兔脂肪干细胞体外诱导分化为胰岛β样细胞的可行性

背景：胚胎干细胞、胰腺干细胞、肝卵圆细胞、小肠上皮干细胞和骨髓间充质干细胞均可以在体外诱导分化为胰岛β样细胞,那么脂肪干细胞是否也可以呢？ 目的：探讨兔脂肪干细胞向胰岛β样细胞分化的可行性。 方法：以常规方法从兔脂肪抽吸物中分离、培养脂肪干细胞;传2代后,用高浓度葡萄糖(25 mmol/L)培养液DMEM以及碱性成纤维生长因子和尼克酰胺诱导兔脂肪干细胞向胰岛β样细胞分化。 结果与结论：第2代兔脂肪干细胞经过高糖诱导后,细胞形成细胞团;并且形成了双硫腙染色阳性的细胞团;免疫细胞化学表明诱导后细胞内的细胞胰岛素染色阳性。说明兔脂肪干细胞在体外可以定向诱导分化为胰岛β样细胞,这种胰岛β样细胞具有表达、储存胰岛素的功能。     

体外诱导胰腺干细胞向胰岛样细胞团的分化***☆

背景：目前由于胰岛来源匮乏,使得胰岛细胞移植治疗糖尿病无法满足临床需求,故体外将胰腺干细胞诱导分化为胰岛成为研究焦点。 目的：于体外将小鼠胰腺干细胞诱导成胰岛样细胞团并对其进行相关检测,探寻一种胰腺干细胞体外诱导分化成胰岛及鉴定的技术和方法。 方法：体外获得纯化的小鼠胰腺干细胞,采用联合诱导剂对其进行成胰岛方向的诱导分化,并对诱导形成的胰岛样细胞团进行形态学观察、双硫腙染色、RT-PCR和Western blot检测。 结果与结论：实验通过细胞形态学和细胞生长特性的观察以及免疫细胞化学染色证实体外成功获得了小鼠胰腺干细胞,采用联合诱导剂将其诱导成胰岛样结构,呈球形,以较细长的蒂部与瓶底连接,双硫腙染色将其染成铁红色。RT-PCR和Western blot 法可分别检测到胰岛样细胞团的胰岛素mRNA和胰岛素蛋白。结果证实小鼠胰腺干细胞可体外诱导分化成含β细胞的胰岛样细胞团。 关键词：胰腺干细胞;诱导;胰岛样细胞团;干细胞培养;小鼠 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.10.020     

人脐静脉间充质干细胞向胰岛β样细胞诱导分化的实验研究

目的:探讨人脐静脉内皮及内皮下间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的可行性。方法:采用胶原酶消化分离人脐静脉内皮及内皮下细胞进行贴壁培养;传代培养后,用高浓度葡萄糖(25mmol/l)培养液DMEM(含10?S)以及bFGF(basic Fibroblast Growth Factor)和尼克酰胺诱导脐静脉间充质干细胞向胰岛β样细胞分化。倒置显微镜下观察间充质干细胞诱导后形态变化,观察是否形成细胞团;用胰岛β细胞特异双硫腙染色鉴定诱导后细胞内是否含有高浓度游离锌离子;免疫细胞化学(Envision法)鉴定诱导后细胞是否分泌胰岛素。结果:第2代脐静脉间充质干细胞经过高糖诱导大约10天后,形成细胞团;呈双硫腙染色阳性;免疫细胞化学表明诱导后细胞内的细胞胰岛素染色阳性。结论:人脐静脉内皮及内皮下分离出的间充质干细胞在体外可以定向诱导分化为胰岛β样细胞,这种胰岛β样细胞具有胰岛素的分泌功能。     

胚胎干细胞定向分化为胰岛素分泌细胞的研究进展

胰岛移植是治疗糖尿病的有效方法之一。胚体干细胞在体外定向分化为胰岛素分泌细胞为胰岛移植提供了足够的细胞来源。概述了近年来胚胎干细胞向胰腺细胞系的诱导分化所取得的进展。     

Pdx1基因修饰的人脐带间充质干细胞体外诱导分化为胰岛β样细胞

本研究探讨胰十二指肠同源框因子-1(Pdx1)基因修饰的人脐带间充质干细胞(MSCs)体外分化为胰岛β样细胞。采用携带Pdx1基因的重组腺病毒感染MSCs 7d,联合细胞因子分阶段诱导分化。RT-PCR及Westernblot、免疫细胞化学法检测诱导后细胞胰岛素相关基因表达变化;化学发光法检测诱导后细胞培养液上清中胰岛素和C肽的分泌水平。用流式细胞术检测胰岛素阳性细胞百分率。结果显示:诱导转入Pdx1基因的人脐带MSCs后,梭形细胞聚集形成胰岛样细胞团,双硫腙染色胞浆呈亮红色;诱导后的细胞表达Pdx1、胰岛素、C肽和葡萄糖转运体2基因;诱导细胞分泌胰岛素和C肽,并且在高糖作用后,胰岛素和C肽分泌增加;诱导后胰岛素阳性细胞百分率为(11.61±4.83)%。结果表明,Pdx1修饰人脐带MSCs在体外能够诱导分化为胰岛β样细胞。     

大鼠胰腺提取液体外诱导肌源性干细胞分化为胰岛素分泌细胞

目的:探讨大鼠胰腺提取液(RPE)对大鼠肌源性干细胞(MDSCs)定向诱导分化为胰岛素分泌细胞的作用.方法:RPE诱导MDSCs通过形态学观察、双硫腙(DTZ)染色、免疫细胞化学显色、葡萄糖刺激实验和RT-PCR,对诱导细胞进行体外结构和功能鉴定.结果:RPE诱导后第5日有胰岛样结构出现;免疫细胞化学显示,诱导后第12日细胞团表达胰岛素、胰高血糖素,而未诱导组细胞不表达上述蛋白;RT-PCR结果表明.诱导后第6日检测到PDX-1的表达,诱导后第12日检测到胰岛素1、胰岛素2、胰高血糖素和葡萄糖转运体2基因的表达.结论:体外经RPE诱导,大鼠肌源性干细胞可定向分化为胰岛素分泌细胞.     

体外定向诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛样细胞

背景：人脐带间充质干细胞具有获取容易、免疫原性低等优点,目前尚缺乏体外诱导其分化为胰岛样细胞的成熟方案。 目的：探讨人脐带间充质干细胞在体外一定条件下分化为胰岛样细胞的可能性。 方法：无菌条件下分离培养人脐带间充质干细胞,细胞传3代后,采用两步法诱导其向胰岛样细胞分化：第1步,加入含100 μg/L β-神经生长因子,4 nmol/L ActivinA,10 mmol/L 尼克酰胺,25 μg/L表皮生长因子,体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养7 d;第2步,将诱导液换为含10 mmol/L尼克酰胺,10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子,1%胰岛素-转铁蛋白-硒的DMEM/F12培养基,诱导时间为14 d。对照组单纯加入DMEM/F12培养基进行培养。 结果与结论：诱导2周后脐带间充质干细胞开始聚集成团,诱导3周后,葡萄糖刺激试验阳性、PDX-1和Insulin基因表达。而对照组细胞无胰岛素分泌,胰岛细胞相关基因表达阴性。实验成功地将脐带间充质干细胞诱导成了胰岛样细胞。     

骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛样细胞的降血糖作用

背景：移植胰岛及胰岛细胞治疗糖尿病已初见成效,但由于胰岛来源匮乏和免疫排斥反应而研究受阻。 目的：移植将大鼠骨髓间充质干细胞在体外诱导分化为胰岛样细胞,观察其对糖尿病大鼠的治疗作用。 方法：将大鼠骨髓间充质干细胞用碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子等诱导,免疫细胞染色等检测诱导情况。SD大鼠腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病模型,建模成功后,随机分为对照组移植诱导胰岛样细胞的实验组,实验组经肾包囊移植诱导后的胰岛样细胞,对照组移植相同体积生理盐水,观察移植后糖尿病大鼠血糖和体质量变化。 结果与结论：大鼠骨髓间充质干细胞体外经肝细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等因子诱导后可以向胰岛样细胞转化。细胞移植后,对照组大鼠血糖无明显变化(P > 0.05),实验组大鼠血糖与对照组和移植前相比较,明显降低(P < 0.05)。大鼠骨髓间充质干细胞经含肝细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等的诱导体系可诱导成胰岛样细胞,经诱导的细胞有一定胰岛素分泌能力,将诱导后细胞通过肾包囊途径移植入糖尿病大鼠体内,可降低大鼠血糖水平。     

体外诱导胎儿骨髓间充质干细胞向胰岛β样分泌细胞的分化

背景：体外诱导人骨髓间充质干细胞定向分化为胰岛样细胞,目前尚无成熟的鉴定方案。 目的：探讨胎儿骨髓间充质干细胞在适当的条件下体外分化为胰岛样分泌细胞的可能性。   方法：将胎儿骨髓间充质干细胞与胎儿胰岛素细胞分别接种于Transwell 双层细胞培养板上下层共培养。对照组中的骨髓间充质干细胞仅用胰岛细胞培养基培养。倒置相差显微镜观察胎儿骨髓间充质干细胞、胎儿胰岛细胞的形态,放射免疫分析法检测共培养刺激下胰岛素的分泌情况。 结果与结论：未经诱导的骨髓间充质干细胞呈长梭形贴壁生长,与胰岛细胞共培养的骨髓间充质干细胞逐渐变圆,并聚集成团,共培养9 d后骨髓间充质干细胞经RAI检测分泌大量胰岛素,DTZ染色为阳性,细胞免疫化学检测阳性。而对照组无胰岛素释放。提示在适当的培养条件下,胎儿骨髓间充质干细胞具有向胰岛素分泌细胞分化的能力。     

胰岛干细胞研究进展

胰岛干细胞移植是治疗糖尿病的一条新途径，它可避免胰岛移植治疗糖尿病所面临的胰腺供体匮乏及长期使用免疫抑制剂而产生严重副作用的问题。本文将对有关胚胎干细胞及成体干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞，胰岛干细胞的分子标志，及胰岛干细胞的临床应用做一简要概述。     

诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构的实验研究

目的建立一种体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构的技术方法。方法体外诱导人胚胎胰腺干细胞分化为胰岛细胞，将胰岛细胞制备成浓度分别为1×10^4／ml、3×10^4／ml、1×10^5／ml、3×10^5／ml（1×10^4／ml、3×10^4／ml、1×10^5／ml、3×10^5／ml组）单细胞悬液，在含有细胞外基质（ECM）的培养基中悬浮培养24h以诱导形成胰岛样结构，在荧光体视显微镜下观察胰岛样结构的形态和大小；采用免疫荧光染色方法检测胰岛样结构中ECM成分及其细胞组成与定位。将胰岛样结构分别在含5．6和30．0mmol／L葡萄糖的培养基中体外培养2h，采用放射免疫法测定上清中胰岛素水平。建立糖尿病大鼠模型，经门静脉将胰岛样结构移植至大鼠肝脏，移植后连续3d经鼠尾静脉检测血糖水平。结果90％人胚胎胰腺干细胞分化的胰岛细胞形成了胰岛样结构，其包膜、大小均与天然人胰岛组织结构相似；以形成直径150μm大小胰岛样结构的比例为标准，比较各组细胞浓度与胰岛样结构形成率的关系，结果显示分别与1×10^4／ml、3×10^4／ml、3×10^5／ml组（25．0％±2．5％、28．0％±3．0％、21．5％±2．5％）相比，1×10^5／ml组胰岛样结构形成率最佳（36．5％±4．0％，均P〈0．01）。胰岛样结构包膜上含有与天然人胰岛组织类似的ECM成分，且其中含有胰岛素、胰高血糖素和C-肽阳性细胞，其细胞比例与分布均与天然人胰岛组织类似。30．0mmol／L高糖浓度刺激后胰岛样结构胰岛素释放水平[（110±12）μIU／ml]较5．6mmol／L基础糖浓度[（59．5±8．0）pIU／ml]明显增加（P〈0，01），胰岛样结构移植后糖尿病大鼠血糖水平较移植前均明显降低（P〈0．01）。结论本研究建立的技术方法可以将干细胞分化的胰岛细胞在体外大量、快速、高效地诱导形成具有功能的胰岛样结构。     

In vitro cultivation of islet-like cell clusters from human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells

A major obstacle to successful islet transplantation for both type 1 and 2 diabetes is an inadequate supply of insulin-producing tissue. In vitro transdifferentiation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells (UCB-MSCs) into insulin-producing cells could provide an abundant source of cells for this procedure. For this study, we isolated and characterized human UCB-MSCs and induced them in vitro to differentiate into islet-like cell clusters using a 15-day protocol based on a combination of high-glucose, retinoic acid, nicotinamide, epidermal growth factor, and exendin-4. These clusters appeared about 9 days after pancreatic differentiation; expressed pancreatic beta-cell markers, including insulin, glucagon, Glut-2, PDX1, Pax4, and Ngn3; and could synthesize and secrete functional islet proteins at the end of the inducing protocol. The insulin-positive cells accounted for (25.2-3.36)% of whole induced cells. Although insulin secretion of those insulin-producing cells did not respond to glucose challenge very well, human UCB-MSCs have the ability to differentiate into islet-like cells in vitro and may be a potential new source for islet transplantation.     

脂肪源性干细胞的体外分离培养与鉴定

背景：脂肪间充质干细胞来源丰富、取材方便、体外有较强增殖能力并具有多向分化的潜能,有望成为组织工程的种子细胞。 目的：体外分离培养SD大鼠脂肪干细胞并进行鉴定。 方法：取SD大鼠腹股沟区皮下脂肪组织,0.075%I型胶原酶消化分离、培养脂肪源性干细胞,倒置相差显微镜下观察脂肪源性干细胞的细胞形态和增殖特征。取第3代细胞用MTT比色法描绘生长曲线,免疫荧光法鉴定干细胞标志物CD44,含有体积分数10%胎牛血清、地塞米松和胰岛素的DMEM/F12定向诱导成脂分化,油红“O”染色成脂分化鉴定。免疫组化法鉴定向神经细胞诱导分化的结果。 结果与结论：分离出的大鼠脂肪源性干细胞生长曲线呈“S”形,强烈表达干细胞标志物CD44。成脂诱导分化经油红“O”染色呈橘红色。向神经细胞诱导分化后表达神经元标志物神经元特异性烯醇化酶。说明SD大鼠脂肪源性干细胞在体外具有易于分离培养和扩增,表达间充质干细胞相关表型,特定条件下可诱导分化的特点。     

人骨髓源干细胞向胰岛素分泌细胞分化(英文)

目的：探讨人骨髓源干细胞向具有功能的胰岛素分泌细胞分化的可能性。方法：从人骨髓分离间充质干细胞。采用表皮生长因子、β-巯基乙醇和高糖培养基诱导其向胰岛素分泌细胞分化。经诱导后,用RT-PCR检测胰岛β细胞相关基因的表达,并采用免疫细胞化学染色检测胞浆胰岛素的表达。此外,诱导后细胞分泌的胰岛素定量及胰岛素释放实验将采用化学发光法进行检测。将经诱导后的细胞移植到糖尿病小鼠的右侧肾被膜下。在移植后16 d持续检测小鼠的血糖水平,最后对右侧肾脏进行免疫组化检测。结果：经诱导后,细胞能表达胰岛β细胞相关基因;免疫细胞化学染色也能检测到胞浆有胰岛素的表达;而且这些细胞能对糖刺激有所反应。细胞被移植到糖尿病小鼠的肾被膜下,能起降血糖作用。其肾脏的免疫组化显示：肾被膜下有胰岛素阳性细胞。结论：人骨髓源干细胞具有向胰岛素分泌细胞分化的潜能,这将为糖尿病细胞治疗提供丰富的细胞来源。     

Induced differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem modified by cells Pdx1gene into islet beta-like cells in vitro

This study was to explore the induced differentiation of human mesenchymal stem cells (MSCs) modified by pancreatic and duodenal homeobox factor 1 (Pdx1) gene into insulin-producing cells in vitro. After recombined adenovirus vector with Pdx1 gene infected MSCs for 7 d, cells were induced by induction factors. The genes' expressions related to islet beta cells such as Pdx1, insulin, glucose transporter-2 (Glut2), were detected with RT-PCR, immunocytochemistry and Western blot. The levels of insulin and C peptide secretion were examined with chemiluminescence immunoassay. Insulin(+) cell rate was detected by flow cytometry. After infected by recombined adenovirus with Pdx1 and combined with induction factors, MSCs were aggregated and islet-like cell clusters formed. Dithizone staining of these cells was positive. The genes' expression related to islet beta cells, such as Pdx1, insulin, Glut2, could be detected. After induction, the islet-like cell clusters secreted insulin and C peptide. The levels of insulin and C peptide secretion increased with glucose stimulation. Insulin(+) cell rate was (11.61 +/- 4.83)%. It could be concluded that Pdx1 gene modified MSCs from human umbilical cord could be induced to differentiate into islet beta-like cells.     

脐带源间充质干细胞与大鼠胰腺细胞共培养向胰岛样细胞分化及移植治疗1型糖尿病

背景：脐带Wharton’s Jelly中间充质干细胞可以向胰岛样细胞诱导分化。 目的：验证脐带源间充质干细胞与大鼠胰腺细胞共培养向胰岛样细胞诱导分化的可能性,并观察移植后对糖尿病大鼠血糖的影响。 方法：分离、诱导、传代脐带Wharton’s Jelly中间充质干细胞,再与大鼠胰腺细胞共培养,诱导成胰岛细胞团样组织。将大鼠分为3组,正常对照组不进行移植及造模;模型组仅制备糖尿病大鼠模型;实验组造模后将胰岛样细胞移植入糖尿病大鼠肾脏包膜。 结果与结论：脐带Wharton’s Jelly细胞培养中有细胞从组织块中爬出,第7天形态发生变化,贴壁细胞部分变成梭形。分离培养的细胞表达具有间充质干细胞表面特有标志CD44、CD29、CD105,不表达CD34、CD45、CD14。诱导第7,10天PDX-1及人胰岛素强染色;胰岛素及C-肽浓度较单纯培养组明显升高;PDX-1及人胰岛素mRNA诱导第7、10天较高表达。移植第1周大鼠尾尖血糖链脲佐菌素实验组明显低于模型组(P < 0.01),但明显高于正常照组(P < 0.01)。8周链脲佐菌素实验组肾脏被膜下发现胞核染棕色染色的Brdu阳性、胞浆棕色染色的胰岛素阳性细胞。结果表明,脐带Wharton’s Jelly中存在脐带源间充质干细胞,与大鼠胰腺细胞共培养可促进间充质干细胞向胰岛样细胞诱导分化,移植入糖尿病大鼠肾脏被膜下,可显著降低糖尿病大鼠血糖。     

基因转染脐带间充质干细胞与丝素蛋白构建组织工程脂肪

背景：目前国内外构建组织工程脂肪的方法并不完善,虽然构建出了脂肪,但效果不理想。 目的：探讨一种新的构建组织工程脂肪的方法,观察携带重组人胰岛素基因慢病毒载体转染的人脐带间充质干细胞与丝素蛋白复合后在Wistar大鼠体内构建组织工程脂肪的能力。 方法：分离培养人脐带间充质干细胞,将携带重组人胰岛素基因慢病毒载体以最适MOI=10转染人脐带间充质干细胞,将转染组与未转染组(对照组)的人脐带间充质干细胞分别接种于丝素蛋白支架,移植于Wistar大鼠背部皮下。移植后12周取材,行荧光原位杂交技术鉴定、组织形态学和扫描电镜观察。 结果与结论：①油红O染色显示,两组移植物均呈阳性,证明移植物已在体内合成为脂肪组织,转染组脂肪样细胞数量明显高于对照组(P < 0.01)。②苏木精-伊红染色显示,两组移植物组织结构与正常脂肪组织相似,可见明显新生血管。转染组支架材料降解明显,炎性细胞浸润明显少于对照组,新生血管数量也多于对照组。③扫描电镜观察提示,转染组移植物内脂肪样细胞聚集成团,其结构与正常脂肪组织相似;对照组脂肪样细胞散在分布于支架孔隙内。④提示胰岛素基因能明显促进人脐带间充质干细胞成脂肪化,携带重组人胰岛素基因慢病毒载体转染的人脐带间充质干细胞与丝素蛋白支架复合后,在Wistar大鼠体内能构建出组织工程化脂肪组织,其结构类似正常脂肪组织。