透骨消痛胶囊干预膝骨性关节炎软骨下骨重塑的分子机制**☆

背景：前期研究表明透骨消痛胶囊能有效治疗膝骨性关节炎,且对膝关节软骨有保护作用,软骨下骨重塑在骨性关节炎病理进程中起重要作用。 目的：观察透骨消痛胶囊干预骨性关节炎软骨下骨重塑的作用及并探讨其作用机制。 方法：新西兰大白兔分为正常组、模型组、壮骨关节丸组、透骨消痛胶囊组4组。除正常组外动物均按改良Hulth法造模。正常组、模型组兔每天给予生理盐水灌胃;壮骨关节丸组兔每天给予壮骨关节丸水溶液灌胃;透骨消痛胶囊组兔每天给予透骨消痛胶囊水溶液灌胃。 结果与结论：造模后6,9,12周,透骨消痛胶囊组软骨下骨Cyclin D1基因、胰岛素样生长因子1、细胞核因子κB受体活化因子配体mRNA表达均显著高于正常组(P < 0.05)。与模型组比较,造模后1周,透骨消痛胶囊组Cyclin D1 mRNA表达较低(P < 0.05);造模后6周,透骨消痛胶囊组细胞核因子κB受体活化因子配体表达较低(P < 0.05);造模后9,12周,透骨消痛胶囊组各项指标表达均较低(P < 0.05)。与壮骨关节丸组比较,造模1周后,透骨消痛胶囊组Cyclin D1 mRNA表达较低(P < 0.05);6周时透骨消痛胶囊组细胞核因子κB受体活化因子配体表达较低(P < 0.05);9,12周后,透骨消痛胶囊组胰岛素样生长因子1 mRNA表达较低(P < 0.05)。提示透骨消痛胶囊可改变软骨下骨重塑的速率和模式,最终减轻软骨下骨硬化。      

三七总皂苷干预股骨头缺血性坏死兔成骨细胞护骨素基因的表达

背景：前期研究已明确三七总皂苷能抑制乙醇诱导的兔骨髓基质干细胞成脂分化。 目的：进一步观察三七总皂苷对兔成骨细胞的增殖和分化以及骨保护素、细胞核因子κB受体活化因子配体mRNA表达的影响。 方法：白酒灌胃4周制备新西兰兔股骨头缺血坏死模型,随机分为生理盐水组、复方骨肽组和三七总皂苷组。通过组织块培养法提取各组兔成骨细胞,检测细胞的分化,骨保护素、细胞核因子κB受体活化因子配体基因表达情况,检测各目的基因杂交信号的强弱。 结果与结论：三七总皂苷组兔碱性磷酸酶活性、钙结节计数及骨保护素、细胞核因子κB受体活化因子配体的表达强度、骨保护素mRNA/细胞核因子κB受体活化因子配体mRNA均高于生理盐水组(P < 0.01);与复方骨肽组效果接近。证实三七总皂苷能够促进兔成骨细胞的增殖和分化,并能提高成骨细胞的骨保护素mRNA的相对表达量而对其细胞核因子κB受体活化因子配体mRNA有抑制作用。     

小分子肽对成骨前体细胞MC3T3-E1骨保护素和核转录因子κB受体活化因子配体表达的影响

背景：体内实验显示,小分子肽能明显增加去卵巢大鼠的骨钙含量,使其骨密度增加,能很好地预防骨质疏松。同时体外实验显示,小分子肽能促进小鼠成骨细胞和成骨前体细胞MC3T3-E1增殖、分化、矿化,并且可能是通过抑制核转录因子 p50和p65的表达来起作用。而小分子肽对骨保护素/核转录因子κB受体活化因子配体的影响尚不明确。 目的：观察小分子肽对MC3T3-E1在增殖、分化、矿化过程中骨保护素和RANKL表达的影响。 方法：以体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液为空白对照组,50,100 mg/L质量浓度小分子肽作用小鼠成骨前体细胞MC3T3-E1,分别于作用3,6,12,18,24,30 d后,收集细胞提取蛋白,Western Blot检测骨保护素和核转录因子κB受体活化因子配体蛋白的表达。 结果与结论：50,100 mg/L小分子肽作用MC3T3-E1后能明显促进作用骨保护素的表达(P < 0.01),而对核转录因子κB受体活化因子配体无明显影响。小分子肽作用后MC3T3-E1中骨保护素/核转录因子κB受体活化因子配体的比值要明显高于空白对照组(P < 0.01)。因此,认为小分子肽可以通过增加骨保护素的表达来影响骨保护素/核转录因子κB受体活化因子配体系统,间接地抑制破骨细胞的数量和功能。     

中药骨康调控成骨细胞核内结合因子α1的表达

背景：中药骨康在临床上治疗骨质疏松疗效明确,但其具体作用途径尚不清晰。 目的：假设中药骨康通过调节核内结合因子a1水平,控制其下游基因核因子κB受体活化因子配体和骨保护素表达,起到调控成骨细胞生长发育的作用。 方法：新生24 h内的SD乳鼠用于成骨细胞的分离培养。成年SD雌性大鼠用于制备药物血清,随机分为正常血清组和中药骨康组。2组大鼠按体表面积的方法给予中药骨康方的提取药物和生理盐水灌胃,连续给药1周。最后一次用药后2 h行心脏采血,分离血清。原代培养并传至第3代经碱性磷酸酶鉴定取得的大鼠成骨细胞,消化计数铺板并分为2组,以上述血清处理72 h,MTT法检测成骨细胞的增殖率,ELISA方法检测碱性磷酸酶分泌量并以相应吸光度值进行纠正,运用RT-PCR检测2组成骨细胞核内结合因子α1及其下游核因子κB受体活化因子配体和骨保护素mRNA表达情况。 结果与结论：中药骨康组成骨细胞骨保护素和核内结合因子a1 mRNA水平显著高于正常血清组,核因子κB受体活化因子配体蛋白和mRNA水平显著低于正常血清组(P < 0.01)。实验结果证实,中药骨康可通过影响核内结合因子a1表达,调控其下游基因核因子κB受体活化因子配体和骨保护蛋白表达和分泌,进而发挥治疗骨质疏松的作用。     

犬切牙压低移动过程中牙周组织骨保护素/核因子κB受体活化因子配体的表达

背景：骨保护素及核因子κB受体活化因子配体是调控破骨细胞生成和活化的关键因子,机械力可影响牙周膜细胞和成骨细胞骨保护素及核因子κB受体活化因子配体的表达。 目的：观察犬切牙压低移动过程中牙周组织中骨保护素/核因子κB受体活化因子配体的表达。 方法：采用微型种植体作为支抗,将犬切牙分别施加牵引力1,2,4,12周,并设置对照组进行比较。牵引后切取犬切牙连同牙龈及牙槽骨组织块,制作组织切片进行骨保护素及核因子κB受体活化因子配体免疫组织化学染色,用Image-Proplus软件半定量分析图像平均吸光度值。 结果与结论：与对照组相比,核因子κB受体活化因子配体和骨保护素分别在在施加牵引力1和2周表达最显著,其平均吸光度值在施加牵引力1和2周时可达到峰值(P < 0.05),随后逐渐下降,施加牵引力12周恢复至对照组水平。结果证实,正畸牙压低移动过程中核因子κB受体活化因子配体及骨保护素的表达变化规律与骨改建过程一致,骨保护素/核因子κB受体活化因子配体系统是牙周组织改建的重要调节因素。     

不同矫治正畸作用下牙周骨改建过程中压力侧相关因子的变化

背景：近年来研究表明核因子κB受体活化因子配体与正畸牙移动骨改建过程中破骨细胞的形成、分化和功能密切相关。 目的：观察不同矫治器正畸作用下兔牙周组织改建过程中压力侧组织核因子κB受体活化因子配体表达的变化,探讨不同矫治器的正畸效果。 方法：将64只健康大耳白兔随机分为4组：对照组、MBT矫治器组、Begg矫治器组、Damon Ⅲ矫治器组,每组16只。MBT矫治器组、Begg矫治器组、Damon Ⅲ矫治器组分别应用对应的矫治器对兔上颌切牙和第一磨牙进行矫治,近中移动牵引力为80 g;对照组不进行矫治。分别于矫治后第3,7,14,21天每组取4只白兔进行检测。 结果与结论：苏木精-伊红染色显示加力后各矫治器组压力侧牙周膜腔变窄,牙槽骨边缘出现骨吸收陷窝。抗酒石酸酸性磷酸酶染色显示,矫治7 d时,骨改建活跃,破骨细胞数量达到高峰;同时实时荧光定量PCR检测发现加力后压力侧牙槽骨组织中核因子κB受体活化因子配体mRNA的表达明显增高,并于加力后第7天达到最高峰,而后逐渐降低。加力第7天时,Damon Ⅲ矫治器组破骨细胞数量和核因子κB受体活化因子配体mRNA表达水平均明显高于MBT矫治器组和Begg矫治器组(P < 0.05)。提示在骨改建过程中核因子κB受体活化因子配体mRNA表达的变化规律与破骨细胞数量相一致,Damon Ⅲ矫治器的矫治效果优于MBT矫治器、Begg矫治器。     

吸烟促进牙周炎牙槽骨的吸收效应

背景：多项研究证实吸烟能够促进牙周炎性牙槽骨吸收。 目的：观察吸烟在牙周炎性牙槽骨吸收大鼠中的作用。 方法：24只大鼠随机分为3组,正常组：正常饲养,不给予其他处理;对照组：采用钢丝结扎法建立大鼠实验性牙周炎动物模型;实验组：在造模期间给予被动吸烟。8 周后将所有大鼠处死,取出牙周组织,利用苏木精-伊红染色观察牙周组织的病理学改变,运用免疫组织化学染色观察核因子活化因子受体配体和骨保护素的表达变化。 结果与结论：对照组和实验组大鼠造模8周后,实验组大鼠牙槽骨中核因子κB受体活化因子配体表达量高于对照组(P < 0.05),而对照组大鼠牙槽骨中骨保护素的表达量较实验组有明显上调(P < 0.05)。提示吸烟能够提高牙周炎大鼠核因子κB受体活化因子配体的表达,同时并可以降低骨保护素的表达变化,在一定程度上加重了牙周炎性牙槽骨的吸收。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

核因子κB受体活化因子配体诱导破骨细胞前体的培养与分化

背景：以往的研究多采用长骨机械分离法获得破骨细胞,破骨细胞为终末分化细胞,无法进一步增殖和传代。因此目前常用骨髓细胞诱导培养法和RAW264.7细胞诱导培养法获得大量的破骨细胞以满足实验需要。 目的：探讨细胞核因子κB受体活化因子配体诱导破骨细胞前体细胞分化为成熟破骨细胞的最佳方法。 方法：分离小鼠骨髓细胞后添加核因子κB受体活化因子配体与巨噬细胞集落刺激因子共同诱导或者取RAW264.7细胞单独加入核因子κB受体活化因子配体诱导破骨细胞的形成;分别给予不同浓度的核因子κB受体活化因子配体,观察生成破骨细胞的数量,评价核因子κB受体活化因子配体与破骨细胞生成的量效关系;采用膜联蛋白V-FITC联合PI染色进行流式细胞术分析破骨细胞形成过程中单核巨噬细胞的凋亡情况。 结果与结论：当核因子κB受体活化因子配体浓度为10 μg/L时,破骨细胞形成数量最多的时间点在第六至七天;而核因子κB受体活化因子配体浓度为100 μg/L时,高峰期出现在第四至五天。破骨细胞的形成数量随着核因子κB受体活化因子配体刺激浓度升高而增加,呈浓度依赖性,50 μg/L的核因子κB受体活化因子配体是破骨细胞形成数量与浓度关系曲线的转折点,高于150 μg/L以后破骨细胞形成数量的增幅明显放缓。核因子κB受体活化因子配体即能诱导单核巨噬细胞形成破骨细胞又可以促进其凋亡,通过破骨细胞计数比较发现在同一浓度(104/cm²)接种单核巨噬细胞后以30 μg/L的核因子κB受体活化因子配体诱导后,平均每单位核因子κB受体活化因子配体所获得的破骨细胞数量最多。提示骨髓细胞或RAW264.7细胞诱导破骨细胞的培养方法皆简单可行,细胞接种的最佳浓度为104/cm²;核因子κB受体活化因子配体的适宜刺激浓度为30-50 μg/L。     

补肾接骨中药对骨折修复的成骨作用及机制

背景：骨折愈合是成骨细胞与破骨细胞耦联相互作用相互影响促进骨质生长的过程,其中成骨细胞介导骨的形成,破骨细胞介导骨吸收,使骨重建处于一种动态平衡中,于动态平衡环境中促进骨生长,而目前研究多数倾向于单独的成骨或者破骨机制,但会忽略这两种细胞共同存在的环境下相互作用机制。 目的：观察补肾接骨中药对成骨与破骨细胞耦联中骨护骨素-核因子κB受体激活剂的配基-核因κB受体活化因子的影响及其在骨折治疗中的作用机制。 方法：分离小鼠成骨、破骨细胞并体外细胞培养,建立小鼠“成骨-破骨细胞共育系”作为研究平台,补肾接骨中药1.25,2.5,6.25 g/(kg•d)灌胃,空白对照组给予同等体积的生理盐水灌胃,每日1次,连续7 d。 结果与结论：共育培养24 h后,成骨细胞内碱性磷酸酶水平明显高于单纯培养的成骨细胞(P < 0.05)。实时PCR检测显示,共育体系细胞中碱性磷酸酶、Runx2及骨护骨素表达增加(P < 0.05),呈剂量依赖性(P < 0.05)。Western-blot检测显示,高浓度[6.25 g/(kg•d)]中药能明显促进骨护骨素、核因子κB受体激活剂的配基的表达,抑制核因子κB受体活化因子蛋白表达(P < 0.05)。结果证实,补肾接骨中药可动态调节骨护骨素-核因子κB受体激活剂的配基-核因子κB受体活化因子信号通路,对促进骨组织重建与恢复有着积极的作用。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

运动状态下白细胞介素6介导骨保护素相关因子信号通路对骨代谢的调节

背景：骨保护素-核因子κB受体活化因子配体-核因子κB受体活化因子信号通路是调节骨代谢的经典通路,白细胞介素6和该信号通路存在相关性,运动对骨代谢的影响机制与二者的调节作用密切相关。 目的：研究运动状态下白细胞介素6介导骨保护素-核因子κB受体活化因子配体-核因子κB受体活化因子信号通路对骨代谢活动的调节,揭示运动状态下此信号通路的内在联系。 方法：检索CNKI、EBSCO和Elsevier数据库中有关运动应激、白细胞介素6、骨保护素-核因子κB受体活化因子配体-核因子κB受体活化因子信号通路的论文,选取其中39篇具有代表性和最新研究进展的论文为参考文献进行分析整合,揭示运动、白细胞介素6及信号通路之间的关系。 结果与结论：目前研究表明白细胞介素6和骨保护素-核因子κB受体活化因子配体-核因子κB受体活化因子信号通路在骨代谢过程中密切相关,在不同运动负荷和强度状态下白细胞介素6和该信号通路的表达,呈现出特异性的运动应激的反应与适应。研究结果不仅有助于揭示运动健骨机制,而且可应用于骨关节病的预防与治疗领域。     

透骨消痛颗粒含药血清诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化

背景：骨髓基质干细胞根据环境而有不同的分化路径,在特定的环境中有分化为透明软骨细胞的趋势,可能为治疗骨性关节炎提供新思路。 目的：观察透骨消痛颗粒含药血清对骨髓基质干细胞向软骨分化的影响。 方法：取SD大鼠四肢建立体外培养的骨髓基质干细胞,取第3代骨髓基质干细胞进行干预,分为生理盐水血清组、透骨消痛颗粒水提物血清组、透骨消痛颗粒醇提物血清组、诱导软骨剂组、透骨消痛颗粒水提物血清+诱导软骨剂组、透骨消痛颗粒醇提物血清+诱导软骨剂组。Real time PCR及Western Blot检测Sox9、collagen Ⅱ、collagen Ⅹ mRNA及蛋白表达。 结果与结论：含药血清干预14 d后,Sox9、 collagen Ⅱ、collagen Ⅹ mRNA及蛋白表达水平,透骨消痛颗粒水提物血清组、透骨消痛颗粒醇提物血清组、诱导软骨组、透骨消痛颗粒水提物血清+诱导软骨剂组、透骨消痛颗粒醇提物血清+诱导软骨剂组明显高于生理盐水血清组(P < 0.05,P< 0.01),诱导软骨组、透骨消痛颗粒水提物血清+诱导软骨剂组、透骨消痛颗粒醇提物血清+诱导软骨剂组明显高于透骨消痛颗粒水提物血清组、透骨消痛颗粒醇提物血清组(P < 0.01),其中Sox9表达透骨消痛颗粒水提物血清+诱导软骨剂组高于诱导软骨。说明透骨消痛颗粒含药血清通过上调Sox9的表达,加速骨髓基质干细胞细胞向软骨细胞分化。     

透骨消痛颗粒水提与醇提物含药血清干预骨髓基质干细胞活性的实验研究

背景：骨髓基质干细胞根据环境而有不同的分化路径,在特定的环境中有分化为透明软骨细胞的趋势,可能为治疗骨性关节炎提供新思路。 目的：观察透骨消痛颗粒水提与醇提物含药血清对骨髓基质干细胞活性的影响。 方法：制备透骨消痛颗粒水、醇提物,108只SD大鼠随机摸球法均分为低、中、高剂量对照组、水、醇提物组,腹主动脉采血制备含药血清。取4周龄SD大鼠四肢骨髓基质干细胞,第3代同步化后用含药血清进行干预,MTT检测其活性,流式细胞仪检测其周期分布,Real time PCR检测Cyclin D1 mRNA表达,Western Blot检测Cyclin D1蛋白表达。 结果与结论：透骨消痛颗粒水、醇提物含药血清干预48 h后,软骨细胞的A值中高剂量组明显高于对照组(P < 0.01,P < 0.05);各组G₀/G₁期细胞,水、醇提物组明显低于对照组(P < 0.01),水提物组明显低于醇提物组(P < 0.05);各组增殖指数及Cyclin D1 mRNA及蛋白表达水、醇提物组明显高于对照组(P < 0.01),水提物组明显高于醇提物组(P < 0.05)。说明透骨消痛颗粒水醇提物含药血清通过上调Cyclin D1的表达,加速骨髓基质干细胞周期的进程,从而促进其增殖,且透骨消痛颗粒水提物的效果优于醇提物。     

建立小鼠成骨与破骨细胞相互作用的共育新体系

背景：众所周知,骨重建是骨组织中重要的生物学反应过程,其中成骨细胞与破骨细胞发挥了关键作用。但目前,关于骨重建中成骨与破骨细胞间信号传递的深层机制还不清楚。 目的：利用transwell技术,在体外建立一种成骨与破骨细胞的新型共育体系,为深入研究骨重建中成骨与破骨细胞的相互作用提供成熟的实验模型。 方法：采用MC3T3-E1成骨样细胞株与RAW264.7破骨前体细胞株,进行体外成骨与破骨细胞的诱导分化,并利用Transwell共培养板(0.4 µm聚酯膜)建立成骨与破骨细胞的共育体系。共培养6 d后,通过测定细胞活性和碱性磷酸酶(ALP)活力分析成骨细胞的增殖和分化活性,利用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、甲苯胺蓝(TB)染色、TRAP活性测定及扫描电镜技术观察破骨细胞的分化及骨吸收功能。 结果与结论：共培养体系中成骨样细胞的无限增殖能力减弱,而分化活性明显增强,同时破骨前体细胞被诱导分化为成熟的破骨细胞,并具有一定的骨吸收功能。因此,该共培养体系可用于骨重建中成骨与破骨细胞间信号通路的深层研究。     

传统中药对成骨细胞及骨钙素合成的影响

背景：成骨细胞体外培养及其中药干预是研究和开发中药治疗骨质疏松症的重要手段之一。 目的：观察中药对成骨细胞增殖、分化及对骨钙素合成的影响。 方法：收集不同类别中药载药血清对体外成骨细胞及骨钙素分泌影响的相关研究,进行实验数据分析,从细胞分子生物学水平认识传统中药影响成骨细胞合成骨钙素的作用。 结果与结论：部分单味中药和中药复方有促进成骨细胞增殖、分化及骨钙素的合成作用,并且不同中药成分对成骨细胞增殖和分化的促进作用及提高骨钙素表达水平不同,与这种中药载药血清浓度在一定范畴内呈正相关。通过对成骨细胞体外培养方法的筛选,找出促进细胞增殖和分化的药物及适宜剂量,对研制治疗骨质疏松症的药物具有积极促进作用。     

黄芪三仙汤干预成骨细胞护骨素及护骨素配体的表达

背景：长期临床研究表明黄芪三仙汤对骨质疏松症有一定的治疗作用,基础实验研究也表明黄芪三仙汤能改善实验动物的生物力学指标。在此基础上实验拟从细胞分子水平上探讨黄芪三仙汤对成骨细胞的相关作用。 目的：观察黄芪三仙汤对体外培养成骨细胞护骨素、护骨素配体基因调节的作用,探讨黄芪三仙汤治疗骨质疏松的作用机制。 方法：制备黄芪三仙汤和仙灵骨葆胶囊含药血清及空白血清,对体外培养新生SD大鼠成骨细胞进行干预,应用细胞形态观察、MTT、Western blot分析法及蛋白浓度测定法,观察各含药血清对体外培养成骨细胞的增殖及成骨细胞护骨素、护骨素配体表达的影响。 结果与结论：经药物干预后成骨细胞变为长梭形、条索状,融合成片,分界较为模糊,细胞生长较密集。黄芪三仙汤可明显促进成骨细胞护骨素蛋白浓度的提高(P < 0.01),同时也提高了护骨素配体蛋白浓度(P < 0.01),而护骨素/护骨素配体浓度比例水平明显升高(P < 0.01)。结果可见黄芪三仙汤可能是通过调节成骨细胞分化调控因子护骨素、护骨素配体的表达来调节成骨细胞的增长,从而实现其对骨质疏松症的治疗作用。     

透骨消痛胶囊含药血清对软骨细胞外基质表达的影响**◆

背景：软骨细胞代谢异常引起细胞外基质降解和修复失衡是骨性关节炎的重要病理变化。透骨消痛胶囊具有补肾柔肝、活血祛风的功效,临床实验证实其对防治骨性关节炎有较好疗效。 目的：观察透骨消痛胶囊含药血清对软骨细胞外基质表达的影响。 方法：取SD大鼠膝关节软骨建立体外培养的软骨细胞,第3代软骨细胞同步化后进行干预。50只SD大鼠抽签法随机分为5组,用药量按照人体与动物药物等效剂量换算,空白组：生理盐水进行灌胃;对照组：壮骨关节丸水溶液灌胃;实验组：透骨消痛胶囊水溶液按0.145,0.290,0.580 mg/(g•d)进行灌胃。各组均连续给药3 d,采血前禁食12 h,末次给药1 h后腹主动脉采血,制备血清。 结果与结论：Ⅱ型胶原免疫组织化学染色可见透骨消痛胶囊实验组Ⅱ型胶原表达强于空白组及对照组;透骨消痛胶囊实验组CollagenⅡ、蛋白聚糖、Aggrecan mRNA基因表达明显升高(P < 0.01),Cathepsin K mRNA基因表达明显降低(P < 0.01)。提示透骨消痛胶囊含药血清能上调软骨细胞CollagenⅡ、蛋白聚糖、Aggrecan mRNA基因表达,下调Cathepsin K mRNA基因表达,促进细胞外基质合成,调控细胞外基质和软骨细胞之间的动态平衡。关键词：透骨消痛胶囊;骨性关节炎;含药血清;软骨细胞;细胞外基质 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.21.004