体外诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化：两种方法的比较

背景：目前骨髓间充质干细胞诱导分化为神经细胞的方法较多,而采用不同诱导方法时间充质干细胞在体外分化成神经细胞的比例是不一样的。适宜的诱导条件是实现间充质干细胞定向诱导分化的必要条件。 目的：比较两种常见的化学诱导法与共培养法诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的差异,以寻找一种诱导效果高、实用的骨髓间充质干细胞体外诱导方法。 方法：采用密度梯度法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,分别用化学诱导法和共培养法诱导分化比较两种方法所获得的神经细胞数目、细胞形态和特异性抗体阳性率。 结果与结论：培养7 d后两组均可见大量贴壁细胞形成突起,呈放射状生长,神经元特异性烯醇化酶染色均为阳性。共培养法第5天可见典型神经细胞结构,突起数量较多,神经元特异性烯醇化酶染色阳性率(50.82±2.46)%,化学诱导法培养第7天可见神经样细胞形成,并有突起,神经元特异性烯醇化酶染色阳性率(43.56±1.74)%。说明骨髓间充质干细胞经共培养法诱导分化后的神经样突起数量多并较早互相形成连接,且共培养法神经元特异性烯醇化酶染色阳性率高于化学诱导法。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化中黄芪多糖的诱导作用

背景：黄芪有效组分的抗氧化作用被认为是诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的原因。 目的：观察黄芪多糖联合碱性成纤维生长因子诱导骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化的效果。 方法：取第3代人骨髓间充质干细胞用碱性成纤维生长因子进行神经前体细胞诱导分化24 h,随后加入黄芪多糖继续培养1-3 d,同时设空白对照组和单纯碱性成纤维生长因子诱导组。免疫细胞化学及蛋白印迹法检测巢蛋白和神经元特异性烯醇化酶的表达。 结果与结论：与单纯碱性成纤维生长因子诱导组相比,碱性成纤维生长因子+黄芪多糖诱导组的神经元特异性烯醇化酶阳性细胞比例较高(P < 0.05);单纯系统碱性成纤维生长因子诱导组和碱性成纤维生长因子+黄芪多糖诱导组皆有巢蛋白条带表达,利用凝胶成像系统分析,碱性成纤维生长因子+黄芪多糖诱导组的灰度值大于单纯碱性成纤维生长因子诱导组(P < 0.05)。结果可见黄芪多糖联合碱性成纤维生长因子诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化具有更高的诱导分化效率。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

丹参诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化

目的:探讨骨髓间充质干细胞(marrow stromal stem cells,MSCs)向神经细胞分化中神经蛋白分子及相关基因的表达情况。方法:分离提取大鼠的MSCs,体外培养扩增。用含丹参的无血清的L-DMEM培养基进行诱导,并以不含丹参的无血清L-DMEM培养基作为对照。提取两组的MSCs总RNA,RT-PCR检测ngn-1、mash-1的表达。结果:丹参诱导90 min后,细胞发生了明显的形态学变化,大多数细胞转变为类似双极或多极神经元样形态,伸出轴突或树突样突起。免疫细胞化学显示诱导后的MSCs表现为nestin、NSE、GFAP染色阳性,对照组为阴性。未经诱导的MSCs ngn-1,mash-1 mRNA为阴性,诱导后有表达。结论:丹参可诱导大鼠MSCs向神经前体细胞和神经细胞分化。MSCs向神经元样的分化可能与ngn-1,mash-1有关。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化

背景：研究表明,移植后的骨髓间充质干细胞在新的环境中能够被诱导分化为神经元样细胞,从而替代损伤细胞重建神经环路。 目的：建立大鼠骨髓间充质干细胞和神经细胞的体外共培养系统,观察共培养条件下神经细胞对骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的影响。 方法：体外培养Wistar大鼠脑组织神经细胞和股骨骨髓间充质干细胞,采用Transwell小室共培养分化诱导,观察骨髓间充质干细胞的组织形态变化,在共培养第5天免疫荧光染色检测骨髓间充质干细胞中神经细胞的特异标志物;与对照组单纯骨髓间充质干细胞培养结果相比较。 结果与结论：神经细胞共培养系统中的骨髓间充质干细胞生长伸展,呈放射状,互相形成连接,特异性烯醇化酶显示阳性结果,具有神经元样细胞的特性,表达特异性烯醇化酶阳性的神经元比例可达(33.0±10.5)%。而对照组骨髓间充质干细胞未形成神经元样细胞的形态结构,免疫荧光显示特异性烯醇化酶阴性。提示神经细胞提供的微环境对骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞具有诱导分化作用。      

诱导脐血间充质干细胞向神经元样细胞分化

背景：脐血来源的间充质干细胞具有与造血干细胞和骨髓间充质干细胞相似的多向分化潜能,并且可以诱导分化为神经元样细胞,但分离培养后的成功率比较低,需要寻求一种成功率较高的培养方法。 目的：探讨脐血间充质干细胞的生物学特性及向神经元样细胞诱导分化的方法。 方法：由作者检索CNKI数据库2002/2011收录的有关脐血间充质干细胞诱导分化为神经元样细胞的相关研究文献,中文检索词为“脐血间充质干细胞,神经细胞,诱导分化,细胞因子”。 结果与结论：脐血间充质干细胞具有与造血干细胞和骨髓间充质干细胞相似的多向分化潜能,可以在体外诱导分化为神经样细胞,对CD34表达阴性,是区别于脐血造血干细胞的主要标志物。脐血间充质干细胞在体外诱导分化的方法主要有细胞生长因子法、化学诱导剂法、生长因子与诱导剂联合法,通过各种神经诱导剂的作用,使培养出的神经元样细胞数量有所增加,国内外基础研究结果显示移植脐血间充质干细胞诱导分化的神经元样细胞可以修复中枢神经系统损伤性疾病,脐血间充质干细胞是神经损伤修复的一种理想种子细胞。     

骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化前后基因及Ca2+浓度的变化

背景：单唾液酸四己糖神经节苷脂(Monosialotetrahexosylganglioside,GM1)在神经细胞的生长发育、分化、再生和细胞内外信息传递等多种生理过程中发挥重要作用。 目的：探讨GM1对骨髓间充质干细胞按照Woodbury经典诱导方案将其诱导分化为神经元样细胞前后基因方面和细胞内游离Ca2+浓度的变化。 方法：分离纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞进行传代培养,传至第5代时,待细胞融汇成致密单层后,加入50 mmol/L神经节苷脂设为GM1组,预培养24 h后按照Woodbury经典诱导方案进行诱导,设置对照组,采用免疫组化和Realtime PCR技术分别检测诱导前后生长相关蛋白43、神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白和神经巢蛋白的蛋白和mRNA表达的变化,采用激光扫描共聚焦显微镜检测诱导前后细胞内游离钙离子浓度的变化。 结果与结论：①加入GM1组诱导分化后较对照组生长相关蛋白43、神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白和神经巢蛋白表达水平增高(P < 0.05),GM1能够促骨髓间充质干细胞诱导分化为神经元样细胞。②更换诱导液后,两组细胞内荧光强度逐渐增加,到100 s 达高峰值,其后逐渐减弱,但20 min 时细胞荧光强度仍高于诱导前,加入GM1组,细胞内游离Ca2+浓度较对照组有所增加(P < 0.05)。说明GM1能够促进细胞内Ca2+浓度增加,游离Ca2+在诱导过程中可能有促进作用。③诱导后生长相关蛋白43、神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白和神经巢蛋白基因表达改变不显著,说明Woodbury经典诱导方案可能为转录后水平即蛋白水平的调控。     

骨髓间充质干细胞向血管内皮样细胞分化的研究进展

骨髓间充质干细胞是一类多潜能干细胞，具有自我增殖、多向分化潜能，可向中、外胚层细胞转化。作为组织工程种子细胞的新来源，具有广阔的应用前景。就骨髓间充质干细胞表型特征、分离鉴定和定向分化为内皮样细胞的理论基础及分化机制的研究进展作一综述。     

丁酸钠诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

背景：组蛋白乙酰化是诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的机制之一。 目的：观察组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠对体外培养的骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响,并分析其诱导分化的机制。 方法：分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞,并进行鉴定。取第2代骨髓间充质干细胞,应用1 mmol/L丁酸钠诱导其向心肌样细胞分化。 结果与结论：实验分离培养的骨髓间充质干细胞高表达CD90,CD29;低表达CD45,CD31。加入丁酸钠后细胞增殖能力及组蛋白去乙酰化酶活性明显降低,但未发生明显凋亡现象,表明丁酸钠具有低毒性的特征。real-time PCR检测显示,经丁酸钠诱导后细胞GATA-4,MEF-2c,β-MHC等心肌细胞早期标志基因表达率明显增高(P < 0.05)。Western blot检测发现,经丁酸钠诱导后细胞心肌细胞特异性蛋白连接蛋白43和肌钙蛋白T的表达明显增高。免疫荧光测得的肌钙蛋白T表达结果与Western blot一致。说明丁酸钠能够有效诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化,其机制可能与抑制组蛋白去乙酰化酶活性,增强组蛋白的乙酰化有关。     

人脐血间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞

目的从人脐血中分离单个核细胞(MNCs)、体外培养扩增间充质干细胞(MSCs)并研究其生物学特性和定向诱导能力。方法无菌条件下采集脐血,肝素抗凝,分离单个核细胞。用DMEM/F12培养基进行纯化和扩增培养,分别向神经元样细胞诱导,获取MSCs,显微镜下观察它的形态、尼氏体染色;取扩增2、5、7代的MSCs,免疫细胞化学法检测nestin表达和神经元样细胞特异性标记。结果诱导扩增后的MSCs尼氏体染色阳性,第2、5、7代MSCs的nestin的阳性表达率分别为(51.2±3.2)%、(34.6±2.7)%、(11.3±3.3)%;神经元特异性烯醇化酶(NSE)在原代细胞无表达,而在2、5、7代MSC的阳性表达率分别为(11.4±2.3)%、(21.78±3.1)%、(40.7±3.4)%。结论人脐血MSCs具有神经干/祖细胞的特性,在一定条件下能向神经元样细胞分化。     

红景天苷体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞*◇

背景：前期实验证明红景天苷能诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞定向分化,但是具体的影响方式尚不清楚。 目的：以骨髓间充质干细胞为研究对象,进一步探讨红景天苷诱导其向神经元样细胞定向分化的作用方式和分子机制。 方法：选取第2代Wistar大鼠骨髓间充质干细胞,按照不同的诱导剂分为维甲酸诱导组、红景天苷诱导组和对照组,通过不同的时间点对细胞进行观察。 结果与结论：两诱导组细胞不同时间点神经干细胞标志物巢蛋白、神经细胞分化相关的兔抗微管蛋白和神经微管相关蛋白2表达阳性率均高于对照组(P < 0.01);神经胶质纤维酸性蛋白阳性率维甲酸组显著高于红景天苷组(P < 0.01)。Real Time-PCR结果显示,维甲酸和红景天苷诱导不同时间,两组细胞均有神经细胞相关基因神经元特异性烯醇化酶、神经微管相关蛋白2 mRNA表达,与诱导时间有关且不完全相同,两组间神经胶质纤维酸性蛋白mRNA的高丰度出现于诱导早期;诱导后两组神经元特异性烯醇化酶蛋白的表达随时间延长显著增加,兔抗微管蛋白表达出现于诱导早期。说明红景天苷能促进骨髓间充质干细胞向神经细胞分化,其诱导效应与维甲酸相似,且向神经元样细胞定向分化方面优于维甲酸。      

诱导剂共培养：谁更适宜骨髓间充质干细胞向神经细胞的分化？

背景：目前骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的方法较多,采用不同诱导方法对骨髓充质干细胞分化成神经细胞的比例是不同的。 目的：比较化学诱导法和共培养法诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经细胞的差异。 方法：大鼠全骨髓血细胞分离纯化法培养骨髓间充质干细胞,分为化学诱导组和共培养组,分别采用加入化学诱导剂β-巯基乙醇和Transwell小室共培养方法诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化。 结果与结论：诱导培养1周后从化学诱导和共培养组的骨髓间充质干细胞出现突起,且呈辐射生长,2周后均可见神经元特异性烯醇化酶阳性细胞。共培养组中第四五天可见星级神经细胞状结构,并形成更多的突起,神经元特异性烯醇化酶染色阳性率为(70.82±2.46)%。而在第六七天化学诱导组中神经细胞形态样细胞形成,并有连接,神经元特异性烯醇化酶染色阳性率为(52.37±1.83)%。提示细胞微环境在骨髓间充质干细胞分化成神经细胞发挥主导作用,且化学诱导法诱导效率低于共培养法。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外向血管平滑肌样细胞的诱导分化

背景：有研究表明,血管外膜成纤维细胞被激活早期参与动脉粥样硬化及血管再狭窄的形成,另有研究表明,骨髓间充质干细胞有部分黏附分化参与血管重塑,实验拟从血管外膜成纤维细胞与骨髓间充质干细胞之间相互作用的角度,来探讨动脉硬化及血管损伤后再狭窄过程中的可能机制。 目的：观察骨髓间充质干细胞与血管外膜成纤维细胞直接接触培养后,骨髓间充质干细胞形态改变及表达血管平滑肌肌动蛋白的情况。 方法：将骨髓间充质干细胞(DAPI标记细胞核)与外膜成纤维细胞按一定的比例混合培养7 d,细胞单独培养作对照,显微镜下观察细胞形态变化,免疫荧光检测骨髓间充质干细胞平滑肌肌动蛋白表达的情况。 结果与结论：骨髓间充质干细胞与血管外膜成纤维细胞共培养后,可见骨髓间充质干细胞的细胞核蓝染(DAPI标记细胞核)、胞浆红染(平滑肌肌动蛋白阳性)的双标细胞出现,且随培养时间的延长,骨髓间充质干细胞的平滑肌肌动蛋白表达阳性率明显增高。结果可见与血管外膜成纤维细胞直接接触有诱导骨髓间充质干细胞向血管平滑肌样细胞分化的趋势。     

体外诱导骨髓间充质干细胞向胆管上皮样细胞分化

背景：肝外胆管和胆囊上皮细胞的分离、纯化相对比较容易,但是胆管上皮细胞在体外易失去增殖能力,难以提供基础研究所需的细胞量,限制了胆管修复等基础研究的进程。虽然骨髓间充质干细胞可以转化为肝细胞,但是尚无体外培养骨髓间充质干细胞分化为胆管上皮细胞的报道。 目的：探讨体外诱导骨髓间充质干细胞分化为胆管上皮细胞的可行性。 方法：采取全骨髓贴壁筛选法体外分离并纯化大鼠骨髓间充质干细胞后,在第3代骨髓间充质干细胞培养基中加入肝细胞生长因子和表皮生长因子,倒置显微镜下观察骨髓间充质干细胞的形态学变化,免疫荧光检测不同时间CK19的表达情况。 结果与结论：在肝细胞生长因子和表皮生长因子的诱导下,骨髓间充质干细胞由梭形逐渐变为多边形、三角形;免疫荧光检查显示诱导第4周细胞膜开始表达CK19,诱导第6周CK19表达率明显提高。结果表明在两种细胞因子联合诱导下骨髓间充质干细胞能够转化为胆管上皮样细胞,从而为骨髓间充质干细胞修复损伤胆管提供了一个新思路。     

钠离子通道阻断剂抑制骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景：研究发现人和动物的多种间充质干细胞均存在河豚毒素敏感性钠离子通道,但钠离子通道是否会影响间充质干细胞向心肌细胞分化尚无共识。 目的：观察钠离子通道特异性阻断剂河豚毒素对骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响。 方法：利用Percoll’s密度梯度离心法结合差速贴壁法分离大鼠骨髓间充质干细胞,用主动脉逆行生物酶灌流法分离大鼠成体心肌细胞。将DAPI标记的大鼠骨髓间充质干细胞与成体心肌细胞混合培养,应用0,10,100 μmol/L的河豚毒素进行干预,1周后观察骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化情况。 结果与结论：免疫荧光细胞化学染色显示,大鼠骨髓间充质干细胞和成体心肌细胞混合培养1周后,骨髓间充质干细胞显著表达心肌特异性蛋白结蛋白和肌球蛋白,而10,100 μmol/L的河豚毒素均可完全抑制结蛋白和肌球蛋白在骨髓间充质干细胞中的表达。提示钠离子通道是骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的必要条件。     

骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化

背景：以骨髓间充质干细胞构建组织工程气管尚缺乏理想的特异性表面标志物,对其鉴定主要依赖细胞形态学、细胞表型及诱导分化的功能进行分析。 目的：体外分离培养、鉴定兔骨髓间充质干细胞,观察在特定条件下向气管软骨细胞分化的潜能。 方法：无菌环境取兔骨髓,经全骨髓贴壁筛选法分离培养细胞至第2代,流式细胞术鉴定第1、第2代细胞表面抗原CD44、CD45的表达。无菌环境取气管,经酶消化法分离培养气管软骨细胞,甲苯胺蓝染色鉴定软骨细胞蛋白聚糖的合成。在使用转化生长因子β1的基础上,将骨髓间充质干细胞与气管软骨细胞通过Transwell小室非接触式共培养,倒置显微镜观察细胞形态,甲苯胺蓝染色鉴定蛋白聚糖的合成,荧光实时定量PCR鉴定Ⅱ型胶原和蛋白聚糖 mRNA的表达。 结果与结论：分离、培养的细胞呈长梭形、不规则形聚集生长,传代后细胞生长速度明显增快,呈鱼群状聚集生长。第1代有96.97%的细胞表达CD44、13.72%的细胞表达CD45,第2代有99.11%的细胞表达CD44、8.54%的细胞表达CD45。气管软骨细胞甲苯胺蓝染色阳性。在诱导后,骨髓间充质干细胞形态逐渐由长梭形变为三角形或不规则形,表达软骨细胞特异性Ⅱ型胶原和蛋白聚糖 mRNA基因,甲苯胺蓝染色示阳性。结果表明全骨髓贴壁筛选法可成功分离培养骨髓间充质干细胞,第2代纯度较高,且在特定诱导条件下具有分化为气管软骨细胞的潜能。     

卵泡抑素诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

本实验观察了卵泡抑素(follistatin)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经细胞分化的影响。利用Percoll密度梯度离心法及贴壁筛选法分离培养和扩增成人的BMSCs,通过流式细胞术分析鉴定BMSCs的纯度,用follistatin诱导第三代生长良好的MSCs向神经元转化,观察分化过程中细胞形态的变化,利用RT-PCR方法检测诱导前后BMSCs的神经元特异性烯醇化酶(NSE)和神经干细胞标记物巢蛋白(Nestin)的表达情况。结果显示:流式分析获得了纯度较高的BMSCs,细胞表达CD29、CD44、CD106和CD166,不表达CD34和CD45。诱导10d后,细胞呈现双极、多极和锥体形的典型神经元细胞形态,并且在mRNA水平证明诱导分化后的细胞与对照组比较NSE和Nestin的表达增加(P<0.05)。上述结果表明follistatin可以在体外诱导人的BMSCs分化为神经样细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞向多巴胺样神经细胞分化

目的探索大鼠骨髓间充质干细胞向多巴胺能样细胞分化。方法全骨髓培养法分离大鼠骨髓间充质干细胞;体外培养至第3代,用碱性成纤维细胞生长因子,抗坏血酸和表皮生长因子诱导分化;免疫荧光法鉴定胞质中的多巴胺神经元相关蛋白的表达;RT-PCR鉴定多巴胺神经元相关基因的表达;ELISA法检测上清及胞质中的多巴胺。结果诱导后,免疫荧光法检测到诱导后的细胞表达多巴胺神经元相关蛋白:酪氨酸羟化酶、多巴胺转运蛋白和神经核蛋白;RT-PCR检测到诱导后的细胞表达多巴胺神经细胞相关基因TH、AADC;ELISA法检测到诱导后的上清及胞质中有多巴胺分泌。结论间充质干细胞具有向多巴胺能样细胞分化的能力。     

快速诱导大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化的培养体系

背景：目前常用的成脂刺激剂主要由胰岛素、地塞米松、IBMX和吲哚美辛组成,该体系涉及处理因素多、诱导周期长且对细胞毒性大,不利于脂肪形成抑制效应的研究。 目的：建立快速诱导大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化的培养体系。 方法：大鼠全骨髓细胞原代培养,胰酶消化传代,富集形态均质的间充质干细胞,利用过氧化物酶体增殖物活化受体γ激动剂噻唑烷二酮类药物罗格列酮和吡咯列酮体外单独诱导大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化,设立无糖、低糖和高糖DMEM三种基础培养体系,以经典的成脂刺激剂作为阳性对照,在诱导的不同时间点对分化细胞进行形态学观察和油红O染色。 结果与结论：与经典成脂刺激剂相比,罗格列酮或吡咯列酮单独均能诱导大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化,吡咯列酮诱导48 h和罗格列酮诱导72 h均可观察到富含脂滴或脂泡以及油红O染色的阳性细胞,吡咯列酮与罗格列酮的最佳诱导浓度分别为0.125 mmol/L和10 μmol/L,而高糖环境利于大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化。说明基于高糖培养环境的以吡咯列酮或罗格列酮做为成脂刺激剂的培养体系可快速诱导大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化。