验测定体外血管生成功能。结果 早期集落中心为圆形细胞，周边是放射状排列的纺锤形细胞，再种植不能形成第二代集落且无体外血管形成功能，细胞表面主要表达CD14和CD45，培养上清液中可测到高浓度的VEGF。晚期集落在培养21至28d间出现，再种植可形成第二代内皮细胞集落，并能在胶原凝胶中形成管腔样结构。其构成细胞与早期集落相比CD45、CD14表达显著减少（P<0.001）而CD146表达明显增加（P<0.01）。结论 人外周血单个核细胞在内皮培养条件下可形成早期和晚期集落，构成早期集落的绝大多数细胞属于单核细胞系列，可分泌VEGF但不能分化成内皮细胞，晚期集落具有内皮祖细胞的形态和生物学特征。     

人外周血内皮祖细胞培养方法的建立

背景：成人外周血来源丰富,但内皮祖细胞含量较少,为使其能够更好的应用于组织工程及细胞治疗,有必要建立外周血内皮祖细胞成熟、稳定的体外扩增体系。 目的：建立稳定的人外周血分离、培养和体外扩增血管内皮祖细胞的方法。 方法：应用密度梯度离心法,获取外周血单个核细胞,将分选后细胞接种于预先包埋了人纤维连接蛋白的培养板上,加入内皮祖细胞专用培养基中培养3 d后,洗掉非贴壁细胞,培养至第6天,收集贴壁细胞,应用倒置显微镜和苏木精-伊红染色进行细胞形态学观察;采用MTT法和细胞计数测定第1,3代细胞生长曲线;应用流式细胞仪测定祖细胞和内皮细胞系标志,对培养的细胞进行鉴定。 结果与结论：细胞生长曲线测定表明接种后第3天细胞进入指数增生期,至第6天进入平台期,随着传代次数的增加,细胞增殖速度变慢,同时表达干细胞表面标志CD34、CD133和内皮细胞表面标志血管性血友病因子、血管内皮生长因子受体2。证明人外周血可以分离培养内皮祖细胞。     

巴曲酶可影响人外周血内皮祖细胞定向分化及增殖能力

背景：近年来内皮祖细胞促进机体血管新生方面的重要作用已形成共识,但内皮祖细胞的定向分化和扩增的问题是影响其疗效和广泛开展的主要原因。 目的：观察人外周血内皮祖细胞体外分离、纯化、扩增和诱导分化为内皮细胞的可行性。 方法：用密度梯度离心法从外周血获取单个核细胞,接种于包被有人纤维连接蛋白的细胞培养板中,培养6 d后,收集贴壁细胞。以血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子对贴壁细胞进行诱导培养。另外,分别以0.05,0.1,0.2 BU/mL巴曲酶培养贴壁细胞,观察内皮祖细胞的增殖能力。 结果与结论：经血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子诱导后的细胞形态上表现内皮细胞特征,经流式细胞仪测定表达血管内皮细胞特有表面标志CD31和vWF,说明诱导后的细胞为内皮细胞。巴曲酶在体外培养条件下可增加血内皮祖细胞的数量,以0.1 BU/mL浓度作用显著,且作用时间与血内皮祖细胞增殖能力的改善呈正相关。     

小鼠骨髓来源早晚期内皮祖细胞的生物学特性

背景:关于内皮祖细胞统一的定义、相关的生物学特性及在血管发生发展过程中的精准作用等问题存在较大的争议。目的:探索用序列差速贴壁法分离、培养小鼠骨髓血管早、晚期内皮祖细胞的条件并比较早晚期内皮祖细胞的生物学特性差异。方法:采用Ficoll密度梯度离心法从小鼠骨髓中分离单个核细胞,种植于人纤维粘连蛋白包被的培养瓶中,利用序列差速贴壁法分离、纯化细胞早晚期内皮祖细胞。比较早晚期内皮祖细胞在细胞形态、DiI-LDL及FITC-UEA-1摄取能力、细胞的免疫表型、生长增殖能力及体外形成管腔结构能力的差别。结果与结论:早期内皮祖细胞呈集落样成长,晚期呈铺路石样生长,早、晚期内皮祖细胞都可以吞噬DiI-LDL连接FITC-UEA-1。晚期内皮祖细胞拥有较强增殖潜能,早期在体外基质胶上不形成管腔样结构而晚期内皮祖细胞可形成管腔样结构。提示:骨髓中存在具有不同特性的早晚期内皮祖细胞,晚期内皮祖细胞拥有巨大的增殖潜能并在体外参与血管样结构。     

利用自体血清培养人外周血内皮祖细胞

背景：传统方法培养人外周血来源内皮祖细胞操作复杂,费用大,细胞获得率较低。 目的：利用自体血清培养人外周血来源内皮祖细胞,并鉴定其功能。 方法：采用密度梯度离心法从人外周血分离得到单个核细胞,体外培养分化为内皮祖细胞。按培养基条件不同分为EGM-2MV组、添加自体血清组(M199+体积分数10%自体血清+胰岛素样生长因子)、添加胎牛血清组(M199+体积分数10%胎牛血清+血管内皮细胞生长因子+碱性成纤维细胞生长因子+胰岛素样生长因子+表皮生长因子)。观察内皮祖细胞增殖、迁移能力;采用细胞形态观察、双荧光染色法及流式细胞仪等技术对培养的内皮祖细胞进行鉴定。 结果与结论：培养第7天,EBM-2MV组和添加自体血清组细胞增殖能力和迁移率都优于添加胎牛血清组(P < 0.05)。每组细胞经结合Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白和异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素双色荧光染色鉴定后双阳性率> 80%,免疫细胞化学检测显示每组细胞CD133,CD34和KDR的表达均为阳性。证实在M199培养液中添加自体血清是一种简单、高效的培养内皮祖细胞方法。     

大鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离培养与鉴定

背景：内皮祖细胞因其分离与培养的方法各不相同,在实验中难以重复。 目的：探讨大量获取骨髓源性内皮祖细胞分离与培养的方法。 方法：通过密度梯度离心法从4周龄SD大鼠骨髓中分离单个核细胞,使用EGM-2 MV培养基进行诱导培养,采用形态学特征观察、摄取Dil-Ac-LDL与结合FITC-UEA-1实验、免疫荧光化学鉴定其表面抗原CD133与VEGFR2等方法对其进行鉴定,并通过管腔形成实验观察形成管腔的能力。 结果与结论：①形态学观察：分离的骨髓单个核细胞经诱导培养后,在生长的早期(8 d左右)、晚期(15 d左右)其细胞形态有一定差异,早期以纺锤形、三角形、圆形细胞多见,晚期以圆形、短梭形细胞多见。②摄取Dil-Ac-LDL与结合FITC-UEA-1实验：显示8,21 d的细胞均为阳性。③免疫荧光化学染色：8 d的细胞表达CD133、VEGFR2。④管腔形成实验：在Matrigel基质上15 h左右能够生成血管样结构。结果表明：利用密度梯度离心法分离大鼠骨髓单个核细胞后以EGM-2 MV进行诱导培养,经过鉴定证明获得的细胞符合内皮祖细胞的特征。这种方法能够简单、快速、可靠、大量地获取内皮祖细胞。     

大鼠骨髓与外周血来源内皮祖细胞生物学特性比较

背景：内皮祖细胞不仅参与胚胎血管生成,也参与出生后血管发生和血管内膜损伤后修复,对治疗缺血性疾病意义重大,但目前对内皮祖细胞的分离、培养、鉴定还存在争议。 目的：体外分离、培养大鼠骨髓与外周血来源的内皮祖细胞,并比较其生物学特性。 方法：密度梯度离心法分离SD大鼠骨髓和外周血单个核细胞,接种于纤维连接蛋白铺被的培养瓶中贴壁培养,用加入血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及表皮生长因子的完全培养基诱导培养,对获得的贴壁细胞进行细胞形态学,免疫细胞化学染色,流式细胞仪,透射电镜,以及Dil-acLDL、FITC-UEA-1双荧光染色法检测。 结果与结论：骨髓来源的内皮祖细胞数量多,集落状生长,增殖能力强;外周血来源的内皮祖细胞数量较少,散在生长,消化后能贴壁但不能传代。两种不同来源的内皮祖细胞免疫细胞化学检测贴壁细胞CD133、CD34、Flk-1、Ⅷ因子在不同时段呈阳性表达;激光共聚焦显微镜观察,Dil-acLDL、FITC-UEA-1均为双染。透射电镜检查外周血来源的内皮祖细胞发现W-P小体。提示大鼠骨髓和外周血均能分离培养出内皮祖细胞,但前者是早期内皮祖细胞,后者为晚期内皮祖细胞,两者生物学特性各不相同。     

大鼠骨髓和外周血早晚期内皮祖细胞的分离培养和鉴定

背景：旨在从大鼠外周血及骨髓中提取内皮祖细胞,培养晚期内皮祖细胞,为干细胞移植治疗或通过内皮祖细胞联合基因治疗使内皮祖细胞高表达血管新生诱导因子,达到促进缺血性脑血管病血管新生的目的。 目的：从大鼠骨髓及外周血中分离出内皮祖细胞并对其进行鉴定。 方法：使用密度梯度离心及贴壁筛选法从大鼠骨髓和外周血中分离获得单个核细胞,进行诱导培养,观察并记录贴壁细胞的生物学特征;选取内皮祖细胞特异性表面标志CD133、CD34、KDR对原代细胞进行免疫荧光检测,利用流式细胞学技术检测KDR、CD34表达,并通过吞噬功能实验进一步鉴定培养细胞。 结果与结论：大鼠骨髓和外周血能够分离获得早晚期内皮祖细胞;贴壁细胞免疫荧光检测CD34、CD133、KDR表达阳性;流式细胞学检测CD34、KDR表达阳性;贴壁细胞能够吞噬ac-LDL,结合UEA-1。实验成功从大鼠骨髓及外周血中分离出内皮祖细胞;并获得了增殖活性强的晚期内皮祖细胞,找到了更好的成血管干细胞的种子来源。     

内皮祖细胞在体外培养成血管样结构的初步观察

目的：探索体外培养脐血、外周血内皮祖细胞（EPCs）的方法，观察其形成血管样结构的可能性及条件。 方法： 采用贴壁选择法培养人脐血及兔外周血内皮祖细胞，光镜下观察细胞形态，用荧光显微镜、流式细胞仪分析贴壁细胞CD34、VEGFR-2、AC133、血管内皮钙粘素（VE-cadherin）的表达，DiI-ac-LDL 吞噬试验及Ⅷ因子免疫组化证实细胞属性。 结果： 体外成功培养出人脐血及兔外周血内皮祖细胞，形成条索状、管状结构，兔外周血EPCs分化较成熟，形成典型铺路石形状及血管样结构。 结论： 脐血、兔外周血内皮祖细胞可在体外培养成功并表现成血管倾向，可能是血管组织工程的潜在资源。     

外周血内皮祖细胞移植对肢体缺血的改善作用

背景：内皮祖细胞移植为肢体缺血的治疗提供了新的选择。 目的：研究人外周血来源内皮祖细胞移植对改善肢体缺血的作用。 方法：采用Ficoll密度梯度离心法获取人外周血单个核细胞,体外诱导扩增6 d后,检测其内皮祖细胞特异性标志的表达,并将荧光染料标记后的贴壁细胞通过缺血局部多点注射移植到后肢缺血的裸鼠动物模型体内,以评价其治疗效果。  结果与结论：从人外周血单个核细胞诱导出的贴壁细胞可表达内皮祖细胞特异性标志物CD133、CD34和血管内皮生长因子受体2,说明从人外周血单个核细胞中可诱导出内皮祖细胞。移植内皮祖细胞后裸鼠缺血后肢的坏死情况和毛细血管密度均明显改善(P < 0.05);在缺血后肢肌肉石蜡切片中可见分散不均的红色和黄绿色荧光标记的内皮祖细胞的掺入。表明移植的内皮祖细胞可以定向整合到缺血局部,改善裸鼠的后肢缺血。     

雷公藤内酯醇对外周血内皮祖细胞的影响

目的： 观察雷公藤内酯醇对人外周血内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）的影响。方法: 密度梯度离心法获取人外周血单个核细胞，接种至人纤维连接蛋白包被的培养板，培养7 d后收集贴壁细胞进行细胞免疫化学鉴定。实验加入不同浓度雷公藤内酯醇（2.5 μg/L，5.0 μg/L，10.0 μg/L，20.0 μg/L）干预24 h,采用MTT比色法、改良的Boyden小室和黏附能力测定实验，分别观察EPCs 的增殖、迁移和黏附能力。 结果: 雷公藤内酯醇显著影响EPCs的各项生物学功能，使EPCs的黏附能力显著减弱，迁移功能显著下降,增殖能力显著被抑制，这些改变均存在明显的浓度依赖性，20 μg/L浓度组达最大抑制；在雷公藤内酯醇低浓度组，冠心病患者EPCs细胞的各项功能明显低于非冠心病患者组，高浓度组两组相近。结论: 雷公藤内酯醇可能通过抑制EPCs增殖、迁移和黏附功能，抑制血管再内皮化和血管新生。