谷胱甘肽过氧化物酶2干涉慢病毒系统构建及对人肝癌细胞凋亡的影响

目的构建人谷胱甘肽过氧化物酶2（Glutathione peroxidase 2, GPX2）慢病毒干涉载体,获得稳定下调GPX2的高滴度慢
病毒,检测敲低GPX2对细胞凋亡的影响。方法通过筛选具有显著干涉效果的siRNA序列,构建pSicoR-GPX2慢病毒干涉载
体,包装病毒并感染人肝癌HepG2 细胞,分别用Western-blot 和RT-PCR方法检测GPX2 表达情况,应用流式细胞术分析敲低
GPX2对人肝癌细胞凋亡的影响。结果成功构建pSicoR-GPX2干涉慢病毒载体并获得高滴度慢病毒颗粒,GPX2蛋白表达水
平和RNA表达水平均有显著下调,且人肝癌细胞感染GPX2干涉慢病毒后对凋亡更加敏感,其原因可能是促凋亡蛋白Bax的活
化和抗凋亡蛋白Bcl-2活性的抑制。结论成功构建人GPX2基因干涉慢病毒,为肝癌靶标治疗提供新的线索,为后续GPX2功
能研究奠定基础。
     

RNF31表达下调抑制TNF-α刺激的NF-κB通路的激活

目的利用慢病毒干涉下调内源性RNF31 表达,研究NF-κB通路的活化及对细胞凋亡的影响。方法将人RNF31 的
shRNA片段克隆到慢病毒表达载体pGreenPuro中,瞬时转染HEK293T细胞,筛选出有效的干涉片段。将重组表达质粒与包装
质粒PMD、SPA共转染293T 细胞,在24 h、48 h 分2 次收集慢病毒上清,用流式细胞术检测病毒滴度。将获得的病毒感染
HEK293细胞,提取细胞蛋白,Real-time PCR以及Western Blot 检测RNF31干涉效果;报告基因实验检测敲低RNF31对NF-κB
转录活性的影响;Real-time PCR检测干涉RNF31对TNF-α诱导的NF-κB下游靶基因的影响;Western Blot 检测下调RNF31对
IκBα活化的影响;Hochest染色检测下调RNF31对细胞凋亡的影响。结果成功构建RNF31干涉慢病毒pGreenPuro-RNF31载
体并获得慢病毒颗粒,病毒滴度可达3×107 pfu/ml。在HEK293细胞中下调RNF31,抑制TNF-α刺激的NF-κB的转录活性,并抑
制NF-κB下游靶基因的表达;下调RNF31抑制TNF-α刺激的IκBα的活化;此外,在TNF-α刺激细胞24 h时,RNF31表达下调使
细胞凋亡增多。结论RNF31表达下调抑制TNF-α刺激的NF-κB通路的激活。
     

FoxM1 shRNA慢病毒载体构建及感染人前列腺癌细胞的稳定细胞株筛选

目的构建携带绿色荧光蛋白（GFP）的人FoxM1 shRNA重组慢病毒载体,并构建筛选FoxM1敲低的人前列腺癌稳定细胞
株,检测FoxM1的表达及对细胞增殖能力的影响。方法设计并合成3对特异性针对人FoxM1基因的shRNA靶序列,构建到
pHBLV-U6-ZsGreen-Puro 慢病毒载体中,测序鉴定载体构建情况,利用慢病毒三质粒系统转染包装293T细胞,荧光显微镜下观
察转染效率。收集到的病毒上清转染人前列腺癌DU-145细胞,Real-time PCR检测各组细胞FoxM1 mRNA水平,经嘌呤霉素
筛选建立FoxM1敲低稳定细胞株,用Western blotting法检测细胞中FoxM1表达,并用MTT法观察稳转细胞的生长增殖活性,
流式细胞术观察稳转细胞凋亡情况,平板克隆实验观察稳转细胞的克隆形成能力。结果经测序鉴定成功构建了3对FoxM1
shRNA慢病毒载体,并进行包装,感染DU-145细胞后Real-time PCR检测结果表明第1对慢病毒载体干扰效率最佳,嘌呤霉素
抗性筛选建立了FoxM1敲低稳定细胞株,荧光显微镜观察感染效率较高,Western blotting结果显示细胞中FoxM1蛋白表达明
显受到抑制,细胞的生长增殖能力明显受限,流式细胞术结果显示FoxM1敲低组细胞凋亡率高于对照组,平板克隆实验结果表
明FoxM1敲低组细胞克隆形成能力下降。结论本研究成功构建了FoxM1 shRNA慢病毒载体,建立了FoxM1敲低稳定前列腺
癌细胞株,抑制细胞内FoxM1的表达能够抑制前列腺癌细胞DU-145的生长增殖、克隆形成能力,并能诱导细胞凋亡。
     

慢病毒介导的犬WRD细胞p53基因沉默及稳定感染细胞系的建立

目的构建靶向犬p53基因慢病毒干扰载体,建立稳定沉默p53 基因的WRD/p53-细胞系。方法设计并构建4条针对犬
p53基因的特异性shRNA干扰质粒。将构建的慢病毒表达载体（pGMLV-p53）和包装质粒（packaging mix）组成的包装系统共
转染293T细胞,包装病毒,收集病毒原液,超滤浓缩,并测定滴度。包装好的慢病毒感染WRD细胞,Western blot 和实时荧光定
量PCR方法检测不同靶点RNA干扰载体对p53基因的干扰效果,确定有效靶点。针对有效靶点慢病毒颗粒以最适感染复数
（multiplicity of infection, MOI）感染WRD细胞,puromycin抗生素筛选稳定感染细胞系WRD/p53-。结果结果显示p53 RNAi
慢病毒载体构建成功,成功包装四种不同靶点的p53基因RNA干扰慢病毒, 病毒滴度均达到1×109 TU/ml。四种干扰载体慢病
毒均具有较好的干扰效果,选用沉默效果最好的pGMLV-p53A1 为最优靶点,成功建立p53 RNAi慢病毒载体稳定感染细胞系
WRD/p53-。结论成功构建p53 RNAi慢病毒载体,并有效干扰WRD细胞中p53 mRNA和蛋白表达,同时成功筛选并建立p53
RNAi慢病毒稳定感染WRD/p53-细胞系。
     

Kiss-1基因通过NF-κB信号传导通路抑制人结直肠癌HCT116细胞迁移

目的探讨Kiss-1 基因抑制人结直肠癌细胞转移能力与NF-κB信号传导通路的相关性。方法构建重组pGC-LV-Kiss-
1-EGFP慢病毒载体并转染人结直肠癌HCT116细胞,实验分为空白对照组（CON组）、慢病毒空载体阴性对照组（NC组）、Kiss-1
基因过表达组（OE组）。CCK-8（Cell Counting Kit-8）法检测转染前后细胞增殖能力的变化,Transwell法分别检测转染前后细
胞的侵袭和迁移能力的变化。Western-blot法检测转染前后NF-κB信号传导通路中抑制性蛋白I-κB以及下游效应蛋白MMP-9
表达量的变化。结果OE组HCT116细胞中I-κB的表达含量较CON组、NC组明显升高（P<0.05）,下游效应蛋白MMP-9的表
达量明显下降（P<0.05）,差异具有统计学意义。OE组较CON组、NC组细胞增殖受到明显抑制（P<0.05）,细胞侵袭、迁移能力
亦出现明显抑制（P<0.05）。结论重组pGC-LV-Kiss-1-EGFP慢病毒转染人结直肠癌HCT116细胞后,可能通过NF-κB信号传
导通路途径抑制其增殖、侵袭和迁移能力。
     

慢病毒介导的shRNA靶向干扰nestin鼻咽癌稳定细胞株的建立

摘要：目的检测nestin基因在8种鼻咽癌细胞中的表达差异,寻找高表达的细胞株。构建nestin基因的shRNA表达载体,
建立nestin稳定干扰的鼻咽癌细胞株。方法应用Real-time PCR和免疫荧光技术检测nestin在鼻咽癌细胞株中的表达水
平。构建带GFP的重组靶向nestin shRNA慢病毒表达质粒,筛选阳性克隆,测序鉴定。293T细胞包装病毒,收集病毒上
清,测定滴度。经Real-time PCR内源筛靶,选择最佳靶点。将重组慢病毒感染5-8F细胞,Western blotting 和Real-time
PCR检测nestin的表达。结果在8种鼻咽癌细胞株中,5-8F细胞中nestin表达较高。PCR和测序验证重组质粒构建成
功。慢病毒感染5-8F细胞后,与阴性对照组和空白组相比,nestin的mRNA和蛋白水平明显受到抑制。结论成功构建了
干扰nestin的慢病毒重组质粒,并建立了稳定靶向干扰nestin表达的5-8F鼻咽癌细胞株。
     

VHL慢病毒表达和干扰载体的构建及对肾癌细胞增殖和凋亡的影响

目的构建人VHL重组慢病毒表达载体及干扰载体,建立稳定转染细胞株,观察VHL对肾癌细胞株增殖和凋亡的影响。
方法构建pZsGreen1-VHL及pLL3.7-shVHL重组慢病毒载体,与3质粒包装系统用脂质体法共同转染293T细胞,包装成病毒
颗粒,分别感染A498、Caki-1细胞,并进行RT-PCR和Western blot检验细胞中VHL的表达。用MTS法和流式细胞仪检测VHL
对肾癌细胞增殖和凋亡效应的影响。结果重组慢病毒载体及稳定转染细胞株构建成功,转染后VHL在细胞中表达明显变化;
VHL过表达细胞的增殖速度明显低于各对照组,而凋亡率明显高于各对照组;VHL干扰细胞的增殖速度明显高于各对照组,而
凋亡率明显低于各对照组（P<0.05）。结论VHL对肾癌细胞具有抑制增殖和诱导凋亡的作用。
     

HNF6 重组慢病毒载体的构建及对大肠癌SW620细胞侵袭转移能力的影响

摘要：目的构建HNF6的慢病毒载体pLeno-DCE-HA-HNF6,建立稳定表达HNF6的大肠癌细胞系并观察HNF6对大肠癌细胞
系SW620的侵袭转移能力的影响。方法构建HNF6慢病毒载体pLeno-DCE-HA-HNF6,感染293T细胞,收集上清测定病毒滴
度;病毒颗粒转染SW620细胞,通过荧光显微镜及流式细胞仪观察转染效率;定量PCR（qPCR）及Western blotting检测HNF6的
表达;应用Transwell 和划痕试验观察SW620 细胞侵袭转移能力的变化。结果通过PCR及酶切鉴定成功构建pLeno-DCEHA-
HNF6载体;包装并得到高滴度的病毒颗粒;转染SW620后,qPCR 及Western blotting检测到HNF6表达明显升高;HNF6导
致SW620 明显的细胞形态变化,Transwell 及划痕试验证明HNF6 使SW620 细胞迁移能力降低。结论成功构建并包装得到
HNF6的慢病毒颗粒,建立稳定表达HNF6的大肠癌细胞系SW620-HNF6,证明过表达HNF6后可以抑制大肠癌侵袭转移能力。
     

Rheb和Rheb’D60K突变基因重组慢病毒载体的构建、鉴定及其对肝癌细胞凋亡的影响

摘要：目的构建携带Rheb和Rheb’D60K突变基因的重组慢病毒载体,并鉴定其在MCF-7细胞中的表达效果,观察其对肝癌细
胞凋亡的影响。方法PCR法扩增Rheb和Rheb’D60K突变基因,构建重组质粒LV31-Rheb-WT、LV31-Rheb-D60K,脂质体法将
重组慢病毒载体和包装质粒混合物共转染HEK-293 FT 细胞,包装产生慢病毒颗粒。将病毒感染MCF-7 细胞后Western
blotting检测Rheb及PS6蛋白的表达;将病毒感染SK-HEP-1细胞饥饿处理后观察其凋亡情况。结果PCR及测序表明成功构
建了LV31-Rheb-WT、LV31-Rheb-D60K重组慢病毒载体。Western blotting 结果显示慢病毒LV31-Rheb-WT感染的MCF-7 细
胞内Rheb下游的PS6蛋白表达多于慢病毒LV31-Rheb-D60K感染的MCF-7细胞。显微镜下慢病毒LV31-Rheb-D60K感染的
SK-HEP-1 细胞饥饿后凋亡数目多于慢病毒LV31-Rheb-WT 感染的SK-HEP-1 细胞。结论本研究成功构建了Rheb 和
Rheb’D60K突变基因重组慢病毒载体,初步观察到该突变基因重组慢病毒载体可诱导肝癌细胞凋亡,为进一步研究Rheb基因在
肝癌发生发展中的作用,进而开展肝癌的临床靶向治疗研究奠定了基础。
     

p38丝裂原激活蛋白激酶基因重组慢病毒载体的构建及其在建立人前列腺癌稳定细胞株中的应用

摘要：目的构建p38 丝裂原激活蛋白激酶基因（MAPK）重组慢病毒载体并建立表达外源性p38 基因的人前列腺癌稳定细胞
株。方法采用限制性内切酶酶切、T4 DNA 连接酶连接等方法,将EGFP/p38 融合基因插入慢病毒载体pTYFEF1α-
IRES-EGFP中,构建启动子EF1α调控的EGFP/p38共表达慢病毒载体pTYF-EF1α-EGFP/p38,经酶切鉴定后,利用慢病毒
三质粒系统,通过脂质体法转染包装细胞HEK 293T细胞,收集病毒上清后转导人前列腺癌DU145细胞株,经有限稀释法筛选
重组EGFP/p38稳定细胞株,用Western blotting检测细胞总p38的表达,用计数法绘制细胞的生长曲线。结果经酶切鉴定,成
功构建EGFP/p38重组慢病毒载体,并包装慢病毒,检测病毒悬液的滴度为4.7×106 TU/ml,利用此病毒悬液感染DU145细胞,成
功筛选到EGFP/p38稳定表达细胞株,Western blotting显示该细胞株能稳定表达外源性EGFP/p38融合蛋白,这种过表达p38的
细胞株的生长速度明显低于对照组。结论成功构建p38 MAPK重组慢病毒载体并建立了表达外源性p38 MAPK基因的稳定
细胞株EGFP/p38-DU145,细胞内p38过表达能够抑制DU145细胞的增殖。
     

PPM1D silencing by lentiviral-mediated RNA interference inhibits proliferation and invasion of human glioma cells

To construct a lentiviral shRNA vector targeting human protein phosphatase 1D magnesium-dependent(PPM1D) gene and detect its effectiveness of gene silencing in human gliomas,specific siRNA targets with short hairpin frame were designed and synthesized.DNA oligo was cloned into the pFU-GW-iRNA lentiviral expression vector,and then PCR and sequencing analyses were conducted to verify the constructs.After the verified plasmids were transfected into 293T cells,the lentivirus was produced and the titer of virus was determined.Real-time quantitative PCR and Western blot were performed to detect the PPM1D expression level in the infected glioma cells.PCR and Western blot analyses revealed the optimal interfering target,and the virus with a titer of 6×108 TU/mL was successfully packaged.The PPM1D expression in human glioma cells was knocked down at both mRNA and protein levels by virus infection.The expression of PPM1D mRNA and protein was decreased by 76.3% and 87.0% respectively as compared with control group.The multiple functions of human glioma cells after PPM1D RNA interference were detected by flow cytometry and cell counting kit-8(CCK-8).Efficient down-regulation of PPM1D resulted in significantly increased cell apoptosis and reduced cell proliferation and invasion potential in U87-MG cells.We have successfully constructed the lentiviral shRNA expression vector capable of stable PPM1D gene silencing at both mRNA and protein levels in glioma cells.And our data gave evidence that the reduced cell growth observed after PPM1D silencing in glioma cells was at least partly due to increased apoptotic cell death.     

新型shRNA慢病毒载体抑制TGIF表达及对TGF-β通路的调节

目的构建针对同源域蛋白TGIF（5′-TG-3′interacting factor）可诱导表达shRNA的慢病毒载体,鉴定其在大肠癌细胞系DLD1中对TGIF的基因沉默效率,进一步研究其对TGF-β信号通路下游基因的影响。方法设计并合成针对TGIF的RNA干扰序列,克隆到可被强力霉素诱导的新型Tet-on慢病毒载体,将慢病毒颗粒感染大肠癌细胞系DLD1细胞。培养并分离细胞克隆后,使用强力霉素（doxcycline）进行诱导,用Real-Time PCR和Western印迹法检测TGIF和PAI-1的表达情况。结果构建了针对TGIF可诱导shRNA的真核表达病毒载体并获得相应的病毒,病毒可以高效感染大肠癌细胞系DLD1。在强力霉素诱导下,TGIF在DLD1细胞系的表达得到有效抑制,TGF-β下游基因PAI-1和p15表达明显升高。结论本研究成功构建了可诱导表达shRNA慢病毒载体,其在强力霉素诱导下可以有效抑制TGIF在大肠癌细胞系内的表达;TGIF可以抑制TGF-β信号传导通路。     

慢病毒介导RNA干扰沉默Fas 基因在脐带间充质干细胞中的表达

目的应用慢病毒介导的RNA干扰技术,构建Fas基因的siRNA慢病毒表达载体,建立Fas基因稳定干扰的人脐带间充质
干细胞（UC-MSCs）株,为下一步使用低表达Fas 基因的UC-MSCs治疗再生障碍性贫血奠定实验基础。方法以人Fas 基因
mRNA序列作为干扰靶点,设计4组靶向Fas的shRNA序列,合成寡核苷酸,与经过BamHI、EcoRI双酶切后的LV3载体连接获
得重组慢病毒,通过感染293T 细胞对慢病毒进行包装和滴度测定。体外培养人UC-MSCs,使用包装好的慢病毒感染
UC-MSCs,应用Real time- PCR和Western blotting检测感染后细胞中Fas mRNA及蛋白的表达情况。结果经酶切以及基因测
序鉴定证明慢病毒载体构建成功,病毒悬液滴度为3×108 TU/ml。Real time-PCR和Western blotting结果显示干扰组细胞的Fas
表达水平较对照组显著降低。结论慢病毒介导的SiRNA能有效沉默UC-MSCs中Fas基因的表达。
     

RNA干扰抑制p62基因表达对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响

目的:研究shRNA降低p62基因表达对人宫颈腺癌HeLa细胞增殖的影响。方法:构建具有沉默p62表达的慢病毒载体短发夹RNA（shRNA）序列,采用Polybrene将其转染入宫颈腺癌HeLa细胞中（shRNA组）,设立shNC作为阴性对照组,另设未加慢病毒转染载体的空白对照组。采用实时荧光定量qRT-PCR技术检测各组相对空白对照组的p62基因相对表达量;采用CCK-8实验检测3组细胞的增殖情况,采用集落克隆形成实验检测3组细胞的克隆形成率。结果:沉默p62基因表达的宫颈癌HeLa细胞成功构建;shRNA组p62mRNA相对空白对照组的相对表达量为（0.18±0.08）,而shNC组的p62mRNA相对空白对照组的相对表达量为（1.01±0.12）（t=9.97,P<0.01）;shRNA的干扰效率为81.00%;shRNA组较阴性对照组和空白对照组细胞增殖速度变慢（P<0.05）,克隆形成率减少（P<0.01）。结论:p62基因沉默后,宫颈癌HeLa细胞的增殖速度变慢。p62基因在宫颈癌HeLa细胞的增殖中起着重要的作用。     

shRNA-PAX6慢病毒载体构建及其对胶质瘤U251细胞增殖的影响

目的 构建shRNA-PAX6慢病毒载体并观察其对胶质瘤U251细胞增殖的影响.方法 根据文献报道的PAX6靶点序列,设计两条PAX6基因的siRNA靶点干扰序列,引物退火形成带粘性末端的双链,与经BamH I、EcoR I双酶切后线性化的慢病毒载体进行连接、转化,构建shRNA-PAX6慢病毒重组载体,再经菌落PCR及测序鉴定重组载体;在293T细胞中包装病毒,将包装后的shRNA-PAX6慢病毒重组载体感染U251细胞.Real-time PCR检测PAX6 mRNA的表达水平,Western blot检测PAX6蛋白的表达,MTT法检测U251细胞增殖.结果 慢病毒载体pLKD-CMV-G&NR-U6-shRNA经双酶切后可见线性化的8208 bp大片段,菌落PCR及测序鉴定证实shRNA-PAX6慢病毒重组载体构建成功,构建的shRNA-PAX6慢病毒载体在293T细胞完成包装,测得慢病毒滴度为6.73×108TU/mL;Real-time PCR结果显示,沉默PAX6的表达可见U251细胞PAX6 mRNA表达水平明显低于正常对照组及慢病毒空载体组(P<0.05);Western blot结果显示,PAX6蛋白表达亦明显低于正常对照组及慢病毒空载体组(P<0.05);MTT结果显示,与正常对照组及慢病毒空载体组细胞比较,感染shRNA-PAX6慢病毒重组载体组的细胞,细胞增殖能力明显增强(P<0.05).结论 成功构建人PAX6基因的shRNA-PAX6慢病毒重组载体,沉默PAX6基因的表达,U251细胞的增殖能力增强.     

Id2 shRNA慢病毒载体的构建及其转染后对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的构建能高效敲减分化抑制因子2(Id2)基因的短发夹状小干扰RNA(shRNA)慢病毒载体,并观察敲减Id2对胶质瘤细胞株U251增殖和凋亡的影响。方法设计并合成特异性针对Id2基因的shRNA序列,将其构建到慢病毒载体pGCSIL-GFP中。以含有Id2基因的质粒为模板,扩增Id2基因cDNA序列的特异性片段,插入真核表达载体pEGFP-N1-3FLAG。构建含Id2基因质粒和不同靶点的RNAi慢病毒载体,共转染入工具细胞293T,筛选出适合浓度慢病毒感染U251细胞株。MTT法检测敲减Id2后胶质瘤细胞增殖的改变,RT-PCR检测Id2敲减后U251细胞caspase 3的表达。结果构建后载体的PCR鉴定及DNA测序结果与预期一致。与对照组相比,转染Id2 shRNA的U251细胞增殖降低,凋亡率升高,caspase3表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建的针对Id2基因的RNA干扰慢病毒载体体外转染可抑制胶质瘤细胞增殖并促进其凋亡。