小鼠原核表达载体pQE30/FGFR-1的构建及表达鉴定

目的构建小鼠FGFR—1胞外段基因重组原核表达载体pQE30／FGFR—1，并在大肠杆菌JM109中表达。方法利用RT—PCR技术．从胚肝中扩增出小鼠的FGFR—1胞外段基因的cDNA，用内切酶消化后插入原核表达质粒pQE30中。经琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定后，体外转化大肠杆菌，用RT—PCR和免疫印迹方法鉴定，同时利用Ni—NTA琼脂柱层析法纯化复性重组蛋白。结果琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定证实PCR扩增的cDNA及构建的重组原核表达质粒pQE30一FGFR—1正确，并在大肠杆菌中正确表达。经纯化后，进行SDS—PAGE电泳显示得到1条分子量约40kDa的蛋白质条带。结论成功构建小鼠原核表达载体pQE30／FGFR—1并在大肠杆菌中有效表达，纯化后获得具有活性的重组蛋白质。     

小鼠IDO基因重组腺病毒载体的构建表达和鉴定

目的 构建携带小鼠IDO基因的重组腺病毒载体,以期进一步进行研究其免疫学效应.方法 酶切含有小鼠全长IDOcDNA的PCOUS-2质粒,亚克隆至穿梭质粒pAdtrack-CMV上,在BJ5183细菌中和AdEasy-1进行同源重组,筛选阳性克隆,酶切、测序鉴定正确后,脂质体法转染AD-293细胞进行包装,扩增,氯化铯密度梯度离心纯化病毒并检测其滴度.RT-PCR和荧光显微镜鉴定和检测重组腺病毒转染AD-293细胞后IDO的表达,同时进行野生型腺病毒的检测.结果 经酶切及测序证实IDO基因重组腺病毒载体构建成功,RT-PCR检测到转染后AD-293细胞内IDO的表达,且无野生型腺病毒的产生.结论 成功构建了含小鼠IDO基因的重组腺病毒载体,为探讨IDO的生物学功能奠定了基础.     

重组原核表达载体pQE30-hALRIP的构建及鉴定

目的:构建人肝再生增强因子相互作用肽(hALR interacting protein,hALRIP)重组原核表达载体并进行鉴定.方法:用聚合酶链反应(PCR)扩增hALRIP编码区基因,将PCR扩增产物克隆至pMD18-T载体中并测序.利用pQE30质粒载体构建重组原核表达载体pQE30-hALRIP,并通过酶切电泳鉴定重组质粒.结果:构建了重组克隆载体pMD18-hALRIP和重组表达载体pQE30-hALRIP,测序及酶切鉴定与预计相同.结论:成功构建了重组原核表达载体pQE30-hALRIP,为进一步研究该多肽奠定基础.     

小鼠降钙素基因相关肽基因重组腺病毒载体的构建及其在心肌细胞的表达

目的:利用AdEasy腺病毒载体系统,构建小鼠降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)基因重组腺病毒载体,并验证其在心肌细胞中的表达.方法:采用RT-PCR方法扩增出含有小鼠CGRP全长cDNA的基因片段,并将其插入PUC57载体,经EcoRⅤ和SalⅠ双酶切,将小鼠CGRP基因亚克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV,形成重组质粒pShuttle-CMV-CGRP.经PmeⅠ酶切线性化后,在大肠杆菌BJ5183中与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组产生重组腺病毒质粒AdEasy-pShuttle-CGRP.重组腺病毒质粒在XL-Gold 细胞中扩增,经PacⅠ酶切线性化后,转染人胚肾293细胞进行重组腺病毒的包装,并经氯化铯纯化得到重组腺病毒AdEasy-pShuttle-CGRP.用纯化后的重组腺病毒转染原代培养的乳鼠心肌细胞,荧光显微镜下观察转染效果.通过尾静脉导入重组腺病毒7 d后,放免法测定心肌中CGRP的表达量.结果:测序证实PUC57 -CGRP重组质粒中含有小鼠CGRP基因的cDNA;重组穿梭质粒pShuttle-CMV-CGRP经双酶切鉴定后可见约7.5 kb和423 bp片段;重组腺病毒质粒AdEasy-pShuttle-CGRP经Pac Ⅰ酶切可见长约3 kb与30 kb DNA片断.转染293细胞进行包装,7 d后细胞出现病变效应,回收病毒重复感染293细胞,在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达.提取病变293细胞中重组腺病毒进行目的基因的PCR鉴定为阳性.构建好的重组腺病毒经纯化后具有很高的滴度,并且成功转染了原代培养的乳鼠心肌细胞.通过放免法证实,该载体可以显著增加小鼠心脏中CGRP的表达.结论:成功构建携带CGRP基因的重组腺病毒载体,该重组腺病毒载体AV-CGRP可以显著增加心脏中CGRP的表达量,为进一步研究CGRP基因治疗奠定了基础.     

小鼠窖蛋白-1 基因重组腺病毒载体的构建

目的应用AdEasy重组腺病毒载体系统,构建携带小鼠窖蛋白-1(caveolin-1)编码区基因的复制缺陷型重组腺病毒载体Ad-caveolin-1。方法将质粒pTRE2-caveolin-1中的小鼠caveolin-1编码序列亚克隆到穿梭质粒pAdtrack-CMV中构建重组穿梭质粒pAdtrack-CMV-caveolin-1,酶切线性化后转入已含有病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌中进行同源重组。筛得的病毒质粒pAd-caveolin-1经酶切鉴定后,在293细胞中包装成重组腺病毒。荧光显微镜观察绿色荧光表达。扩增并纯化病毒,测定病毒滴度和重组病毒插入片段的序列。结果重组腺病毒质粒经酶切鉴定证实成功构建了携带caveolin-1基因的重组腺病毒载体,转染293细胞后可出现明显的细胞病变效应,并观察到绿色荧光的表达,caveolin-1基因测序鉴定与GenBank中公布序列一致。重组腺病毒的滴度为:2×109pfu/mL。结论应用AdEasy系统成功地构建了重组腺病毒载体Ad-caveolin-1,通过该系统携带的绿色荧光蛋白(GFP)标记基因可直观检测靶细胞转染和外源基因表达的情况,为进一步研究caveolin-1在牙齿发育中的作用奠定了基础。     

小鼠 T-bet基因重组腺病毒载体的构建

[目的] 构建小鼠 T-bet基因重组腺病毒载体,为 T-bet基因在支气管哮喘治疗中的作用研究提供有效的 T-bet生物表达系统.[方法] 采用内切酶从质粒 T-bet/GFP-RV中切获约 1.7 kb的小鼠 T-betcDNA片段,与穿梭质粒 pShuttle连接,再通过稀有酶切位点将含 T-betcDNA的表达盒与 Adeno-X腺病毒载体骨架连接,构建重组载体 pAdeno-T-bet,测序鉴定无错配及插入移位等 DNA顺序改变,并转染 HEK293细胞,出现 CPE后取含病毒上清的细胞培养液抽提病毒 DNA行 PCR鉴定.[结果] PCR及酶切证实: T-betcDNA正确克隆到穿梭质粒 pShuttle中,带 T-betcDNA的表达盒成功重组到腺病毒载体基因组 E1A缺失区,并在 HEK293细胞中成功包装出具有感染活性的重组腺病毒 pAdeno-T-bet.[结论]本实验成功构建了小鼠 T-bet基因重组腺病毒载体,并在 HEK293细胞中成功包装出重组腺病毒.     

小鼠T-bet基因重组腺病毒载体的构建

【目的】构建小鼠T-bet基因重组腺病毒载体，为T-bet基因在支气管哮喘治疗中的作用研究提供有效的T-bet生物表达系统。【方法】采用内切酶从质粒T-bet／GFP-RV中切获约1．7kb的小鼠T-betcDNA片段，与穿梭质粒pShuttle连接，再通过稀有酶切位点将含T-betcDNA的表达盒与Adeno-X腺病毒载体骨架连接，构建重组载体pAdeno-T-bet，测序鉴定无错配及插入移位等DNA顺序改变，并转染HEK293细胞，出现CPE后取含病毒上清的细胞培养液抽提病毒DNA行PCR鉴定。【结果】PCR及酶切证实：T-betcDNA正确克隆到穿梭质粒pShuttle中，带T-betcDNA的表达盒成功重组到腺病毒载体基因组E1A缺失区，并在HEK293细胞中成功包装出具有感染活性的重组腺病毒pAdeno-T-bet。【结论】本实验成功构建了小鼠T-bet基因重组腺病毒载体，并在HEK293细胞中成功包装出重组腺病毒。     

小鼠3D3/LYRIC基因重组质粒构建及蛋白表达和定位

 目的构建小鼠3D3/LYRIC真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位。方法提取小鼠乳腺上皮细胞系
C127 的mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增3D3/LYRIC全长编码基因,亚克隆至pEGFP-C1表达载体中。将构建的重组质粒测
序并转染到腺样囊性癌细胞系ACC-2 中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。利用免疫荧光显微镜观察pEGFP-m3D3/LYRIC
在腺样囊性癌ACC-2 细胞内的定位。结果3D3/LYRIC全长基因序列克隆到真核表达载体pEGFP-C1 中,酶切鉴定片段大小
为1 740 bp。Western blot 检测到融合蛋白GFP-m3D3/LYRIC 表达,分子量约为91 kDa。pEGFP-C1-m3D3/LYRIC主要在细胞质
内定位,在细胞核内未见表达。结论成功构建了3D3/LYRIC全长基因真核表达载体,pEGFP-m3D3/LYRIC 蛋白主要定位于
细胞质内。     

pQE31-HPV16 L1重组质粒的构建及鉴定

目的 构建重组原核表达质粒以获得ＨＰＶ１６ Ｌ１活性蛋白。为进一步研制ＨＰＶ１６基因工程疫苗打下基础。方法 以克隆质粒pQE３１－ＨＰＶ１６Ｌ１重组质粒,用酶切电泳验证重组结果的正确性,测序检查质闰重组后序列情况。结果 ＰＣＲ结果显示扩增片断大小为１.5Kb,与预期相同。重组质粒酶切后显示其大小约５.0Kb。大小及酶切图谱与预期相同。经测序发现插入片段两端序列无改变。结论 pQE３１－ＨＰＶ１６Ｌ１质粒构建成功。     

重组质粒pcDNA4-FLAG-GLUT1构建及蛋白表达

目的:为探究葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）磷酸化水平对红细胞期疟原虫生长发育的影响,构建必要的分子工具。方法:以pcDNATM4/TO/myc-His B为载体,构建在GLUT1第一个胞外区插入2×FLAG标签的重组质粒pcDNA4-2×FLAG-GLUT1。将重组质粒转染到NIH/3T3细胞中,利用Western印迹和流式细胞术分别检测细胞FLAG-GLUT1蛋白总量和细胞表面FLAG-GLUT1的表达水平。结果:酶切鉴定及DNA测序表明正确构建重组质粒pcDNA4-2×FLAG-GLUT1。通过识别FLAG标签,利用Western印迹能够检测到FLAG-GLUT1在NIH/3T3细胞中的表达,流式细胞术结果显示,转染重组质粒的细胞表面可检测到FLAG-GLUT1的表达,阳性群比例为（21.46 ± 2.375）%,明显高于对照组（0.01±0.00）%,差异有统计学意义（t=9.035,P<0.01）。结论:成功构建重组质粒pcDNA4-2×FLAG-GLUT1,为研究GLUT1蛋白磷酸化在疟原虫感染红细胞中的作用提供了必要的工具。     

Smad2/3/4真核表达质粒的构建及重组蛋白表达

目的:构建pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4真核表达质粒,证实融合蛋白在细胞内表达。方法:以pcDNA3.1-Smad2/3和pGEX2T-Smad4质粒为模板,设计特异性引物,PCR扩增Smad2/3/4全长编码基因,亚克隆至含有pcDNA3.1myc-HisA 标签的真核表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到人胚胎肾细胞HEK293 中,提取细胞蛋白进行 Western blotting 检测。结果：Smad2/3/4 全长基因序列克隆到真核表达载体pcDNA3.1myc-HisA中,酶切鉴定片段为1 401、1 275和1 656 bp。Western blotting检测到融合蛋白pcDNA3.1myc-HisA- Smad2/3/4的表达。结论:成功构建pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4真核表达质粒,同时鉴定其融合蛋白的表达。     

PIAS3的Myc融合蛋白真核表达重组质粒的构建

目的：构建PIAS3 （活化型STAT3抑制蛋白）的Myc融合蛋白真核表达重组质粒，并表达融合蛋白Myc-PIAS3。方法： 采用PCR方法，扩增鼠PIAS3基因全长cDNA编码区序列。将该1 851 bp的特异性片段连接到T载体上，将其亚克隆至pCMV-Myc真核表达载体的SalⅠ和NotⅠ位点之间。将pCMV-Myc-PIAS3重组质粒转染前列腺癌PC3细胞，利用Myc抗体通过Western blotting法检测融合蛋白Myc-PIAS3的表达。结果：重组pCMV-Myc-PIAS3质粒通过酶切和测序鉴定了其正确性。EcoRⅠ酶切鉴定时有4 357和1 318 bp 2条带，XbaⅠ酶切鉴定时有3 291 bp和2 384 bp 2条带，与预期结果一致。测序结果显示，13个氨基酸Myc在N端，然后是阅读框架正确的PIAS3的基因序列。pCMV-Myc-PIAS3重组质粒转染PC3细胞，利用Myc抗体通过Western blotting法检测融合蛋白Myc-PIAS3的表达，在相对分子质量68 000处检测到特异的蛋白表达条带。结论：成功构建pCMV-Myc-PIAS3重组质粒，并表达融合蛋白Myc-PIAS3。     

HtsA表达质粒克隆和蛋白质的纯化

目的克隆HtsA重组表达质粒以获得HtsA表达蛋白。方法通过PCR方法扩增获得A组链球菌HtsA基因完整的序列,将此片段定向克隆到表达载体pET21d质粒中,在E.coli BL21(DE3)中表达融合蛋白,并运用离子交换层析和疏水层析分离纯化HtsA蛋白。结果经琼脂糖电泳证实成功克隆了重组表达质粒pET21d-HtsA,pET21d-HtsA融合蛋白在E.coli BL21(DE3)中得到表达,SDS-PAGE分析表明纯化的HtsA纯度较高。结论成功构建了A族链球菌HtsA基因重组表达质粒,并纯化获得了目的蛋白HtsA。     

结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT-6基因测序质粒及真核表达重组质粒的构建

目的 构建结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT—6基因测序质粒及真核表达重组质粒，为结核病的诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测打下基础。方法 以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板，用PCR法对基因ESAT—6进行扩增，将扩增的产物连接于测序载体pUCm—T上，经测序反应确定无误，再将PCR反应产物经酶切后，克隆于真核表达载体pcDNA3．1( )上。结果 构建了结核杆菌基因ESAT—6的重组测序质粒，并对其进行了测序。真核表达重组质粒pcDNA3．1( )—ESAT—6亦构建成功。结论 结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT—6真核表达重组质粒的成功构建为结核病的诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测以及相应抗原、抗体的制备打下基础。     

分枝杆菌热休克蛋白65重组质粒的构建与原核表达

目的研究分枝杆菌热休克蛋白65(HSP65)重组质粒的构建与原核表达。方法 HSP65的开放阅读框经聚合酶链反应(PCR)扩增后,经NcoⅠ与NotⅠ内切酶依次酶切,连接至酶切后的原核表达载体PET-28a中,然后将重组质粒转入大肠杆菌BL-21中,PCR筛选阳性克隆,并经DNA测序进一步验证。阳性克隆进一步扩大培养,并进行乳糖诱导,十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳对菌体蛋白进行检测。结果成功扩增出1 623 bp的目的片段HSP65;测序结果显示,该片段与目的序列完全相符,重组子PET-28a/HSP65构建成功;乳糖诱导后的HSP65在大肠杆菌中实现高表达。结论分枝杆菌HSP65蛋白的成功表达,为研究其在抗肿瘤疫苗中的应用奠定了基础。     

Construction and Expression of Recombinant Plasmid pCD-rbFGF in Osteoblasts

Basicfibroblastgrowth factor(b FGF) exertsbi-ological effects on a wide range of mesoderm- andneuroectoderm- derived cells,acting as morphogensand mitogens.In addition,b FGF plays a crucial rolein wound- healing process.It stimulatesthe prolifera-tion ofalltypes ofcellsinvolved in the wound- healingprocess both in vitro and in vivo.In tissues such ascartilage and bone,b FGF has been reported to pro-mote chondrossification and play a role in the growthof osseous tissue[1] .To explore the po…     

Construction and expression of human alpha-fetoprotein recombinant plasmid]

OBJECTIVE: To construct AFP-expressing plasmid and study the expression in eukaryotic cells. METHODS: Total RNA was isolated from fetal liver tissue. Full-length human AFP cDNA was obtained by RT-PCR amplification and then recombined into eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1. The AFP sequence of the recombinant plasmid phAFP was determined. The AFP expressions in CHO transfected with phAFP and in muscle after injection phAFP were investigated by immunohistological methods. RESULTS: The restriction endonuclease mapping of recombinant plasmid showed 1.8 kb fragment as well as full-length human AFP cDNA, and the sequence is consistent with that from GenBank. The phAFP was successfully expressed in CHO and in muscle tissues. CONCLUSION: These results suggested that AFP can be used as a target gene of DNA vaccine in heptocellular carcinoma therapy.