人羊膜上皮细胞静脉移植治疗大鼠心肌梗死

背景：人羊膜上皮细胞在体外适当诱导条件下可分化为心肌样细胞,可望成为细胞心肌成形术的种子细胞,但在心肌梗死原位是否能分化成心肌细胞值得探讨。 目的：探讨人羊膜上皮细胞移植在心肌梗死原位的分化及对心肌梗死后心室重构和心功能的影响。 方法：用胰酶消化分离人羊膜上皮细胞,行流式细胞仪检测和免疫组化染色以鉴定其表型特征。结扎SD大鼠左冠状动脉前降支以建立心肌梗死模型,实验分为人羊膜上皮细胞移植组、模型组及假手术组,人羊膜上皮细胞移植组于造模后1周经舌下静脉移植Brdu标记的人羊膜上皮细胞。移植后1,4,6周采用超声心动图检查心功能变化,应用苏木精-伊红和Masson染色观察心肌重构的变化,以免疫荧光双染色法检测人羊膜上皮细胞在心肌梗死区的植活与分化。 结果与结论：①所分离的人羊膜上皮细胞表达CD29、CD166、CD73和CK19,不表达CD44、CD34、CD45、CD80、CD86和HLA-DR。②人羊膜上皮细胞移植后6周,心肌梗死区仍可见Brdu标记的阳性细胞,表达心肌特异蛋白连接蛋白43、α-辅肌动蛋白和结蛋白。③移植组大鼠左心室纤维化程度明显低于模型组。④移植组大鼠射血分数、左室短轴缩短率显著高于模型组(P < 0.01);舒张期左室前壁厚度和收缩期左室前壁厚度也显著大于模型组(P < 0.05)。提示人羊膜上皮细胞在心肌梗死原位可分化为心肌细胞,可减缓心室重构并改善心脏功能。     

大鼠羊膜上皮细胞移植对损伤脊髓生长相关蛋白43表达的影响

目的:探讨羊膜上皮细胞(AECs)移植对大鼠损伤脊髓生长相关蛋白43(GAP-43)表达和神经功能恢复的影响.方法: 取E12d～14d的SD大鼠AECs体外培养;改良-Allen撞击法制备大鼠脊髓损伤(SCI)模型,并随机分成假手术组、SCI+生理盐水对照组和SCI+AECs移植组;分别于术后第1、3、7、14和28天通过BBB 神经行为学评分法对神经功能进行评估,观察其恢复状况,并采用免疫组织化学和免疫印迹法检测脊髓组织GAP-43表达的变化.结果: GAP-43的表达于脊髓损伤后第7天显著增加,AECs移植后损伤脊髓中的GAP-43持续高表达至第28天,而盐水对照组的表达于术后14d左右逐渐恢复至正常水平.与盐水对照组相比较,AECs移植后2～4周脊髓损伤大鼠的后肢运动功能得到一定的改善.结论: AECs移植后可使损伤大鼠脊髓GAP-43的表达增高,并在一定程度上促进了大鼠后肢运动功能的恢复.     

人羊膜上皮细胞的诱导分化

目的:建立体外培养及标记人羊膜上皮细胞(HAECs)的方法并应用原子力显微镜(AFM)从细胞形貌变化上探讨人羊膜上皮细胞向角膜上皮细胞转分化的可视性研究。方法:取足月产人羊膜,采用酶消化法获得HAECs进行原代和传代培养,对培养的细胞进行形态学观察和鉴定;HAECs与兔角膜基质细胞共培养2周,采用CK3+12免疫荧光细胞化学染色鉴定诱导后的细胞;应用AFM分别对共培养前后的人羊膜上皮细胞的表面超微结构进行观察,并与人角膜上皮细胞(HCECs)对比,分析细胞形貌的变化。结果:HAECs体外培养呈铺路石样外观,核/质比率小,连接成片。细胞形态为多角形,角蛋白keratin表达阳性,不表达CK3+12;免疫荧光显示共培养2周的HAECs表达CK3+12;AFM观察,共培养2周后HAECs细胞核中央由山谷样外观转变成类似HCECs的山峰样外观。结论:HAECs可成功进行原代和传代培养,在兔角膜基质细胞诱导培养条件下可向角膜上皮细胞转分化。     

体外诱导人羊膜上皮细胞分化为结膜上皮样细胞

目的将人羊膜上皮细胞(HAEC)和兔结膜上皮细胞共培养,观察是否能将HAEC诱导分化为结膜样上皮细胞。方法分别采用酶消化法和组织块法获得HAEC和兔结膜上皮细胞,并对培养的细胞进行形态学观察;运用TranswellTM非接触共培养系统将HAEC和兔结膜上皮细胞共培养2周,诱导HAEC分化;通过免疫荧光组织化学染色法检测诱导后HAEC中细胞角蛋白4(CK4)、黏蛋白Muc4、Muc5AC的表达,实时定量PCR(qRT-PCR)检测分化细胞Muc4、Muc5AC mRNA的表达。结果体外培养的人羊膜上皮细胞和兔结膜上皮细胞形态较为相似,免疫荧光组织化学染色法检测到诱导后HAEC中CK4、Muc4、Muc5AC呈阳性表达,qRT-PCR检测分化细胞Muc4、Muc5AC mRNA表达阳性。结论 HAEC在与兔结膜上皮细胞共培养的诱导条件下,可以向结膜上皮样细胞和产黏蛋白细胞转分化。     

不同途径移植羊膜上皮细胞在肝脏的定居**○

背景：细胞移植对肝脏疾病具有一定的疗效,与肝脏移植相比有其自身的优点,但有诸多问题尚待解决。 目的：探讨不同途径移植的人羊膜上皮细胞在肝脏内定居情况。 方法：从剖腹产后的人胎盘羊膜中分离人羊膜上皮细胞,PKH26荧光标记后计数1×107细胞通过大鼠腹腔、门静脉、尾静脉及肝脏内直接注入方式移植入大鼠体内。 结果与结论：门静脉、尾静脉及肝脏直接注入途径移植的细胞均在肝脏内定居,但移植细胞数过量时造成局部肝组织的缺血坏死等不良反应。腹腔途径移植入体内的细胞未转移肝脏内。通过门静脉移植入体内的人羊膜上皮细胞在大鼠肝脏内维持存活至少16 d。移植细胞过量时,导致肝脏血管堵塞及坏死。证明人羊膜上皮细胞至少在大鼠肝脏中存活2周,提示低免疫原性的羊膜来源细胞可成为肝脏病治疗的候选细胞之一。     

人羊膜上皮细胞移植改善AD样病变模型大鼠学习记忆能力

目的:观察人羊膜上皮细胞(h AECs)对阿尔茨海默病(AD)样病变大鼠模型的治疗效应。方法:采用胰蛋白酶消化法分离h AECs,流式细胞术分析表型。48只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、培养基组和h AECs移植组,每组12只。采用双侧脑室注入脂多糖(LPS)复制AD样病变大鼠模型。AD样病变大鼠海马区移植5×105个h AECs。细胞移植后2周,Morris水迷宫试验观察行为学变化,HE和硫磺素S染色观察海马病理变化,免疫组化染色检测β-淀粉样蛋白42(Aβ42)、Tau蛋白和乙酰胆碱(ACh)的变化,流式细胞术检测外周血T淋巴细胞亚群的变化,流式微球阵列捕获技术(cytometric bead array,CBA)检测血清细胞因子含量,免疫荧光染色检测海马区人细胞核抗原阳性细胞及其神经元特异性核蛋白(Neu N)的表达。结果:与模型组和培养基组比较,h AECs移植组大鼠逃避潜伏期明显缩短(P0.01),跨域平台次数明显增加(P0.05);海马神经元病损减轻,Aβ沉积减轻(P0.05),磷酸化Tau蛋白水平下降(P0.05),ACh增加(P0.05);外周血Th1和Th17细胞百分比下降(P0.05),而Th2和Treg细胞升高(P0.05);IL-2和IFN-γ水平下调(P0.05),而IL-4上调(P0.05);移植区可见h AECs,并表达Neu N。结论:h AECs可明显改善AD样病变模型大鼠空间辨别性学习记忆能力,减轻海马病理损伤,其免疫调节效应可能发挥重要作用。     

人羊膜上皮细胞在大鼠受损肝组织中分化为肝细胞

 摘要：目的 探讨人羊膜上皮细胞在大鼠损伤肝原位植活及向肝细胞分化。方法 采用胰蛋白酶消化法从羊膜组织中分离人羊膜上皮细胞（hAECs）,采用流式细胞术和免疫荧光染色进行表型分析和细胞鉴定。采用腹腔注射D-氨基半乳糖建立大鼠肝损伤模型,随机分为hAECs移植组和对照组,每组20只。造模后24h用微量注射器于肝左、中、右叶3点分别移植L-DMEM 悬浮的hAECs悬液50μL（约1×106个细胞）,对照组注射等量L-DMEM。于移植后48h、1周、2周和4周处死各实验组5只大鼠,取肝脏制备冰冻切片,采用免疫荧光双染色检查hAECs在受损肝原位的植活、分布及其向肝细胞分化的标志物表达。结果：⑴ FCM分析和免疫荧光染色结果显示,所分离的hAECs表达CD29、CD166及CK19,几乎不表达CD44、CD80、CD86、HLA-DR及波形蛋白;⑵ 免疫荧光双染色结果显示,hAECs移植后1周主要定植于肝小叶且表达AFP,至2周表达CK18,至4周表达Alb。结论：hAECs在大鼠受损肝组织中能被植活且可分化为肝细胞,提示hAECs移植在临床肝病的治疗方面可能具有潜在应用价值。     

人羊膜上皮细胞的干细胞特性

背景：研究发现人羊膜上皮细胞具有类似胚胎干细胞或多能干细胞的多向分化潜能,说明其可能是未来组织工程重建的一种新型种子细胞。 目的：研究体外培养的人羊膜上皮细胞的干细胞特性。 方法：取足月剖宫产的人羊膜组织,经酶消化法和差异黏附法获得纯度高的人羊膜上皮细胞,接种于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中进行原代和传代培养,用免疫荧光法和流式细胞仪检测法检测人羊膜上皮细胞表面胚胎干细胞的表面标记蛋白OCT-4和干细胞表面分子标记CD29、CD34、CD44、CD45、CD105的表达。 结果与结论：人羊膜上皮细胞在体外培养条件下呈上皮细胞特有的铺路石样外观,其胞浆中有OCT-4免疫荧光表达,其干细胞标记分子CD29、CD34的表达是阳性,但干细胞标记分子CD44、CD45、CD105的表达为阴性。结果表明人羊膜上皮细胞具有干细胞的某些特性,其可能是未来组织工程重建的一种新型种子细胞。     

人羊膜上皮细胞移植急性肝损伤小鼠的定量效果分析

背景：目前已有较多关于人羊膜上皮细胞移植入动物体内的存活、迁徙及相关特性的初步研究,但其对移植效果的定量分析尚未见报道。 目的：对脾内移植传代的人羊膜上皮细胞小鼠血清肝生化功能及人血白蛋白的定量分析。 方法：40只裸小鼠随机分为4组,每组各10只。肝叶切除+细胞移植2周组、肝叶切除+细胞移植4周组、肝叶切除+盐水组,行半肝叶切除,肝叶切除+细胞移植组自脾下极移植密度为5×106传代的人羊膜上皮细胞约0.2 mL,分别于移植后2周和4周采血;肝叶切除+盐水组自脾下极注射生理盐水0.2 mL;单纯细胞移植组：不行肝叶切除,自脾下极移植密度为5×106传代的人羊膜上皮细胞约0.2 mL。检测其各组肝脾组织学、形态学的改变及各组血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、人血白蛋白的变化和人血白蛋白表达定量分析。 结果与结论：人羊膜上皮细胞移植急性肝损伤小鼠4周后肝脾形态未见明显改变,组织学可检测到特异性细胞,血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、人血白蛋白有明显改善,血清中能检测到人血白蛋白且移植后4周较移植后2周有明显升高。因此,人羊膜上皮细胞移植入肝受损小鼠体内能存活超过4周且仍表达肝细胞样细胞的部分特性及功能,改善小鼠的肝功能,治疗小鼠急性肝损伤。     

臂丛根部的显微解剖学研究及其临床意义

目的:对臂丛根部及其周围组织进行显微解剖,为臂丛撕脱伤的诊治提供解剖学基础。方法:在15例防腐成人尸体的颈胸段标本上,观测臂丛根部的形态特点及其与周围组织的关系,2例新鲜标本行组织学检查,观察臂丛根部穿椎间孔时与周围组织的联系。结果:①臂丛前后根之间有齿状韧带相间隔;相应的后根比前根粗,后根间存在着复杂的纤维联系。②臂丛C5、C6神经根分出角小于前支分出角,C7、C8、T1神经根分出角大于前支分出角。③臂丛C5、C6神经根在椎间孔处与前、中斜角肌起点处的腱性组织交织,并与上半椎韧带融合,且有薄层纤维筋膜鞘样结构,将椎动脉、椎静脉与之包裹一起;C7、C8、T1少见或未见与前述结构的联系。结论:臂丛神经根解剖结构的差异是臂丛C5、C6神经根较C7、C8、T1神经根不易形成根性撕脱的主要原因,熟悉臂丛根部的显微解剖有助于临床臂丛根性撕脱伤的诊治。     

臂神经丛联合阻滞的应用

目的总结＂四针法＂臂丛神经联合阻滞的经验,指导神经刺激仪的合理应用。方法回顾性分析臂神经丛阻滞356例,根据阻滞方法分为联合组（n=148）,联合组同时实施肌间沟阻滞加腋路阻滞加肋间臂神经阻滞;传统组（n=208）,传统组只实施肌间沟阻滞（n=176）,或腋路阻滞（n=32）,不行肋间臂神经阻滞。结果联合组麻醉效果优占97.3%,穿刺异感占47.3%;传统组优占87.0%,穿刺异感占69.7%。联合组与传统组比较,具有显著差异（P〈0.01）。结论 ＂四针法＂臂神经丛联合阻滞可提高臂神经丛阻滞的成功率。     

羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞构建组织工程皮肤

背景：由于人胎盘来源的间充质干细胞具有多方面的优点,近年来已成为干细胞研究的热点。 目的：分析鉴定羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞的生物学特性,探讨其作为皮肤种子细胞在三维气液培养构建组织工程皮肤中的应用情况。 方法：用胰酶胶原酶多步消化法获取羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞,通过流式细胞术、反转录-聚合酶链反应和免疫荧光染色技术,鉴定两种细胞的表面分子标记、干细胞特性、与皮肤角质形成细胞的相似性,并利用两种细胞为种子细胞以鼠Ⅰ型胶原为基质进行三维气液培养。 结果与结论：①流式细胞术检测体外培养羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞均高表达CD90、CD73、CD105,不表达造血干细胞标志CD34以及MHC-Ⅱ类分子HLA-DR。②反转录-聚合酶链反应检测到羊膜间充质干细胞表达干细胞特性基因CMCY和NANOG,羊膜上皮细胞表达干细胞特性基因CMCY和 KLF4,两种细胞均有干细胞特性。③反转录-聚合酶链反应检测羊膜间充质干细胞表达皮肤角质形成细胞特性基因K19、β1-integrin、K8,羊膜上皮细胞表达K19、β1-integrin、K5、K8,免疫荧光染色见羊膜上皮细胞表达与角质形成细胞增殖相关的的特性蛋白K14,说明羊膜上皮细胞与皮肤角质形成细胞更具相似性, 在特定条件下更易于分化为皮肤角质形成细胞。④利用两种细胞成功构建组织工程皮肤,苏木精-伊红染色切片显示其具有一定的皮肤结构,且羊膜上皮细胞发生了初步分化。以上结果说明羊膜间充质干细胞与羊膜上皮细胞通过三维培养构建人皮肤组织是可行的。     

臂丛神经损伤患者膈神经移植肌皮神经的电生理观察

目的：评估膈神经功能测定在臂丛神经损伤神经移植前的应用价值,术后电生理观察神经移植恢复状况。方法：对50例臂丛神经损伤患者术前进行了膈神经功能测定,对其中10例膈神经功能正常者,行同侧膈神经移植肌皮神经手术,术后神经电生理随访观察肱二头肌肌电图及肌皮神经运动传导功能状况。结果：臂丛神经损伤患者约28％伴膈神经损伤,损伤的膈神经不能选择为移植动力神经。隔神经移植肌皮神经后,最早3个月出现再生电位,6个月后出现运动单位电位,12个月后运动单位电位明显增多。术后肱二头肌肌力18个月后恢复优良占80％。7例术后12个月肌皮神经引出运动神经传导电位。结论：膈神经功能测定在臂丛神经损伤患者术前可评估选择移植神经,术后电生理可随访观察神经功能恢复状况,对臂丛神经损伤患者的手术治疗有一定指导作用。     

膈神经移位至臂丛上干前股的临床应用及疗效分析

目的：报道膈神经移位至臂丛上干前股的临床应用，分析疗效欠佳的原因并探讨应对措施。方法：回顾白1999年3月-2005年2月行膈神经移位至臂丛上干前股术式的38例患者手术情况，对肌皮神经恢复情况进行随访并功能评定，并对影响疗效的各因素进行分析以探讨相应的防治措施。结果：获15个月以上随访患者共29例，优良率为62．1％，功能恢复优良组与非优良组患者的病程及牵拉伤比率存在显著性差异（P〈0.05）。再手术探查发现手术失败的原因有：神经吻接口张力大、存在臂丛的组成变异及多段损伤等。基于神经解剖特点，作者针对减低膈神经吻接口张力提出了手术改良措施并取得满意的疗效。结论：影响该术式疗效的因素有多种，严格把握手术适应症及术中仔细探查是提高治疗效果的关键；通过术式改良可有效降低神经吻接口张力，有助于神经恢复。     

209例产瘫患儿的神经电生理分析

目的:介绍分娩性臂丛神经损伤(产瘫)患儿神经电生理检测所见及应用价值.方法:对209例产瘫病例进行肌电图检测,测定息儿臂丛五大神经主要支配肌的肌电情况及运动诱发电位情况,并根据结果进行分类及加做同步兴奋检测.结果:第一型病例为C5、6损伤(肩外展、屈肘不能)共14例,占总病例数的6.7％;第二型病例为C5、6、7损伤(肩外展、屈肘,伸腕不能),共131例,占总病例数的62.7％,第三型病例为C5、6、7、8、T1损伤(单侧上肢瘫痪,但Horner征阴性),共63例,占总病例数的30.1％.另有单纯下干损伤伤(Klumpke麻痹)病例1例(0.5％).209例患儿分别检测正中神经、尺神经、桡神经、肌皮神经、腋神经及其支配肌损伤情况,分别为80例(38.3％)、80例(38.3％)、143例(68.4％)、199例(95.2％)及199例(95.2％).肩外展肌群活动时,肩外展肌群存在同步兴奋的有48例,不存在同步兴奋的有161例.结论:产瘫患儿Ⅰ型6.7％、Ⅱ型62.7％,大部分患儿未经手术均有不同程度的恢复.由于产瘫患儿动作的准确度不高、主动募集反应准确度较低,故正尖波、纤颤电位、峰值宽大电位就成为患儿神经损伤的定性依据.如患儿出现正尖波、纤颤电位,提示损伤较重,对确定是否需要手术探查非常有必要.术后定期进行电生理的复查,有利于恢复及对预后的判断.肩外展肌同步兴奋检测旨在明确患儿的外展障碍类型,以确定治疗方案、指导患儿家属对患肢关节进行被动活动,对进一步预防和减少关节挛缩的发生有重要意义.     

臂丛神经根性撕脱伤动物模型的研究

目的 研究臂丛神经根性撕脱伤实验动物模型。方法 选用Wistar大白鼠，取右下颌骨向下至胸大肌中部皮肤切口，显露胸大肌，分别切断胸大肌、胸小肌；暴露井剪断右锁骨，镜下解剖分离臂丛神经并紧贴近端根部将颈5至颈8剪断，造成臂丛神经根性撕脱伤模型，实验组用颈3、颈4神经修复臂丛中已损伤的颈5、颈6神经，对照组不做修复；用电生理及组织病理学观察神经肌肉组织变化，结果术后3个月病理检查发现，实验组中肌皮神经可见少量神经纤维长入，肱二共肌萎缩轻，失神经组之肌皮神经可见神经纤维变性、崩解、吸收，肱二头肌萎缩明显，电生理检查显示实验组与失神经组之诱发电位峰值电压与刺激电流比值及潜伏期时间与刺激电流强度之比值在统计学上有显著性差异（P〈0．05）。结论 该实验模型操作简单，科学，合理。为臂丛神经根性撕脱伤实验研究奠定了基础。     

超声引导技术在肌间沟臂丛神经两点阻滞中的应用

目的比较超声引导定位法与神经刺激器引导定位法用于肌间沟臂丛神经阻滞的效果。方法拟行上肢手术的患者90例随机分为3组(n=30),对照组:神经刺激器定位单点阻滞组;US组:超声引导与神经刺激器确认相结合定位单点阻滞组;UD组:超声引导与神经刺激器确认相结合定位两点阻滞组。各组均给予0.5%的罗哌卡因30 mL,其中UD组被阻滞的两支目标神经各给予15 mL。结果UD组阻滞平均起效的时间明显短于US组和对照组。UD组感觉神经阻滞完善率明显高于US组和对照组。结论超声引导下行肌间沟臂丛神经阻滞起效快,并发症少;超声引导下两点阻滞法可明显改善阻滞效果。     

椎管内臂丛前后根的显微解剖及其临床意义

目的:研究臂丛椎管内前后根的显微解剖,为臂丛撕脱伤的诊治提供解剖学基础。方法:在15例防腐灌注红色乳胶的成人尸体的颈胸段标本上,对椎管内臂丛前后根的位置、形态和血供进行观察和测量。结果:臂丛前后根之间有齿状韧带相间隔;前根起始处与脊髓中线的距离从上至下由C5的2.2mm逐渐增大到T1的3.1mm,后根则从C5的4.2mm逐渐减小到T1的2.7mm;前后根与脊髓纵轴的夹角从C5的51.4°、54.8°逐渐减小到T1的21.7°、19.9°;前后根的长度从C5的14.9mm、13.9mm逐渐增大到T1的21.1mm、19.0mm;前后根的直径均以C6最为粗大,分别为2.1mm、3.3mm,后根比相应前根粗;前后根的血供来自椎动脉、颈深动脉和颈升动脉发出的节段性动脉。结论:熟悉臂丛椎管内前后根的显微解剖有助于临床臂丛根性撕脱伤的诊治。