人宫颈癌细胞的体外培养及鉴定*

背景：由于肿瘤存在个体差异,对癌株的研究不能准确反映个体之间的差异,原代细胞培养则与体内状态更相近。 目的：体外培养建立宫颈癌细胞原代培养方法。 方法：采用胰蛋白酶及Ⅰ型胶原酶联合消化法从23例新鲜宫颈癌组织获取宫颈癌细胞,测定其细胞生长曲线,并用免疫荧光染色检测细胞表面标记物CD44、CK17进行鉴定。 结果与结论：23例中有21例成功从宫颈癌组织中获取宫颈癌细胞并能连续传代,稳定增殖,免疫荧光染色显示宫颈癌细胞表面标记物CD44、CK17表达呈阳性。说明胰蛋白酶及Ⅰ型胶原酶联合消化法能成功分离原代宫颈癌细胞。 关键词：原代培养;鳞状上皮细胞;宫颈癌;增殖;胰蛋白酶 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.11.014     

一种高效实用的人卵巢表面上皮细胞培养方法

背景：体外分离培养纯度高、活力强且生物学特性稳定的卵巢表面上皮难度很大,目前原代培养主要采用组织块贴壁法和酶消化法,但这两种方法在取材、细胞活力及细胞纯度上都存在一定的问题。 目的：建立一种高效实用的人卵巢表面上皮分离、培养和鉴定方法。  方法：创新性地运用细胞刷刷取人卵巢表面上皮,以红细胞裂解法、差速贴壁法对细胞进行分离纯化,并向无血清DMEM-F12培养基中添加人表皮生长因子进行细胞培养。在倒置显微镜下观察细胞形态,应用苏木  精-伊红染色和免疫细胞化学染色法对细胞进行鉴定,并绘制生长曲线。  结果与结论：卵巢表面上皮培养24 h开始贴壁生长,7-12 d后基本达到融合,细胞呈多角形或扁平型,透光性及折光性强。细胞形态符合正常上皮细胞特性,所分离的细胞几乎完全表达上皮细胞表面标志物CK19。细胞生长良好,可以传6-8代,细胞生长曲线呈“S”形,纯度达95%以上。结果提示细胞刷取培养法操作简单,能够快速分离获得大量卵巢表面上皮,所获得的细胞经红细胞裂解法和差速贴壁法处理后纯度达95%以上,且细胞生长稳定。     

一种同时培养原代神经元和原代星形胶质细胞的实验方法

目的 建立一种简便实用的可同时提取原代神经元和原代星形胶质细胞的培养方法.方法 选用出生24 h的SD乳鼠,75％乙醇消毒,断脊法处死.用眼科镊拨开脑膜各层,取出完整大脑.游离海马,剥离血管,木瓜蛋白酶消化,然后吹打、离心、过滤,以合适密度种植于相应培养皿.4h后更换培养基,以后每2天半量换液培养.第5天用免疫荧光法鉴...     

人胸腺组织原代培养细胞与人类免疫缺陷病毒间的相互作用

背景：人类免疫缺陷病毒能够结合人胸腺的细胞CD4受体,从而导致CD4细胞活性降低。 目的：观察人胚胎胸腺组织原代培养与人类免疫缺陷病毒相互作用关系。 方法：取人胎胸腺组织进行原代细胞培养,取胸腺的细胞与人类免疫缺陷病毒1 ⅢB混合培养设为实验组,设置不加人类免疫缺陷病毒培养的胸腺的细胞为对照组。 结果与结论：透射电镜观察显示,培养40 h,人类免疫缺陷病毒诱导的胸腺的细胞内即可发现大量艾滋病病毒颗粒。MTT法和免疫组织化学染色检测结果显示,培养40 h~22 d,HIV诱导胸腺的细胞吸光度值均显著低于对照组(r=0.9733,P < 0.05),人类免疫缺陷病毒诱导胸腺的细胞膜上和细胞浆Fas-L阳性表达率均升高(P < 0.05)。说明人类免疫缺陷病毒可致原代培养的人胚胎胸腺的细胞活性降低。     

改良法原代培养人脂肪间充质干细胞及其鉴定

背景:采用常规酶消化法提取人脂肪间充质干细胞,由于消化的时间过长,导致获得的细胞活性变差,为满足组织工程对种子细胞数量的需求,该实验旨在寻找一种改良的人脂肪间充质干细胞培养方法.目的:胶原酶Ⅰ消化联合组织块培养法获取人脂肪间充质干细胞并进行相关生物学特性的鉴定.方法:将脂肪组织剪碎后分别应用胶原酶Ⅰ消化联合组织块培养法...     

膀胱上皮细胞的体外原代培养方法

背景：国内外获得原代人正常膀胱上皮细胞的方法包括酶消化培养法、刮削培养法、组织块培养法,这些方法各有优缺点,培养基中成分多不易把握,效率不高。 目的：分析人膀胱上皮细胞原代培养的最佳方法。 方法：在同一实验条件下,采用酶消化培养法、刮削培养法、组织块培养法3种不同的原代细胞培养方法培养人正常膀胱黏膜膀胱上皮细胞。 结果与结论：酶消化培养法、刮削培养法、组织块培养法各组膀胱上皮细胞培养成功率分别为13.3%,26.7%,86.7%,3组间比较差异有非常显著性意义(P < 0.001)。3组培养的人膀胱上皮细胞角蛋白AE1/AE3荧光染色均呈阳性。说明组织块培养法是一种简单,短期内可扩增出较多纯净的膀胱上皮细胞的原代培养方法。     

一种简易的人原代肝细胞分离培养方法***☆

背景：采用原位两步灌流法分离肝细胞数量多,活性高,但灌流装置价格昂贵,操作环节多,技术要求高,所需时间长,易污染,限制了在一般实验室及人原代肝细胞在医学中的应用。 目的：建立人原代肝细胞体外分离培养方法。 方法：采用多点穿刺灌注方法将预温38 ℃的前灌流液及Ⅱ型胶原酶溶液灌依次灌入人肝脏组织中,经消化及离心后获得人原代肝细胞;倒置显微镜和电镜观察细胞形态特征,并鉴定。 结果与结论：经多点穿刺灌注法消化分离后可获得约5×105个肝细胞,分离获得的肝细胞活率达90%;细胞培养24 h后呈铺路石样生长;电镜示肝细胞呈典型形态特征：细胞核大,胞质少;培养的肝细胞 PAS糖原染色阳性,白蛋白表达阳性。说明多点穿刺灌注法分离人原代肝细胞简单易行,肝细胞产量高、活力好、纯度高,分离培养的肝细胞具有特异性生物学功能表达,适宜在一般条件实验室推广应用。      

人卵巢壁层颗粒细胞和卵丘细胞体外分离及原代培养的比较

目的:为建立合适卵巢功能研究的细胞模型,本研究比较了人卵巢壁层颗粒细胞(mural granulosa cells,MGCs)与卵丘细胞(cumulus cells,CCs)体外分离及原代培养的效果。方法:收集16例行辅助生殖技术治疗患者取卵日的卵泡液及其卵丘-卵母细胞复合物(223个),采用密度梯度离心法分离MGCs,机械切割法+酶解法分离CCs。应用台盼蓝染色法比较CCs与MGCs的细胞总数和存活率,通过流式细胞术检测卵泡刺激素受体(follicle stimulating hormone receptor,FSHR)的表达来鉴定CCs与MGCs的细胞纯度,qPCR和Western blot方法检测微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)、P62和Bax mRNA和蛋白的表达水平。结果:与MGCs相比,CCs的分离耗时少,细胞存活率高(P<0.05),体外培养的细胞延展性好;流式细胞术显示分离后的CCs与MGCs的FSHR表达量分别为(92.23±2.66)%和(81.33±6.57)%,差异...     

原代培养人增生性瘢痕成纤维细胞的生物学行为

背景：增生性瘢痕组织的形成是创面愈合过程中不可避免的,但是增生性瘢痕组织的形成产生很多不良的影响。 目的：建立可靠的人增生性瘢痕成纤维细胞的原代培养方法。 方法：采用组织贴壁法和消化法分别进行人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞的原代培养,使用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基,37 ℃,体积分数5%CO2,饱和湿度下培养,分别描述其生长曲线、形态及波形蛋白的表达。 结果与结论：组织贴壁法人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞培养成功,20-40 d可传第1代,以后每7-10 d可传1代,细胞为长梭形,波形蛋白表达阳性;消化法培养人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞成功,15-20 d细胞可融合成片,细胞为长梭形,波形蛋白表达阳性。进一步证实两种方法进行人增生性瘢痕成纤维细胞的原代培养均培养成功。     

体外培养人羊膜上皮细胞的表型及分化能力

背景：人羊膜上皮细胞具有多系分化能力,是再生医学中重要的细胞来源。目前的研究多集中于对其分化能力的考察,而体外培养过程中羊膜上皮细胞的生物学特征如何变化尚不清楚。 目的：分析体外培养对人羊膜上皮细胞生长、表型及向心肌样细胞分化的能力等生物学特性的影响,探讨原代人羊膜上皮细胞干性标志物SSEA-4的表达水平与人羊膜上皮细胞生物学特性变化之间的关联性。 方法：使用统一分离方法获得原代羊膜上皮细胞并进行体外培养。利用CCK-8、流式细胞仪及real-time PCR等手段检测不同培养阶段人羊膜上皮细胞的增殖、表型以及向心肌样细胞分化的能力。 结果与结论：不同胎儿样本来源的原代人羊膜上皮细胞的SSEA-4表达在26.7%-97%,存在很大的个体差异。并且,随着传代次数的增加,人羊膜上皮细胞的SSEA-4表达水平显著降低,其下降程度与原代SSEA-4的表达水平无关。另外,培养后人羊膜上皮细胞的心肌分化潜能也存在很大个体差异,且其差异与原代人羊膜上皮细胞的SSEA-4表达水平的高低无关。结果提示,不同胎儿样本来源的原代人羊膜上皮细胞的SSEA-4表达水平受到个体差异的影响,需要建立更准确的临床样本筛选指标来稳定获得原代高表达SSEA-4的胎儿样本,以实现对人羊膜上皮细胞的质量监控。另外,体外培养过程中SSEA-4的表达水平受到培养条件的影响,需要继续优化培养条件以维持其高表达。此外,人羊膜上皮细胞向心肌样细胞分化的能力受到样本个体差异以及培养条件的影响,在今后还需要进一步研究。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

鱼藤素可影响斑马鱼胚胎Wnt信号通路相关基因的表达

背景：前期研究发现,在斑马鱼早期发育的不同时期,经过一定浓度鱼藤素处理的胚胎表现出不同程度的发育延缓和表型异常。 目的：观察斑马鱼早期胚胎发育过程中鱼藤素对wnt信号通路相关基因表达的影响。 方法：收集孵育至shield期的斑马鱼胚胎于6孔板中,加入0.6 μmol/L浓度的鱼藤素溶液,避光处理,28 ℃培养箱中孵养。用0.1%二甲基亚砜溶液作为对照组,相同条件培养。在受精后6,8,10,12,14,24 h时用正置荧光显微镜拍照观察鱼藤素处理后斑马鱼胚胎发育表型。实时荧光定量核酸扩增检测鱼藤素作用前后目的基因表达水平的变化。 结果与结论：shield期处理的斑马鱼胚胎在bud期停止生长;wnt信号通路上的wnt9a,wnt10b和axin2以及与wnt信号具有密切联系的snail1b,Jnk2表达发生显著变化,其中wnt9a,wnt10b,axin2,snail1b表达下调,Jnk2表达上调。结果提示鱼藤素对斑马鱼体内wnt信号具有负调节作用。     

不同代次兔髓核细胞的形态学特征和生物学性状

背景：椎间盘退变是个慢性、复杂的过程,然而椎间盘退变其发生机制尚未完全阐明,很难自行修复。近年来研究细胞移植治疗椎间盘退行性变尚处在实验室阶段。研究髓核细胞的生物学性状可为研究椎间盘退变机制、组织工程构建椎间盘、基因治疗等提供理论依据。 目的：研究兔不同代次髓核细胞的生物学特性,旨在找出合适的种子细胞去治疗椎间盘退变性疾病。 方法：从新西兰大耳白兔椎间盘髓核组织中,分离并培养髓核细胞同时进行培养传代,对原代及第3,4代髓核细胞进行苏木精-伊红染色观察细胞形态学变化;甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学法检测髓核细胞内聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达;反转录PCR法测定Ⅱ型胶原和聚合蛋白聚糖mRNA的表达水平,观察各代髓核细胞生物学特性的变化。 结果与结论：兔椎间盘髓核细胞可以在体外培养并进行传代,原代髓核细胞一般需7 d左右贴壁,形状呈类圆形或多角形,原代和第3代髓核细胞都呈圆形或多角形,活力较强,苏木精-伊红染色后细胞核被染成均一蓝黑色,胞浆呈现淡粉色;髓核细胞经过甲苯胺蓝染色后,胞浆内呈现天蓝色,通过Ⅱ型胶原免疫组织化学染色后,胞浆内表现为黄褐色沉淀。到第4代细胞出现退变,Ⅱ型胶原和聚合蛋白聚糖mRNA的表达水平较前几代细胞显著下降。前3代的髓核细胞代谢旺盛,表型一致,聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原表达正常,传第4代后髓核细胞开始出现衰老、退变。     

两种方法分离子宫内膜干细胞的比较

背景：目前国内外尚无统一方法分离培养子宫内膜干细胞,实验重复性较差。 目的：寻找一种方便、高效、科学的体外分离子宫内膜干细胞的方法。 方法：采用混合法(机械和酶消化相结合)及胶原酶Ⅰ法分离子宫内膜干细胞,比较两种方法分离所得活细胞数及细胞生长周期的差异;并采用免疫细胞化学法和RT-PCR法检测CD90和CD117的表达情况。 结果与结论：经过15 d的原代培养后,子宫内膜干细胞形态呈圆梭形,细胞贴壁平铺生长,具有成纤维细胞形态,细胞排列无极性;细胞化学染色及RT-PCR法均检测到干细胞标志物CD90和CD117表达,证明培养的细胞具有干细胞特性。混合法获得的活细胞数多于胶原酶Ⅰ法,其差异有显著性意义 (P < 0.01),两种方法分离所得的细胞具有相同的生长周期。结果说明混合法是一种方便、高效、科学的体外分离子宫内膜干细胞的方法。     

骨形态发生蛋白7诱导骨膜细胞碱性磷酸酶的表达

背景：关于骨形态发生蛋白7作为刺激因子诱导细胞成骨的报道目前较少见。 目的：观察骨膜细胞经骨形态发生蛋白7诱导后碱性磷酸酶的表达。 方法：取材于成人胫骨骨膜,常规细胞培养法行骨膜细胞体外培养,分为实验组和对照组,分别加入骨形态发生蛋白7加成骨细胞培养辅助剂和单纯成骨细胞培养辅助剂,相差显微镜观察骨膜细胞形态特征及超微结构。每组分别在第7,14,21天设3个时间点,每个时间点设3个样本,采用碱性磷酸酶试剂盒法检测成骨细胞特异性标志物碱性磷酸酶表达情况。 结果与结论：骨膜细胞经分组培养后,第7天时,实验组和对照组骨膜细胞均有明显增殖,碱性磷酸酶的可被检测出,但量不多,细胞外形为梭形,实验组比对照组检测的碱性磷酸酶数量稍多;第14天时,实验组及对照组骨膜细胞均显著增殖,细胞外形由梭形变为宽梭形,实验组比对照组检测的碱性磷酸酶数量明显增多。第21天时,实验组及对照组骨膜细胞均增殖,其中实验组细胞增殖明显,细胞外形为宽梭形,实验组比对照组检测的碱性磷酸酶数量显著增多。经过统计学分析由骨形态发生蛋白7诱导的骨膜细胞的成骨标志物碱性磷酸酶阳性率明显高于对照组(P < 0.01)。提示骨膜细胞具有良好的成骨和再生能力, 骨形态发生蛋白7能诱导骨膜细胞加强碱性磷酸酶的表达,能诱导骨膜细胞向成骨细胞转化。     

人端粒酶反转录酶对人胚胎皮质神经元损伤的保护

背景：端粒酶可维持端粒长度,避免细胞复制性衰老和凋亡,其催化亚基端粒酶反转录酶还具有抗凋亡和调节细胞生存的作用。目的：观察人端粒酶反转录酶对β淀粉样蛋白1-40引起的人胚胎皮质神经元损伤的影响。方法：分离和培养12-16周龄人胚胎皮质神经元,将人端粒酶反转录酶基因重组腺病毒转染至神经元。免疫细胞化学法检测人端粒酶反转录酶基的表达,端粒重复序列扩增酶联免疫吸附法检测端粒酶活性。转染后第3天,给予10 μmol/L β淀粉样蛋白1-40作用24 h后,应用MTT检测细胞活力。荧光探针2’ 7’-二乙酰二氯荧光素标记检测细胞内活性氧水平,比色法测定细胞匀浆中谷胱甘肽含量。结果与结论：转染后第3天,人端粒酶反转录酶的表达最高,并重建了其端粒酶活性;10 μmol/L β淀粉样蛋白1-40显著降低神经元的细胞活力和谷胱甘肽的含量(P < 0.05和P < 0.01),升高活性氧水平(P < 0.05)。转染了人端粒酶反转录酶基因的神经元能显著对抗β淀粉样蛋白1-40的毒性作用,增加细胞的活力和谷胱甘肽含量(P < 0.05和P < 0.01),降低活性氧水平(P < 0.05)。结果表明,人端粒酶反转录酶对β淀粉样蛋白1-40引起的人胚胎皮质神经元的损伤有明显保护作用。     

脂肪源干细胞向血管内皮细胞的分化

背景：脂肪来源干细胞在体内储备丰富,体外增殖快速,具有多向分化潜能,是目前组织工程种子细胞的研究热点。近年来越来越多的研究表明脂肪干细胞在一定条件下可被诱导分化为内皮细胞,促进血管生成。 目的：观察兔脂肪干细胞体外分离培养及诱导分化为血管内皮细胞的生物学特性。 方法：取兔附睾处脂肪,采用胶原酶消化分离获得脂肪干细胞,体外培养至第3代后加入血管内皮细胞生长因子与碱性成纤维细胞生长因子联合诱导分化,对诱导前后细胞进行形态学观察、生长曲线测定、免疫组织化学染色及流式细胞仪表型检测。 结果与结论：兔脂肪干细胞生长旺盛,第3代兔脂肪干细胞呈成纤维细胞样,生长曲线呈“S”型,15代以内细胞形态未见明显变化。免疫荧光法检测Vimentin阳性,流式细胞仪检测CD44表达阳性,CD31表达阴性;诱导后细胞CD31表达阳性,CD44表达阴性。第3代兔脂肪干细胞向血管内皮细胞诱导分化21 d显微镜下呈铺路石样形态,血管内皮细胞第Ⅷ因子相关抗原染色细胞阳性,透射电镜下可见W-P小体。提示脂肪干细胞在体外可诱导分化为血管内皮细胞,可为组织工程血管提供理想的种子细胞。     

干燥脱水保存鸵鸟脱细胞角膜基质载体材料的细胞毒性

背景：陕西省眼科研究所通过前期研究发现鸵鸟角膜具有开发成为人角膜材料替代品的优势。 目的：判断鸵鸟角膜基质支架材料对细胞的潜在毒性作用。 方法：采用细胞培养方法,将干燥脱水法保存的鸵鸟脱细胞角膜基质载体支架制备成浸提液与L-929细胞共同培养,采用MTT比色法评价其作用1,2,3 d,对细胞生长和增殖的影响。 结果与结论：干燥脱水法保存的鸵鸟脱细胞角膜基质载体支架浸提液组培养1,3,5 d,对实验细胞毒性反应级别均为1级。参照《中华人民共和国国家标准GB/T16886.5-2003》进行细胞毒性试验,供试品组见少量细胞呈圆形,疏松贴壁,无胞浆内颗粒,偶见细胞溶解。结合MTT法分析结果表明,采用干燥脱水法保存鸵鸟脱细胞角膜基质载体材料,细胞毒性为1级,为合格材料。     

组织工程骨的体外预血管化

背景：组织工程骨的应用是一种新兴的解决骨缺损的先进手段,但是由于受到植入体无营养代谢的限制,难以大量应用于临床。组织工程骨预血管化研究就是针对这一局限性,进行人工植入体的前瞻性和程序性的血管构建,以期解决植入体的营养代谢问题,国内外学者已取得大量研究成果。 目的：对组织工程骨体外预血管化实验研究成果和发展趋势进行多层次分析探讨。 方法：检索CNKI数据库和Pubmed数据库2000至2012年文献,中文检索词：组织工程骨,血管化,植入支架,成骨细胞,血管内皮细胞,共培养,英文检索词：bone engineering, endothelial cells, osteoblast, implant, cells co-culture。按照基础骨生理研究、体外细胞实验研究和材料学研究进行分类,完成组织工程骨体外预血管化研究的综述。 结果与结论：共纳入60篇文献进行分析。此次检索的文献证明,在正常骨组织中,微血管的发生对成骨具有重要的调控作用,目前组织工程骨研究正在模拟人体内血管再生这一生理过程,设计完成了大量体外预血管化的实验,证实了血管预成型的应用有利于组织工程骨的体内存活和骨化,为组织工程骨临床应用指明了发展方向。     

小胶质细胞介导帕金森病小鼠的氧化应激损伤

背景：研究证实,小胶质细胞诱导型一氧化氮合酶可增加多巴胺能神经元对百草枯的摄取,造成百草枯对多巴胺能神经元的特异性杀伤作用。帕金森病的黑质纹状体存在小胶质细胞的激活,但其产生氧化应激作用机制尚不明确。 目的：建立帕金森病小鼠模型,观察小胶质细胞介导的氧化应激损伤在帕金森病中的作用。 方法：36只C57BL/6小鼠随机分为帕金森病模型组和对照组,每组18只。以腹腔注射百草枯10 mg/kg为模型组,等体积生理盐水为对照组,分别观察小鼠行为活动改变。采用高效液相法测定两组小鼠黑质纹状体多巴胺的含量及免疫组织化学方法检测两组小鼠黑质部位酪氨酸羟化酶、mac-1蛋白表达,同时应用化学比色法测定两组小鼠黑质部位超氧化物歧化酶、还原性谷胱甘肽、谷胱甘肽过氧化物酶活性和丙二醛水平的变化。 结果与结论：模型组小鼠自发行为活动较对照组减少(P < 0.05)。高效液相法检测模型组小鼠黑质纹状体多巴胺含量及酪氨酸羟化酶蛋白的表达均显著低于对照组(P < 0.05),mac-1蛋白表达高于对照组(P < 0.05)。模型组超氧化物歧化酶、还原性谷胱甘肽、谷胱甘肽过氧化物酶活性较对照组均显著下降(P < 0.05),丙二醛水平较对照组显著升高(P < 0.05)。提示中脑黑质部位小胶质细胞的激活致使氧化应激反应增强及抗氧化保护作用减弱可能是引起帕金森病发病的重要机制。