新生大鼠海马神经干细胞的分离培养及分化研究

研究新生大鼠海马区脑组织中神经干细胞体外培养方法,为治疗神经系统疾病寻找合适的细胞来源。取新生SD大鼠的海马区脑组织,采用accutase结合机械分离法获取神经干细胞,在含有B－27、碱性成纤维生长因子和表皮生长因子的DMEM／F12无血清培养液中培养;Accutase酶消化后传代培养,取第3代细胞行抗巢蛋白免疫荧光染色鉴定并以含10％胎牛血清培养液诱导分化,神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白免疫荧光染色检测NSCs向神经元及胶质细胞分化的能力。分离的新生大鼠海马区脑组织中细胞,在无血清培养液中形成大量的神经球,部分神经球出现融合及贴壁分化现象,细胞呈典型NSCs 形态。经巢蛋白染色鉴定,大部分为阳性细胞。神经细胞球经含有胎牛血清培养液培养后,可分化为神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白表达阳性的细胞。从新生大鼠海马组织分离培养的NSCs具有自我更新和增殖能力,在含胎牛血清培养液中具有向神经元和神经胶质细胞分化的潜能。     

胚胎大鼠脊髓神经干细胞的培养及鉴定

为了探讨胚胎大鼠脊髓神经管神经干细胞体外培养、鉴定的方法,本实验在解剖显微镜下机械性分离11.5 d的胚胎大鼠脊髓神经管,并制备细胞悬液,无血清培养基培养。应用免疫荧光染色方法对原代和传代细胞进行巢蛋白(nestin)鉴定;加入胎牛血清诱导其分化后分别行神经元特异烯醇化酶(NSE)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和髓磷脂碱性蛋白(MBP)鉴定。结果显示:11.5 d胚胎大鼠脊髓神经管来源的神经干细胞经连续传代培养可形成较多克隆球,呈nestin免疫阳性;加入胎牛血清可诱导其分别向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化。本实验结果提示,利用E11.5的胚胎大鼠脊髓神经管可成功培养出大量稳定增殖并有多向分化潜能的神经干细胞,可用于进一步的研究。     

全反式视黄酸诱导兔骨髓间充质干细胞向神经细胞的分化

背景：目前,在骨髓间充质干细胞体外向神经细胞分化的实验中,较多采用抗氧化剂法和细胞因子法,但诱导效率低。 目的：探讨全反式视黄酸在兔骨髓间充质干细胞向神经细胞分化中的作用。 方法：体外分离培养兔骨髓间充质干细胞,取第4代骨髓间充质干细胞观察细胞形态,实验组用0.4 μmol/L全反式视黄酸预诱导24 h后,改用神经细胞培养基继续培养。神经细胞培养基培养4,8,16及24 h,免疫组织化学检测巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白的表达情况,采用RT-PCR的方法检测巢蛋白和神经元特异性烯醇化酶的表达水平。 结果与结论：骨髓间充质干细胞经培养、传代后,细胞贴壁生长,呈长梭形。免疫组织化学检测结果显示：全反式视黄酸诱导组巢蛋白及神经元特异性烯醇化酶呈阳性,诱导后细胞的活力良好。RT-PCR结果显示全反式视黄酸诱导组巢蛋白在诱导前后均有表达,神经元特异性烯醇化酶在诱导后16 h可见明显的扩增条带,24 h后更加明显。提示全反式视黄酸能够在体外促进兔骨髓间充质干细胞向神经细胞分化。     

条件培养液对Wistar大鼠海马神经干细胞单细胞克隆增殖的影响

目的探讨神经干细胞(NSCs)条件培养液对其单细胞克隆增殖的影响。方法采用无血清培养法体外培养Wistar大鼠海马神经干细胞并进行传代培养,然后收集神经干细胞条件培养液。第四代细胞进行单细胞克隆,并将单细胞克隆细胞分为条件培养液组、无血清培养液对照组。通过MTT法比较两组细胞的增殖情况。单克隆培养细胞行巢蛋白(nestin)免疫细胞化学染色,诱导分化后细胞行神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、半乳糖脑苷脂(Galc)免疫细胞化学染色。结果单克隆培养后克隆球表达nestin,诱导分化后细胞表达NSE、GFAP、Galc,条件培养液组细胞增殖速度高于对照组。结论条件培养液能提高Wistar大鼠海马神经干细胞单细胞克隆的增殖速度。     

体外培养大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化:Wnt3a信号分子的诱导作用

背景:Wnt信号通路是细胞增殖分化的关键调控环节。已有证据显示此通路参与了对神经前体细胞增殖、分化以及决定细胞命运的调控。目前有关Wnt信号通路对间充质干细胞向神经元样细胞分化的作用还少见报道。目的:寻找促进间充质干细胞向神经元样细胞分化的Wnt信号分子。方法:采用密度梯度离心法在体外分离培养SD大鼠股骨间充质干细胞并培养。传代后通过形态学和流式细胞学检测细胞表面标志物CD29、CD44、CD34、CD45,筛选并鉴定培养细胞。采用神经营养因子碱性成纤维细胞生长因子分别联合Wnt3a和Wnt5a诱导方案,通过免疫组化和RT-PCR的方法比较Wnt3a、Wnt5a在间充质干细胞向神经元样细胞分化过程中的作用,以碱性成纤维细胞生长因子单独培养为对照。结果与结论:间充质干细胞经培养、传代后,细胞贴壁生长,形态均一,呈长梭形,流式细胞学检测细胞表面标志物CD29、CD44高表达,CD34、CD45低表达。Wnt3a诱导后细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶呈阳性,胶质纤维酸性蛋白无明显表达,诱导后细胞的活力良好;Wnt5a诱导组及对照组巢蛋白呈弱阳性表达,神经元特异性烯醇化酶及胶质纤维酸性蛋白阴性。RT-PCR结果显示,Wnt3a诱导组巢蛋白在诱导前后均有表达,神经元特异性烯醇化酶在诱导后5d可见明显的扩增条带,10d后更加明显;胶质纤维酸性蛋白在诱导10d后有比较弱的扩增条带出现。结果说明Wnt3a分子能够促进体外培养的间充质干细胞向神经元样细胞分化。     

隐丹参酮诱导猴骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞

目的： 体外培养猴骨髓间质干细胞（MSCs）并定向诱导分化为神经元样细胞。 方法： 体外分离培养猴MSCs，流式细胞仪检测其表面标志，用含隐丹参酮的无血清L-DMEM诱导MSCs分化为神经元样细胞，免疫细胞化学检测单克隆抗体特异性神经元烯醇化酶（NSE）、神经丝蛋白（NF）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。 结果： 体外培养的猴MSCs表达CD29、CD44、CD105、CD166，并且具有正常的二倍体核型，不随传代而发生改变。bFGF预诱导24 h 后，隐丹参酮可以将MSCs诱导为神经元样细胞，免疫细胞化学显示NSE、NF表达阳性，阳性率分别为68.3％±3.5％、70.3％±1.5％，而GFAP表达阴性。 结论： 隐丹参酮可以在体外将猴MSCs诱导分化为神经元样细胞。     

脑源性神经营养因子促进低血糖幼鼠海马神经干细胞的定向分化

背景：有研究表明脑源性神经营养因子可以维持神经元的存活、影响神经元的迁移,在体外可以促进神经干细胞的存活和分化。 目的：探讨脑源性神经营养因子对低血糖幼鼠海马神经干细胞定向分化的作用。 方法：取新生1 d低血糖模型大鼠脑海马组织进行原代、传代及单细胞克隆培养。培养的细胞一部分进行神经干细胞鉴定,另一部分依据培养液中脑源性神经营养因子质量浓度的不同将单克隆细胞分为0,100,200 μg/L组,取第4代细胞进行诱导分化,行神经元特异性烯醇化酶免疫荧光染色,计数阳性细胞比例。 结果与结论：单克隆培养后3组细胞均呈巢蛋白阳性,诱导分化后细胞呈行神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白阳性;100,200 μg/L组神经干细胞生长较快,且分化为神经元特异性烯醇化酶阳性细胞比例较高(P < 0.05),但两组神经干细胞之间差异无显著性意义(P > 0.05)。提示脑源性神经营养因子促进低血糖幼鼠海马神经干细胞向神经元定向分化。     

Neurogenin2基因调控许旺细胞转分化为神经元

背景：Neurogenin2(Ngn2)基因调控星形胶质细胞分化为神经元已被实验证实,这提示许旺细胞也可能通过基因调控分化为神经元。 目的：研究Neurogenin2基因调控大鼠许旺细胞向神经元分化的可行性。 方法：体外培养、纯化及鉴定大鼠许旺细胞,然后用含绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体系统将Neurogenin2基因转染导入许旺细胞中,最后用含碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和脑源性细胞生长因子的无血清DMEM诱导培养许旺细胞2周。显微镜观察细胞形态,免疫细胞化学检测髓磷脂碱性蛋白及神经元特异性烯醇化酶。 结果与结论：许旺细胞转染导入Neurogenin2基因并诱导分化后,免疫荧光检测发现12.56%的细胞表达神经元标志性蛋白神经元特异性烯醇化酶,而对照组均未发现表达神经元标志性蛋白神经元特异性烯醇化酶。Neurogenin2基因植入可使大鼠许旺细胞表达神经元标志性蛋白神经元特异性烯醇化酶,提示该基因可调控许旺细胞转分化为神经元。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

神经干细胞体外培养鉴定及诱导分化的表型特征

背景：神经干细胞促进受损中枢神经系统结构和功能再修复具有广阔的应用前景,而进行神经干细胞体外培养鉴定及诱导分化表型的研究是实现这一应用的基础。 目的：观察神经干细胞在体外培养条件下的生物学特性和分化表型特点。 方法：从新生小鼠海马、嗅球提取神经干细胞。选取3代后稳定的神经干细胞采用BrdU进行标记,并进行BrdU+巢蛋白+Hochest33258免疫荧光复合染色对神经干细胞进行鉴定。体外诱导促使神经干细胞贴壁分化,对分化产生的子代细胞进行BrdU、β-微管蛋白Ⅲ、胶质纤维酸性蛋白、Hochest33258复合免疫荧光染色确定分化表型。 结果与结论：来源于新生鼠海马及嗅球的细胞连续传代培养后可形成稳定悬浮的类球状细胞团,且BrdU+巢蛋白免疫荧光双染阳性。神经干细胞体外诱导贴壁分化后可产生β-微管蛋白Ⅲ、胶质纤维酸性蛋白阳性的子代细胞。以上结果表明体外培养的神经干细胞具有很强的自我增殖更新的能力,在培养过程中趋向于形成稳定的神经球,经体外诱导通过不对称细胞增殖、分化产生神经元和星形胶质细胞等细胞表型。     

Wnt3a促进大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化(英文)

背景:Wnt 信号通路是细胞增殖分化的关键调控环节,但与骨髓间充质干细胞神经分化的联系并不十分明确。目的:寻找促进骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的 Wnt 信号分子。方法:首先体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞并传代,行形态学观察,并以流式细胞学方法检测细胞表型 CD44,CD9,CD34和 CD45。采用碱性成纤维细胞生长因子分别联合 Wnt3a 或 Wnt5a 的方案诱导分化,应用免疫组化和反转录-聚合酶链反应方法比较 Wnt3a 和 Wnt5a 对骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的影响。结果与结论:骨髓间充质干细胞为长梭形,CD9,CD44 高表达,CD34,CD45 低表达。Wnt3a 诱导组的巢蛋白和神经元特异烯醇化酶呈阳性,而胶质纤维酸性蛋白无明显表达,诱导后细胞的活力良好。Wnt5a 诱导组巢蛋白呈弱阳性表达,而神经元特异烯醇化酶及胶质纤维酸性蛋白阴性。反转录-聚合酶链反应结果显示,Wnt3a 诱导组巢蛋白在诱导前后均有表达,神经元特异烯醇化酶在诱导后 5 d 可见明显的扩增条带,10 d 后更加明显。胶质纤维酸性蛋白在诱导 10 d 后出现较弱的扩增条带。Wnt5a 组、对照组骨髓间充质干细胞在诱导后 10 d 巢蛋白有微弱表达,神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白几乎无表达。提示 Wnt3a 分子能够促进体外培养的骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化。     

人类胚胎来源成肌细胞的培养和鉴定

背景：人类胚胎骨骼肌含有成肌细胞,其在体外条件下的培养及在体外能否融合形成肌管,以及表达的相应的标志物,目前尚不明确。 目的：验证源于人类胚胎骨骼肌的成肌细胞在体外条件下的培养条件,能否在体外融合形成肌管,能否表达神经细胞的标志物。 方法：采用组织块培养法对人类胚胎肌肉来源的成肌细胞进行原代培养,以免疫细胞化学染色检测培养的细胞肌肉细胞标志物desmin、myogenin、平滑肌肌动蛋白、myosin和神经细胞标志物β-tubulin Ⅲ、nestin、neurofilament 200 (NF200)、胶质纤维酸性蛋白的表达。 结果与结论：从人类胚胎肌肉组织中成功培养出成肌细胞,表达成肌细胞的标志物desmin和myogenin,同时也表达神经元特异性烯醇化酶、nestin和NF200,细胞能够在体外融合形成含有多个细胞核的肌管,融合的肌管可以表达NF200、β-tubulin Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白等神经细胞的标志物。结果证实,人类胚胎肌肉来源的成肌细胞能够同时表达神经细胞和肌肉细胞的标志物,培养的成肌细胞和肌管细胞表达神经元特异性烯醇化酶、β-tubulin Ⅲ、nestin、NF 200和胶质纤维酸性蛋白。说明这几种神经细胞标志物不能用于肌肉来源的细胞向神经细胞跨分化的鉴定研究。     

大鼠胚胎脑组织神经干细胞的培养和鉴定

目的探讨从不同胎龄的大鼠脑组织中分离,培养神经干细胞(NSC)并对其鉴定,了解生物特性。方法通过采用机械分离和消化分离相结合的方法分离不同胎龄大鼠脑NSC。在无血清DMEM/F12(含20ng/m lbFGF,20ng/m lEGF及B27辅助培养液)中培养、传代和鉴定。诱导分化后采用SABC法对分化的细胞进行神经元特异烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)检测作细胞鉴定。结果从不同胎龄的胎鼠脑组织中成功培养出神经干细胞,胎龄为12.5天的胎鼠提取的神经干细胞集落最多,在上述条件下培养及传代的细胞不断分裂增殖,形成悬浮生长的呈巢素蛋白(nestin)阳性的神经球;用血清诱导分化为大量表达NSE阳性的神经元和GFAP阳性的星形胶质细胞。结论胎龄为12.5天胎鼠大脑皮质培养出的神经干细胞数量最多,可分化为神经元、神经胶质细胞及少突胶质细胞。     

人胶质瘤干细胞趋化因子受体CXCR4活化促进血管生成的作用

目的从人恶性胶质瘤细胞系U87中分离、培养和鉴定胶质瘤干细胞,观测其CXCR4表达情况及其活化后促血管生成因子分泌的变化。方法通过流式细胞术检测U87细胞中CD133阳性细胞的比例。使用CD133免疫磁珠分离试剂盒通过磁性细胞分选系统分离胶质瘤干细胞。采用间接免疫荧光标记、激光共聚焦扫描显微术观测胶质瘤干细胞中神经巢蛋白（nestin）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、趋化因子受体CXCR4的表达;以CXCR4配体刺激通过钙流试验检测受体功能,采用酶联免疫吸附试验（EIJSA）检测培养上清中血管内皮生长因子（VEGF）和白细胞介素-8（IL-8）的含量。建立裸鼠皮下移植瘤模型,观察胶质瘤干细胞成瘤情况及瘤体内VEGF表达情况。结果U87细胞系中CD133阳性细胞的比例为0．5％,这些细胞具有干细胞增殖和生长特性;它们表达CXCR4,用其相应配体激活后导致胞内钙流增加、分泌VEGF和IL-8增多。与CD133阴性细胞相比,CD133阳性细胞在体外分泌VEGF、IL-8多,在体内成瘤率高,形成的移植瘤生长迅速,表达更多VEGF。结论人恶性胶质细胞瘤细胞系U87中含有极少量胶质瘤干细胞,表达功能性CXCR4、分泌更多促血管生成因子,提示这些干细胞也直接参与胶质瘤血管生成。     

神经干细胞培养及其影响因素

背景：神经干细胞移植治疗是中枢神经系统损伤性、难治性疾病研究的热点。如何有效提高神经干细胞存活率、克隆形成率将是其应用的重要基础和前提。 目的：探讨影响神经干细胞培养质量的可能因素,为神经干细胞的基础和临床应用研究提供参考。 方法：①神经干细胞分离和培养：分离出生24 h内SD大鼠的大脑,剪碎离心后以1×10⁸ L^-1的浓度接种,经含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基预培养4 h后改用无血清条件培养基(DMEM/F12,碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、B27)培养,2 d或3 d换液1次,6 d时传代。②神经干细胞鉴定：倒置显微镜下观察细胞形态及生物学特性;免疫组化检测第3代细胞神经巢蛋白表达和诱导分化后神经元特异性烯醇化酶和神经胶质酸性蛋白的表达。 结果与结论：出生24 h的新生大鼠可获得足量的神经干细胞;血清预培养可提高神经干细胞的增殖和存活率;免疫组化结合血清诱导分化可对培养的神经干细胞进行定性鉴定。取材时间、细胞接种密度、传代时间、细胞因子、血清等多种因素都将影响神经干细胞的培养质量。     

新生小鼠海马神经干细胞体外培养条件下的增殖与分化

背景：神经干细胞移植可用于中枢神经损伤的临床治疗。 目的：观察新生小鼠海马神经干细胞在体外培养条件下的增殖和分化。 方法：从新生昆明小鼠海马取材,采用机械分离法对原代细胞进行无血清培养,采用机械法复合酶消化法对原代细胞进行传代,以体积分数为10%胎牛血清诱导分化。免疫荧光行巢蛋白、β-微管蛋白Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白染色,对培养的细胞进行鉴定。CCK-8法检测神经干细胞增殖能力。 结果与结论：从新生小鼠海马分离得到的细胞具有连续传代形成克隆球的能力,克隆球呈巢蛋白免疫反应阳性;加入胎牛血清可诱导分化为β-微管蛋白Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞。提示实验成功建立了体外培养新生小鼠海马组织分离和培养神经干细胞的方法,培养的神经干细胞在体外培养条件下保持着自我增殖和分化的潜能。     

骨髓间质干细胞定向分化的实验研究

为了探讨体外定向诱导人骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞的机制,本研究将分离的人MSC进行体外扩增培养,并观察脑心舒定向诱导MSC分化为类神经元样细胞的效应。在光镜下观察细胞形态,用免疫细胞化学法检测神经细胞特异性抗原标志。结果显示人MSC可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。脑心舒诱导120min后大部分MSC转变为神经元样细胞,出现胞体和突起,免疫细胞化学染色NSE、nestin呈阳性和GFAP阴性。上述结果提示人骨髓间质干细胞可在体外诱导分化为神经元样细胞。     

新生大鼠神经干细胞的分离培养与分化

目的　从新生SD大鼠脑室下区分离并培养神经干细胞 ,观察神经干细胞的生长、增殖及分化的特点。方法　利用无血清培养和单细胞克隆技术 ,采用原代贴壁及传代悬浮的方法 ,培养获得细胞克隆。应用免疫细胞化学方法及透射电镜检测技术 ,鉴定神经干细胞和分化的神经细胞。结果　从新生SD大鼠脑室下区分离的组织 ,经原代和传代培养均可形成细胞克隆 ,并具有增殖的能力。原代和传代细胞Nestin抗原呈阳性 ,分化后的细胞可表达NSE、GFAP、GC特异性抗原。结论　本法从新生SD大鼠脑室下区分离的细胞具有自我更新和分化潜能 ,有很强的增殖能力 ,属于中枢神经系统的干细胞     

黄连素诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞

目的:黄连素体外定向诱导SD大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。方法:用全骨髓细胞悬液体外扩增和纯化骨髓间质干细胞。选用第5代以后骨髓间质干细胞进行诱导分化,用含10 μg/L碱性细胞生长因子(bFGF)的完全培养液预诱导24 h,后更换含黄连素的无血清DMEM诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。免疫组化鉴定神经元烯醇酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果:大鼠骨髓间质干细胞体外扩增第5代后细胞形态达到均一,成梭形。加黄连素诱导1h-8 h,间质干细胞胞体逐渐增大并伸出细长突起,形似神经细胞。免疫组化显示诱导的神经元样细胞NSE、NF表达阳性,GFAP阴性。结论:黄连素可诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。