两种培养体系条件下人脐带间充质干细胞向软骨细胞的分化

背景：无支架体外诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法主要包括高密度微团培养、单层细胞培养、与软骨细胞体外共培养等,其中高密度微团培养和体外单层细胞培养因操作简便易行,诱导成功率高受到广泛关注。 目的：寻求一种更佳的无支架体外诱导人脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的方法。 方法：组织块法分离人脐带间充质干细胞,流式细胞仪鉴定其表面标志。收集第3代人脐带间充质干细胞分别采用平面诱导培养和离心管聚集成团培养,使其向软骨细胞分化。 结果与结论：人脐带间充质干细胞的细胞表型CD105⁺/CD29⁺/CD44⁺/CD31^-/CD34^-/CD40^-CD45^-/HLA^-DR^-。未诱导的人脐带间充质干细胞表达微弱的软骨细胞标志物,经诱导后葡萄糖胺聚糖和Ⅱ型胶原表达量显著增加,其中聚集成团培养的表达量高于平面培养。实时定量PCR结果显示,诱导后细胞较诱导前均高表达葡萄糖胺聚糖、Ⅱ型胶原和SOX-9 mRNA,其中聚集成团培养的表达量高于平面培养。说明人脐带间充质干细胞在聚集成团培养体系中诱导更有利于其分化成软骨细胞。     

重型肝病患者血清诱导脐血间充质干细胞表达白蛋白和细胞角蛋白18

背景：脐血富含间充质干细胞,刺激后进入细胞周期的速度以及自分泌生长因子的能力均强于骨髓及外周血干细胞。 目的：观察肝衰竭患者血清对人脐血间充质干细胞的诱导分化作用。 方法：密度梯度离心和贴壁培养法相结合分离纯化脐血间充质干细胞并鉴定,以20%肝衰竭患者血清诱导培养,培养7,14,21 d采用免疫组织化学方法检测白蛋白和细胞角蛋白18的表达。 结果与结论：实验分离获得了高纯度贴壁生长的间充质干细胞,人脐血间充质干细胞高表达CD44和CD29,不表达CD34,体外可以分化为脂肪细胞;人脐血间充质干细胞在肝病患者血清的低糖DMEM培养基中形态发生明显改变,镜下观察细胞变得稍大而扁平,呈类上皮样细胞,SP染色显示实验组培养7 d时仅少数细胞表达白蛋白和细胞角蛋白18,培养14,21 d,白蛋白和细胞角蛋白18表达阳性率逐渐升高,与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05)。提示密度梯度离心和贴壁培养法相结合可以获得纯度较高的脐血间充质干细胞,肝衰竭患者血清可诱导间充质干细胞表达白蛋白和细胞角蛋白18。     

密度梯度离心法体外培养骨髓间充质干细胞的分化能力

背景：骨髓间充质干细胞具有多向分化能力,是目前极具潜力的种子细胞及基因治疗的靶细胞。 目的：体外培养兔骨髓来源间充质干细胞,了解其生物学特性。 方法：采用密度梯度离心法培养兔骨髓间充质干细胞,对细胞的形态及生长特性进行观察,应用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD29、CD34、CD44、CD45、CD166、HLA-DR表达,并进行相关生物学特性鉴定。 结果与结论：密度梯度离心法能分离培养出纯度较高的骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表达CD29、CD44、CD166,不表达CD34、CD45、HLA-DR。在适当的条件下能够诱导分化成为成骨细胞、软骨细胞等。     

人类脐血来源的间充质干细胞向软骨和成骨细胞分化的实验研究

取足月剖宫产健康新生儿脐血,应用密度梯度法分离脐血单个核细胞,利用形态学特点和流式细胞仪检测细胞表面标志,鉴定和获取间充质干细胞.应用软骨诱导剂(10 ng/ml TGF-β、100 ng/ml胰岛素、10-7 mol/L地塞米松、6.25 μg/ml转铁蛋白)和成骨诱导剂(10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μg/ml维生素C、10-7mol/L地塞米松)定向诱导分化培养,以检测其是否具有分化能力.脐血来源的间充质干细胞表达CD13、CD44、CD73、CD90、CD166、HLA-AB,不表达CD34、CD45、HLA-DR.诱导分化21 d后,甲苯胺蓝染色和von-Kossa染色均显示阳性,免疫细胞化学结果显示脐血来源干细胞经软骨诱导后表达Ⅱ型胶原.表明脐血中存在着间充质干细胞,可在体外扩增培养,具有分化成软骨细胞与成骨细胞的能力.     

脐血间充质干细胞的分离培养及生物学特性

背景：脐血富含干细胞,刺激后进入细胞周期的速度以及自泌生长因子的能力均强于骨髓及外周血干细胞。 目的：建立一种分离纯化、培养扩增脐血间充质干细胞的方法,并观察体外培养脐血间充质干细胞的生物学特性。 方法：密度梯度离心,贴壁培养和消化时间控制相结合,分离纯化脐血间充质干细胞。观察细胞形态,绘制细胞生长曲线,应用流式细胞仪测定细胞周期,以免疫组织化学法(SP法)测定CD29,CD44,CD34。采用体积分数20%马血清诱导脐血间充质干细胞分化为脂肪细胞,以油红O染色鉴定;0.1 μmol/L地塞米松,10 mmol/L β-甘油磷酸钠和50 μmol/L抗坏血酸诱导脐血间充质干细胞分化为成骨细胞,以碱性磷酸酶染色鉴定。 结果与结论：分离获得了高纯度贴壁生长的间充质干细胞,间充质干细胞呈梭形,细胞传代稳定,在体外连续传代培养9代,未发生形态学改变,无衰老征象。第3代间充质干细胞体外可以分化为脂肪细胞和成骨细胞。提示采用淋巴细胞分离液密度梯度离心,贴壁培养和消化时间控制相结合,可以获得纯度较高的脐血间充质干细胞,脐血间充质干细胞体外增殖和传代能力强。     

体外培养人骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化及表皮细胞角蛋白的表达

背景：动物实验已经证实骨髓间充质干细胞体外诱导可分化为表皮细胞。 目的：观察体外培养条件下人骨髓间充质干细胞向表皮细胞的分化及表皮细胞角蛋白表达。   方法：采用Ficoll-Paque密度梯度离心法提取人胚胎骨髓间充质干细胞,以免疫细胞化学及流式细胞仪测定细胞表面CD33、CD34标记物进行鉴定。取第3代骨髓间充质干细胞以30%条件培养基诱导其向表皮细胞分化,免疫细胞化学染色观察诱导后细胞形态与细胞角蛋白水平变化。 结果与结论：采用密度梯度离心法从人胚胎骨髓中分离培养得到细胞成分均一的骨髓间充质干细胞。骨髓间充质干细胞经体外诱导后,出现细胞角蛋白19表达阳性细胞,说明骨髓间充质干细胞在体外诱导后可能发生向表皮细胞分化。     

与软骨细胞共培养和条件培养液诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的比较

背景：骨髓间充质干细胞体外转化很大程度上依赖于合适的培养条件。 目的：比较与软骨细胞共培养和条件培养液2种不同的诱导方案诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的特点。 方法：分离培养大鼠骨髓间充质干细胞和耳软骨细胞,采用骨髓间充质干细胞与软骨细胞共培养及条件培养液诱导成软骨的方法,诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。以MTT法及流式细胞仪检测细胞活性及周期,糖胺多糖、甲苯胺蓝以及免疫组化染色检测细胞生物学特性,以RT-PCR法检测诱导后的软骨细胞Ⅱ型胶原RNA表达情况。 结果与结论：采用共培养方式诱导的软骨细胞,其生物学特性与采用条件培养液诱导的软骨细胞相比,前者优于后者,如分泌糖胺多糖的能力以及基质分泌量均较高。提示共培养方式诱导的软骨细胞更接近正常软骨细胞,更有利于作为组织工程软骨的种子细胞。     

三维培养诱导人脂肪间充质干细胞微球的成软骨分化能力

背景：关节软骨损伤后修复结果不满意,需要新的手段,而脂肪间充质干细胞较适宜做种子细胞诱导软骨,然而怎么能够使诱导的软骨具有功能需要研究。 目的：采用三维培养体系诱导人脂肪间充质干细胞微球向软骨分化。 方法：无菌切取吸脂术后脂肪组织,分离培养人脂肪间充质干细胞,传至第3代进行流式细胞术分析,成骨成脂肪诱导等鉴定,同时也给予合适的培养条件用三维培养的方式向软骨细胞诱导,并行阿利辛蓝染色鉴定糖胺多糖的合成,苏木精-伊红染色进行组织学分析,免疫荧光检测Ⅱ型胶原表达,称质量测量软骨硬度。 结果与结论：分离的人脂肪间充质干细胞CD105,CD44,CD29均高表达,而 CD45,CD34低表达,并且成骨成脂诱导后细胞茜素红染色和油红O染色均为阳性。三维培养法诱导的软骨细胞可表达大量糖胺多糖及Ⅱ型胶原。结果证实,三维培养法诱导人脂肪间充质细胞向软骨分化后,具有软骨细胞的特性。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

自体激活富血小板血浆干预兔骨髓间充质干细胞体外成软骨分化的研究

背景：自体富血小板血浆激活后可释放多种生长因子,可以促进骨髓间充质干细胞的增殖与分化。 目的：观察自体激活富血小板血浆对体外培养的兔骨髓间充质干细胞向成软骨细胞分化的影响。 方法：取兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞;取第3代骨髓间充质干细胞,分别应用体积分数10%自体激活富血小板血浆和体积分数10%胎牛血清培养液进行体外培养,观察其向成软骨细胞分化情况。 结果与结论：分离培养的兔骨髓间充质干细胞呈长梭形,传代后细胞生长迅速。流式细胞仪检测发现第3代细胞高表达CD29、CD44,而低表达CD45。免疫荧光细胞化学染色显示经自体激活富血小板血浆诱导的骨髓间充质干细胞表达Ⅱ型胶原;实时荧光定量PCR检测发现经自体激活富血小板血浆诱导的骨髓间充质干细胞Ⅱ型胶原α1链基因和聚集蛋白聚糖基因表达明显高于经胎牛血清诱导的骨髓间充质干细胞(P < 0.01)。可见自体激活富血小板血浆具有促进兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞方向分化的潜能。     

兔骨髓间充质干细胞培养及向成软骨细胞的诱导分化

背景：骨髓间充质干细胞没有理想的特异性表面标志物,对其鉴定尚无统一标准,大多数鉴定依赖于其形态水平、功能特征及培养过程中出现的分化表型来协助鉴定。 目的：体外培养扩增、鉴定兔骨髓间充质干细胞,观察其诱导分化为成软骨细胞的可行性。 方法：密度梯度离心法提取兔骨髓间充质干细胞,采用倒置显微镜进行形态学观察;用含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养液培养细胞,每日定时进行细胞计数,观察细胞生长速度;采用流式细胞学方法分别检测原代及第3代细胞CD44、CD45、CD29的表达情况;取第3代生长良好的兔骨髓间充质干细胞,以特定培养液诱导(含体积分数为10%胎牛血清、转化生长因子1 10 μg/L、胰岛素样生长因子Ⅰ110 μg/L、转铁蛋白6.25 mg/L、地塞米松10 mmol/L、维生素C 0.05 mmol/L),倒置显微镜下观察形态变化,免疫组织化学检测软骨特异性Ⅱ型胶原的表达。 结果与结论：培养的细胞长梭形,呈成纤维细胞样生长,传代细胞生长迅速。流式结果表明,原代细胞有62.4%的细胞表达CD29,有60.3%的细胞表达CD44,有2.79%的细胞表达CD45,第3代有99.9%的细胞表达CD29,有99.6%的细胞表达CD44,有2.62%的细胞表达CD45。骨髓间充质干细胞诱导后体外扩增能力明显降低,诱导21 d后形态变化比较显著,Ⅱ型胶原阳性细胞较多。结果显示应用密度梯度离心法可成功分离并扩增骨髓间充质干细胞,第3代细胞纯度较高,在适当的条件下,具有分化为成软骨细胞的潜能。     

甲状腺素诱导人脐血间充质干细胞向软骨细胞分化中的作用

背景：研究发现共培养可诱导人源干细胞向特定细胞分化,但如何获得更多的组织工程所需的种子细胞是研究中的难题。 目的：探讨不同浓度甲状腺素在人脐血间充质干细胞向兔软骨细胞分化中的作用。 方法：将人脐血间充质干细胞与兔软骨细胞按照2∶1比例共培养,并用含有不同浓度甲状腺素(0,0.01,0.1,1,10 μmol/L)的培养基分组刺激,共培养14 d后分别观察各组细胞形态,并提取细胞RNA和蛋白质,Real-time PCR检测聚集蛋白多糖mRNA及Ⅱ型胶原mRNA表达量,Western blotting技术检测Ⅱ型胶原及聚集蛋白多糖蛋白表达水平。 结果与结论：加入0.01,0.1,1,10 μmol/L的甲状腺素干预后,聚集蛋白多糖、Ⅱ型胶原mRNA和蛋白的表达水平均随甲状腺素浓度增加而增强,与单纯共培养组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。实验证明高浓度甲状腺素可增强人脐血间充质干细胞与兔软骨细胞共培养后向软骨细胞分化的能力。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

Differentiation capacity of human chondrocytes embedded in alginate matrix

Healing capacity of cartilage is low. Thus, cartilage defects do not regenerate as hyaline but mostly as fibrous cartilage which is a major drawback since this tissue is not well adapted to the mechanical loading within the joint. During in vitro cultivation in monolayers, chondrocytes proliferate and de-differentiate to fibroblasts. In three-dimensional cell cultures, de-differentiated chondrocytes could re-differentiate toward the chondrogenic lineage and re-express the chondrogenic phenotype. The objective of this study was to characterize the mesenchymal stem cell (MSC) potential of human chondrocytes isolated from articular cartilage. Furthermore, the differentiation capacity of human chondrocytes in three-dimensional cell cultures was analyzed to target differentiation direction into hyaline cartilage. After isolation and cultivation of chondrogenic cells, the expression of the MSC-associated markers: cluster of differentiation (CD)166, CD44, CD105, and CD29 was performed by flow cytometry. The differentiation capacity of human chondrocytes was analyzed in alginate matrix cultured in Dulbecco?s modified eagle medium with (chondrogenic stimulation) and without (control) chondrogenic growth factors. Additionally, the expression of collagen type II, aggrecan, and glycosaminoglycans was determined. Cultivated chondrocytes showed an enhanced expression of the MSC-associated markers with increasing passages. After chondrogenic stimulation in alginate matrix, the chondrocytes revealed a significant increase of cell number compared with unstimulated cells. Further, a higher synthesis rate of glycosaminoglycans and a positive collagen type II and aggrecan immunostaining was detected in stimulated alginate beads. Human chondrocytes showed plasticity whilst cells were encapsulated in alginate and stimulated by growth factors. Stimulated cells demonstrated characteristics of chondrogenic re-differentiation due to collagen type II and aggrecan synthesis.     

TDP43慢病毒载体转染人脐带间充质干细胞与软骨细胞共培养后的增殖与凋亡

文题释义： TTDP43：一种高度保守、广泛表达的核蛋白,多功能地与DNA和RNA结合参与RNA转录、选择性剪接,并可调节细胞中mRNA的稳定性,可从细胞核到细胞质中形成泛素阳性包涵体,对肌萎缩侧索硬化症和额颞叶变性具有神经毒性。 RACK1：是G蛋白β亚基的同族体,一种胞浆内游离的支架蛋白,通过不同的WD40位点,结合、转运PKC到细胞内相应的位置,并使其保持活性状态;除可与细胞膜上活化的PKC结合发生反应外,还可结合多种胞浆蛋白或亚细胞结构,参与多条代谢通路,发挥不同的生理作用。 背景：在缺血缺氧条件下TDP43可能为MAPK信号通路关键的负调控因子,但其在骨性关节炎中对JNK及p38 MAPK信号通路的作用并不清楚。 目的：研究野生型TDP43介导骨性关节炎中软骨细胞病变的靶基因RACK1表达,分析其发挥应激作用的效应。 方法：以TDP43慢病毒载体转染人脐带间充质干细胞,分析其体外分化为软骨细胞的能力。将TDP43慢病毒转染脐带间充质干细胞、空载体慢病毒转染脐带间充质干细胞、未转染脐带间充质干细胞分别与人软骨细胞共培养12 d,倒置显微镜下观察软骨细胞形态变化;共培养第0,3,6,9,12天,分析软骨细胞增殖水平;共培养第3天,流式细胞仪检测软骨细胞凋亡率;共培养第3天,qRT-PCR检测软骨细胞内TDP43、RACK1、p38、JNK、AP-1和cl-xl的基因表达。 结果与结论：①TDP43慢病毒载体转染后,人脐带间充质干细胞可分化为软骨细胞;②与TDP43慢病毒转染脐带间充质干细胞共培养的软骨细胞形态发生显著改变,细胞变得粗大,并出现多个分枝情况;与空载体慢病毒转染脐带间充质干细胞、未转染脐带间充质干细胞共培养的软骨细胞形态未出现变化,呈梭形贴壁生长;③软骨细胞与TDP43慢病毒转染脐带间充质干细胞共培养后,促使软骨细胞凋亡而抑制了细胞增殖(P < 0.05);④软骨细胞与TDP43慢病毒转染脐带间充质干细胞共培养后,TDP43、RACK1、JNK、AP-1和Bcl-xl基因表达高于与未转染脐带间充质干细胞、空载体慢病毒转染脐带间充质干细胞共培养的软骨细胞(P < 0.05);⑤结果表明,软骨细胞高表达TDP43可激活RACK1的表达,进而调控软细胞增殖和凋亡。 ORCID: 0000-0002-4563-8652(黄永明) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞

目的:体外定向诱导成人骨髓间充质干细胞(MSC)分化为单一的软骨细胞,探索体外成软骨的必要条件。方法: 采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离骨髓,体外培养扩增,在较高的细胞密度下加入转化生长因子β1(TGF-β1),以微团培养(micromass culture)方式,诱导MSC分化为软骨细胞。HE染色观察细胞形态,阿新蓝、甲苯氨蓝染色检测软骨基质的分泌,免疫组织化学检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达。结果: HE染色呈典型的细胞性软骨结构;阿新蓝染色阳性、甲苯氨蓝异染性;Ⅱ型胶原免疫组织化学检测阳性。结论: 成人骨髓MSC在体外分化为单一的软骨细胞需要高细胞密度、诱导因子TGF-β1及合适的培养条件。     

采用组织贴壁法从整根脐带分离培养间充质干细胞及其生物学特性的研究

 为了建立从整根脐带中分离培养间充质干细胞(UC-MSCs)的技术,并对其生物学特性进行研究。采用组织贴壁法分离UC-MSCs, 并通过传代进行纯化和扩增培养, 绘制生长曲线：用流式细胞仪检测UC-MSCs表面抗原及细胞周期; 在特定诱导体系中,检测UC-MSCs向脂肪、成骨及软骨分化的能力;采用RT-PCR检测多能干细胞标志多能干细胞标志Oct4, Sox-2, Nanog mRNA水平。结果表明,　成功建立了UC-MSCs分离培养的方法;流式细胞仪检测结果显示, 贴壁细胞均表达CD73 、CD90 、CD105, 不表达造血细胞表型CD34、CD45 和HLA-DR ;细胞倍增时间为(24.04±0.49)h , 细胞周期分析表明,G0～G1 期和S+ G2 + M 期所占比例分别为81.56 %和18.44%;UC-MSCs能够向脂肪、成骨和软骨分化;表达Oct4, Sox-2, Nanog基因。结论：组织贴壁法是一种较好的分离培养UC-MSCs的方法,培养的细胞为具有增殖能力强和更原始间充质干细胞,为建立间充质干细胞库和临床应用提供了理论依据。     

人脐带间充质干细胞生物学特性及其研究进展

背景：人脐带间充质干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞,具有来源丰富,对供者无影响,易于采集和运输,无异体排斥反应,避免伦理争议等诸多优点。 目的：综述人脐带间充质干细胞的生物学特性及其应用进展。 方法：以“人脐带间充质干细胞,生物学特征,基因分析,诱导分化, human umbilical cord mesenchymal stem cells(hUMSCs),biocharacteristics, gene analysis,induce differentiation”为关键词应用计算机检索CNKI数据库、万方数据库、PubMed数据库文章。 结果与结论：人脐带间充质干细胞呈典型的成纤维状,其表达的表面标志抗原具有非单一性,高表达间质细胞标志、整合素受体,不表达造血系标志、协同刺激分子CD80、CD86 和CD40、人白细胞抗原HLA-DR,HLA-G,HLA-DP,HLA-DQ、内皮标志CD31或CD33、CD14、CD56等。人脐带间充质干细胞与造血干细胞和胚胎干细胞类似,在体外可以分化为骨细胞、软骨细胞、肝细胞、心肌细胞等;在体内可以分化为多巴胺能神经元、骨骼肌细胞、内皮细胞、胰岛细胞等。但人脐带间充质干细胞的研究仍存在亟需解决的问题,如分离方法、培养条件的规范化,如何控制其生长和分化等。     

Ultrastructural analysis of mouse embryonic stem cell-derived chondrocytes

Pluripotent embryonic stem (ES) cells cultivated as cellular aggregates, so called embryoid bodies (EBs), differentiate spontaneously into different cell types of all three germ layers in vitro resembling processes of cellular differentiation during embryonic development. Regarding chondrogenic differentiation, murine ES cells differentiate into progenitor cells, which form pre-cartilaginous condensations in the EB-outgrowths and express marker molecules characteristic for mesenchymal cell types such as Sox5 and Sox6. Later, mature chondrocytes appear which express collagen type II, and the collagen fibers show a typical morphology as demonstrated by electron-microscopical analysis. These mature chondrogenic cells are organized in cartilage nodules and produce large amounts of extracellular proteoglycans as revealed by staining with cupromeronic blue. Finally, cells organized in nodules express collagen type X, indicating the hypertrophic stage. In conclusion, differentiation of murine ES cells into chondrocytes proceeds from the undifferentiated stem cell via progenitor cells up to mature chondrogenic cells, which then undergo hypertrophy. Furthermore, because the ES-cell-derived chondrocytes did not express elastin, a marker for elastic cartilage tissue, we suggest the cartilage nodules to resemble hyaline cartilage tissue.