大鼠骨髓间充质干细胞转染GATA-4的表达及鉴定

目的基因修饰间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)是增加细胞抗缺氧的新方向。文中通过建立稳定的基因重构MSC细胞模型研究GATA-4转染骨髓MSC的特征及鉴定,为GATA-4修饰的MSC应用于急性心肌梗死等心肌疾病的治疗提供有效的技术手段。方法分离、培养及纯化新生大鼠MSC,用流式细胞仪进行鉴定。将培养第3代的MSC用pMSCV逆转录病毒表达系统转染GATA-4基因(MSCGATA-4),对照组为空质粒组(MSCNull)。用RT-PCR、Western blot印迹和免疫组化鉴定转染的效果。结果大鼠MSC表面抗原CD45和CD44表达阴性,CD31表达弱(<3%),CD90表达强阳性,其阳性率达95%。MSCGATA-4组GATA-4 mRNA和蛋白表达明显高于对照组MSCNull。MSCGATA-4组GATA-4和GFP都显示阳性,而对照组只表达GFP。结论 GATA-4成功转染到MSC,这将为研究GATA-4对MSC抗缺氧作用奠定基础。     

RNAi抑制MCF7细胞Lon基因后的生物学效应

目的 通过构建Lon基因表达下调的哺乳动物细胞模型,观察Lon基因对肿瘤细胞增殖及凋亡的影响.方法 设计针对Lon蛋白酶基因的小干扰RNA(siRNA),构建pSilencer U6 2.1-Lon真核表达载体,并用脂质体法转染人乳腺癌细胞MCF7.RT-PCR法检测Lon基因下调的水平,通过采用高温、紫外线照射、顺铂处理,观察Lon基因下调后细胞敏感性的变化(MTT法);流式细胞术检测siRNA诱导细胞凋亡的作用.结果 RT-PCR显示重组质粒pSilencer U62.1-Lon转染MCF7细胞后,Lon基因明显下调,RT-PCR未见扩增目的条带,细胞培养结果显示细胞增殖能力明显减弱.MTT结果显示,pSilencer U6 2.1-Lon转染的MCF7细胞经紫外线照射和顺铂处理后,增殖能力明显下降,与空载体转染组和未转染组相比有显著差异(P＜0.05).加热应激实验显示,41℃处理后,RNA干扰转染组(pSilencer U6 2.1-Lon)与空载体转染组(pSilencer U6 2.1)、未转染组相比有显著性差异(P＜0.05).而在43℃和45℃时,3组之间均无显著性差异(P＞0.05).流式细胞术检测pSilencer U6 2.1-Lon质粒组细胞凋亡率为(22.47±3.15)%,相对于空载体转染组的(2.3±0.9)%和无质粒转染组的(1.14±0.79)%有明显提高,而空载体转染组和无质粒转染组相比无明显差异.结论 RNAi能有效下调Lon蛋白的表达.Lon基因的下调可抑制乳腺癌细胞MCF7的增殖,诱导细胞凋亡,并可增加MCF7细胞对紫外线和顺铂的敏感性.     

shRNA干扰肾癌细胞株786-O和OS-RC-2中HIF-2α的表达对VEGF的影响

目的构建在哺乳动物细胞中表达的低氧诱导因子-2(HIF-2α)的短发夹RNA(shRNA)的表达质粒,在体外模拟肿瘤常氧和低氧环境下研究对血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。探讨HIF-2α、VEGF两者之间及其与肾透明细胞癌(CCRCC)的关系,HIF-2α可能为CCRCC潜在的新效靶。方法构建HIF-2α shRNA真核表达载体质粒, shRNA测序鉴定。150 umol/L氯化钴(Co Cl2)模拟细胞低氧环境。设对照组(空白、阴性)和实验组。空白对照组不做转染,阴性对照组转染空质粒,实验组转染HIF-2α shRNA重组质粒,每组均设置常氧和低氧环境组。采用Real time-PCR技术检测786-O和OS-RC-2细胞中HIF-2α基因表达情况,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western Blot检测VEGF蛋白表达情况。结果 DNA测序证实重组质粒构建成功, shRNA转染786-O和OS-RC-2细胞,实验组中HIF-2α mRNA表达明显受到抑制,且常氧较低氧环境下HIF-2α mRNA表达降低,低氧环境下凋亡显著;常氧和低氧环境下,实验组VEGF蛋白表达量均下降,且常氧环境下蛋白表达下降明显。结论低氧环境下,HIF-2α mRNA表达量升高,促进VEGF蛋白表达。干扰HIF-2α基因后,细胞凋亡率升高,抑制VEGF蛋白表达。该基因可能为治疗CCRCC提供了新的效靶,为下一步实验鉴定奠定基础。     

HepaCAM基因转染对膀胱癌BIU-87细胞株生长及血管内皮生长因子表达的影响

目的探讨外源性肝细胞黏附分子(hepatocyte cell adhesion molecule,hepaCAM)转染对人膀胱癌BIU-87细胞株生长及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factors,VEGF)表达的影响。方法使用脂质体2000转染法将携带野生型hepaCAM基因的质粒(pEGFPN2-hepaCAM)及空载质粒(pEGFPN2)转染人膀胱癌BIU-87细胞,建立稳定过表达hepaCAM基因的BIU-87细胞株。以转染空载质粒及未转染的BIU-87细胞株作为对照,采用MTT法检测各组细胞生长能力,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测hepaCAM、VEGF mRNA水平的变化,Western blot检测VEGF蛋白水平的变化。结果MTT实验示:hepaCAM基因转染(实验组)BIU-87细胞生长与空载体组和未处理组细胞比较明显受到抑制(P<0.05);hepaCAM基因在膀胱癌BIU-87细胞不表达,转染后hepaCAM mRNA明显增强(P<0.05);实验组VEGF mRNA表达(0.527±0.031)与未处理组(0.803±0.042)、空...     

bFGF基因体外转染兔骨髓间充质干细胞及对其增殖的影响

目的：观察bFGF基因体外转染兔骨髓间充质干细胞（bMSCs）后细胞目的基因的表达及对其增殖的影响。方法：将兔骨髓来源的间充质干细胞分离培养扩增,用PCR扩增法获得绿色荧光蛋白-bFGF基因重组质粒,转染间充质干细胞,用荧光显微镜观察转染后绿色荧光蛋白基因的表达,计算转染率,用MTT检测转染细胞的增殖特性。结果：实验成功地构建了绿色荧光蛋白-bFGF基因重组质粒,倒置荧光显微镜下观察到转染后的bMSCs发出稳定的绿色荧光信号,转染率为（43.32±4.51）%,MTT法显示重组质粒组增殖速度显著高于空白质粒组和未转染细胞组（P〈0.05）。结论：运用转染的方法实现了两种基因在MSCs中的共同表达,为监控MSCs细胞的转染和表达过程提供了一种手段。为后期利用MSCs细胞进行组织工程骨组织制造和移植提供了规范化的监控和程序化生产手段。     

NT4p53(C22)Ant重组腺伴病毒对人Miapaca-Ⅱ胰腺癌细胞的杀伤作用

目的: 研究NT4p53(C22)Ant重组腺伴病毒对人Miapaca-Ⅱ胰腺癌细胞杀伤作用. 方法: 构建NT4p53(C22)Ant,将其亚克隆于腺伴病毒载体中,经293细胞包装、扩增构成具有感染性的重组腺伴病毒AAV-NT4p53(C22)Ant,转染人胰腺癌Miapaca-Ⅱ细胞,经光镜下观察、MTT比色试验、PI染色实验及乳酸脱氢酶释放检测(LDH),观察AAV-NT4p53(C22)Ant对细胞的杀伤作用. 结果: 光镜下可见随AAV-NT4p53(C22)Ant感染Miapaca-Ⅱ细胞时间延长,肿瘤细胞数目明显减少;MTT实验检测发现细胞存活率明显降低(P＜0.05);流式细胞检测凋亡细胞数目较对照组及空病毒组增加(P＜0.05);LDH检测培养基中LDH只有轻度增加(P＞0.05). 结论: 重组腺伴病毒NT4p53(C22)Ant对胰腺癌细胞有杀伤作用,并且是通过引起细胞凋亡而实现的.     

血管内皮细胞生长因子基因在骨髓间充质干细胞中的表达

目的： 研究血管内皮细胞生长因血管内皮细胞生长因子基因在骨髓间充质干细胞中的表达子（VEGF）基因转染兔骨髓间充质干细胞（MSCs）后的表达和分泌情况,为构建一种血供丰富、成骨能力及骨块存活能力更强的组织工程化人工颅骨奠定实验室基础。方法： 应用基因重组技术,将VEGF165基因全长片段克隆于真核表达载体pcDNA3中,构建pcDNA3-VEGF165真核表达质粒;应用阳离子脂质体介导的基因转染技术,将pcDNA3-VEGF165真核表达质粒转染进入兔骨髓间充质干细胞中;利用RT-PCR及Western blotting方法检测VEGF基因在MSCs中的表达情况。结果： 构建的真核表达质粒-pcDNA3-VEGF165经双酶切后分别在5 400 bp和600 bp处出现条带,证实其构建成 功;成功进行了兔MSCs的原代及传代培养,并建立兔MSCs库,原代细胞初为淋巴细胞样小圆细胞,此后逐渐变为圆形、梭形或不规则形,而传代细胞则变为形态更均一、排列更有序的成纤维细胞样细胞;RT-PCR及Western blotting检测到瞬时转染后的细胞有VEGF mRNA及VEGF蛋白的表达。结论： pcDNA3-VEGF165真核表达质粒通过脂质体能够有效转染兔MSCs,转染后的细胞具有表达VEGF蛋白的能力。     

VEGF真核表达载体构建及其转染骨髓间充质干细胞的表达

目的 构建大鼠血管内皮细胞生长因子164（vascular endothelial growth factor,VEGF164）真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF164,观察大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)转染pcDNA3.1(-)/VEGF164基因后,外源性基因VEGF在蛋白水平的表达,为其在治疗肺组织损伤中的应用奠定基础。方法 应用DNA重组技术构建VEGF164真核表达载体并鉴定。采用脂质体介导的转染方法将pcDNA3.1(-)/VEGF164转染大鼠MSCs,并设立空质粒对照组（转染pcDNA3.1空载体）、脂质体对照组,用细胞免疫组化和Western blot检测大鼠MSCs 中VEGF164蛋白的表达情况。结果 重组质粒pcDNA3.1(-)/VEGF164测序结果与基因库(GENEBANK)中序列一致。细胞免疫组化检测显示pcDNA3.1(-)/VEGF164转染组MSCs中可见散在黄色颗粒,而空质粒对照组和脂质体对照组均未见明显黄色颗粒出现。Western blot检测pcDNA3.1(-)/VEGF164转染MSCs 72h后, 细胞裂解产物中VEGF含量明显高于空质粒对照组和脂质体对照组。结论 成功构建了大鼠VEGF164真核表达载体,实现VEGF164基因在大鼠MSCs的成功转染,并有外源性基因及蛋白的表达,具有促进肺组织损伤修复的应用前景。     

VEGF真核表达载体构建及其转染骨髓间充质干细胞并鉴定

目的 构建大鼠血管内皮细胞生长因子164（vascular endothelial growth factor,VEGF164）真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF164,观察大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)转染pcDNA3.1(-)/VEGF164基因后,外源性基因VEGF在蛋白水平的表达,为其在治疗肺组织损伤中的应用奠定基础。方法 应用DNA重组技术构建VEGF164真核表达载体并鉴定。采用脂质体介导的转染方法将pcDNA3.1(-)/VEGF164转染大鼠MSCs,并设立空质粒对照组（转染pcDNA3.1空载体）、脂质体对照组,用细胞免疫组化和Western blot检测大鼠MSCs 中VEGF164蛋白的表达情况。结果 重组质粒pcDNA3.1(-)/VEGF164测序结果与基因库(GENEBANK)中序列一致。细胞免疫组化检测显示pcDNA3.1(-)/VEGF164转染组MSCs中可见散在黄色颗粒,而空质粒对照组和脂质体对照组均未见明显黄色颗粒出现。Western blot检测pcDNA3.1(-)/VEGF164转染MSCs 72h后, 细胞裂解产物中VEGF含量明显高于空质粒对照组和脂质体对照组。结论 成功构建了大鼠VEGF164真核表达载体,实现VEGF164基因在大鼠MSCs的成功转染,并有外源性基因及蛋白的表达,具有促进肺组织损伤修复的应用前景。     

hBMP-4瞬时转染对兔骨髓基质干细胞生物学行为的影响

目的应用兔骨髓基质干细胞(bonemarrowstromalcells,MSCs)作为基因治疗的靶细胞,体外转染人骨形成蛋白4(humanbonemorphogeneticprotein-4,hBMP-4)基因,观察瞬时转染对兔MSCs生物学行为的影响。方法贴壁法培养兔MSCs,分别在体外转染pEGFP-hBMP-4和pEGFP基因并留置空白对照。检测转染效率及目的基因的转录和表达,观察细胞形态及生长情况,检测碱性磷酸酶、钙结节及骨钙素等成骨细胞表型。结果基因转染效率达到20%～30%,RT-PCR显示MSCs本身有目的基因的少量转录,转染pEGFP-hBMP-4后转录增强。目的基因转染后细胞形态略有变化,生长曲线与对照组相似,碱性磷酸酶阳性染色面积增加(P=0.0016),钙结节增多(P=0.0001),骨钙素表达增强(P=0.03)。结论优化的条件下取得了较高的转染效率,hBMP-4基因转染可以增强目的基因的转录,加速MSCs向成骨细胞表型转化。hBMP-4转染的MSCs可望成为组织工程化骨理想的种子细胞。     

犬骨髓间充质干细胞体外培养及诱导成软骨特性初步研究

目的：观察月龄、来源部位对犬骨髓MSCs体外增殖能力及成软骨细胞分化能力的影响，对软骨组织工程种子细胞的选择提供参考。方法：体外分离、培养4月龄、12月龄Beagle犬髂骨和胫骨骨髓中的MSCs，向软骨细胞诱导分化。依靠形态学观察、原代集落生成率、MTT法测生长曲线等方法观察各组MSCs的增殖能力，通过GAG含量、Ⅱ型胶原免疫组化比较诱导成软骨细胞效果。结果：4月龄犬髂骨与胫骨来源MSCs体外增殖特性及诱导成软骨细胞特性比较差异无统计学意义；12月龄犬髂骨组MSCs较胫骨组原代融合时间短、集落生成率高、生长曲线左移，但成软骨细胞特性无差异。相同部位比较，4月龄来源MSCs均较12月龄表现出较高的增殖能力和成软骨细胞分化能力，差异具有统计学意义。结论：成年犬不同部位来源MSCs增殖能力不同，分化能力相同；幼龄犬MSCs增殖、分化能力均高于成年犬。     

Notch-1在骨髓间质干细胞分化为神经细胞中的作用

目的:采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,抑制Notch-1基因的表达,从而观察Notch-1基因在骨髓间质干细胞(MSCs)分化为神经细胞后的存活及分化中的作用.方法:构建mNotch-l短发夹状RNA(short hairpin RNA,mNotch-1shRNA);然后对mNotch-lshRNA转染的MSCs进行形态学观察;MTT检测转染前、转染24h、转染3天的MSCs的存活率;体外条件下采用BDNF、全反式维甲酸等诱导mNotch-lshRNA转染的MSCs分化,采用免疫细胞化学染色,检测Nestin、NSE及NF200(神经元标记物)、GFAP(神经胶质细胞标记物)的表达.结果:mNotch-lshRNA转染成功的细胞立体感增强,Notch-1基因表达消失,转染后24h和3天的MSCs细胞存活率下降,与未转染和转染对照组比较有显著性差异(P＜0.01);转染mNotch-1shRNA的MSCs向神经细胞的分化效率显著提高,NSE、NF200的表达均高于未转染的和转染对照组的,且未见GFAP表达.结论:mNotch-lshRNA抑制Notch-1基因的表达,促进MSCs向神经细胞的分化效率,提示MSCs的横向分化过程可能与神经干细胞类似,阻断Notch信号通路,会加MSCs向神经细胞分化的效果.     

HIF-1对人宫颈癌SiHa细胞增殖和凋亡的影响

目的观察缺氧诱导因子1α(HIF-1α)在缺氧条件下对宫颈癌SiHa细胞的增殖、生长和凋亡的影响,探讨HIF-1α在宫颈癌的发展过程中所起的作用。方法将表达全长HIF-1α的重组质粒pcDNA3.1-full length HIF-1α和空质粒pcDNA3.1转染入SiHa细胞中,分别命名为fLHIF-1α组和pcDNA3.1组,未转染细胞组命名为未转染组。应用Western Blotting和免疫细胞化学法对细胞内的HIF-1α和VEGF表达量进行检测。应用MTT方法检测不同浓度的CoCl2处理后细胞的增殖情况;采用原位缺口末端标记(TUNEL)法检测细胞的凋亡情况。结果免疫细胞化学和Western Blotting结果显示重组质粒pcDNA3.1-full length HIF-1α转染成功,转染细胞内HIF-1α及VEGF表达较未转染细胞和质粒pcDNA3.1转染细胞增高(P<0.05),显示在正常或缺氧条件下,fLHIF-1α组细胞的增殖能力均高于pcDNA3.1组和未转染组(P<0.05),凋亡率小于pcDNA3.1组和未转染组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论HIF-1α在CoCl2诱导的缺氧条件下可以抑制SiHa细胞的凋亡,减少缺氧对细胞的损伤以及促进细胞的增殖,提示HIF-1α在宫颈癌的发生发展中可能起着重要作用。     

乏氧环境下骨骺干细胞株在软骨载体中的相容性、增殖和分化成软骨的实验研究

目的观察乏氧环境中转染PTHrP基因的骨骺干细胞株在不同浓度HIF-1作用下与组织工程软骨载体材料的相容性,以及在软骨载体材料中骨骺干细胞株的增殖、分化成软骨作用。方法乏氧环境中,携带骨骺干细胞株的软骨载体置于含不同浓度HIF-1(0、20、40、80、100、120、140及160 pmol/L)的培养诱导液中培养,MTT法检测骨骺干细胞在载体上的黏附率及骨骺干细胞增殖情况;骨骺干细胞经转化生长因子1(TGF-1)诱导2周后免疫组化检测Ⅱ型胶原(collagenⅡ)、Aggrecan软骨蛋白聚糖表达情况;诱导后的骨骺干细胞与载体复合培养后4周取材电镜下行组织学观察软骨结节形成情况。结果细胞在载体上黏附率90.5%;乏氧环境中HIF-1可促进骨骺干细胞增殖,增殖效应与HIF-1剂量有一定的依赖性;经TGF-1诱导2周后collagenⅡ、Aggrecan免疫组化染色阳性;诱导后的骨骺干细胞在载体内生长增殖良好,4周时可见新生类软骨样组织形成。结论乏氧环境下转染PTHrP基因的骨骺干细胞与载体具有良好的相容性;乏氧环境下HIF-1能促进骨骺干细胞株的增殖、分化成软骨,其促进作用有一定的剂量依赖性。     

COA:The proliferation and apoptosis property of MSCs derived from peripheral blood under the culture conditions of hypoxia and serum deprivation

Background We investigated the proliferation and apoptosis property of mesenchymal stem cells derived from peripheral blood (PB-MSCs) under hypoxia and serum deprivation conditions in vitro so as to evaluate the feasibility for autologous PB-MSCs applications in cartilage repair. Methods MSCs were mobilized into peripheral blood by Granulocyte Colony Stimulating Factor (GCSF) and AMD3100. The blood samples were collected from central ear artery of rabbits. Adhered cells were obtained by erythrocyte lysis buffer and identified as MSCs by adherence to plastic, spindle shaped morphology, specific surface markers, differentiation abilities into osteoblasts, adipocytes and chondroblasts in vitro under appropriate conditions. MSCs were cultured in four groups at different oxygen tension (20% O2 and 2% O2), with or without serum (10% FBS and 0% FBS) conditions: 20% O2 and 10% FBS complete medium (normal mediun, N), 20% O2 and serum deprivation medium (D), 2% O2 and 10% FBS complete medium (hypoxia, H), 2% O2 and serum deprivation (HD). Cell proliferation was determined by CCK-8 assay. Apoptosis was detected by Annexin V/PI and TUNEL staining. Results Spindle-shaped adherent cells were effectively mobilized from peripheral blood by a combined administration of GCSF plus AMD3100. These cells showed typical fibroblast-like phenotype similar to MSCs from bone marrow (BM-MSCs), and expressed a high level of typical MSC markers CD29 and CD44, but lacked in the expression of hematopoietic markers CD45 and MHC II. They could also differentiate into osteoblasts, adipocytes and chondroblasts in vitro under appropriate conditions. No significant morphological differences were found among the four groups. It was found that hypoxia could enhance proliferation of PB-MSCs regardless of serum concentration, but serum deprivation inhibited proliferation at the later stage of culture. Apart from that, hypoxia or serum deprivation could promote the apoptosis of PB-MSCs after 48 hours, the effect was stronger when these two conditions combined together. Furthermore, the effect of serum deprivation on apoptosis was stronger compared with that of hypoxia. Conclusions PB-MSCs possess similar phenotypes as BM-MSCs. Their differentiation and proliferation abilities make them a new source of seed cells for ischemia-related cell therapy and tissue engineering in the field of the articular cartilage repair.     

成人骨髓间充质干细胞体外培养方法的建立及生长特性分析

目的 建立成人骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MMSCs)体外分离培养和扩增方法,观察MMSCs在体外培养的生物学特性,为MMSCs的临床应用奠定技术基础.方法 采集成人骨髓,密度梯度法分离单个核细胞,利用DMEM/F12培养基添加自体血清进行黏附培养和扩增MMSCs,光镜观察MMSCs生长和形态变化,计数和MTT法观察原代和传代培养的增殖及生长特征,免疫组化法分析MMSCs纯度.结果 MMSCs贴壁生长,呈典型MMSCs形态和生长特征,原代及传代5代内的MMSCs均有活跃的增殖能力,其中CD105阳性细胞＞98%.结论 密度梯度离心结合贴壁培养法可获得高纯度和高增殖活性的MMSCs,成人MMSCs至少在传代培养5代内生长旺盛并维持其生物特性,可满足临床治疗和人体生物组织研究要求.     

Fth1基因标记对骨髓间充质干细胞生物学特性及体外MRI表现的影响

摘要 目的: 观察铁蛋白报告基因Fth1标记对骨髓间充质干细胞(MSCs)生物学特性的影响及体外MRI表现。方法：原代分离培养大鼠MSCs,构建携带铁蛋白重链基因Fth1的慢病毒载体,取第4代MSCs进行转染,并在培养基内加入柠檬酸铁进行培养。普鲁士蓝染色检测转染MSCs的摄铁能力,台盼蓝染色活细胞计数检测转染细胞的活力,CCK-8测定转染MSCs的增殖活性。应用MRI的FSE T2WI和SWAN序列观察转染MSCs和普通MSCs MRI信号的差异。结果：Fth1基因可成功转染MSCs,转染MSCs的普鲁士蓝染色标记效率为87%;未加含铁培养液的转染MSCs,活细胞比率为92.17±1.91,OD值为1.094±0.0682,与普通MSCs对照组比较差异均无统计学意义（P>0.05）,加入含铁培养液培养3天后的转染MSCs活细胞比率为77.47±4.10,OD值为0.4929 ±0.0239,与未加含铁培养液的标记MSCs及对照组比较差异均有统计学意义（P<0.05）;MRI扫描FSE T2WI和SWAN序列显示转染MSCs信号强度为847.1±10.54,与未加含铁培养液的转染MSCs及对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05),而未加含铁培养液的转染MSCs与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论：Fth1报告基因可成功转染MSCs、并高效表达与摄取铁,不影响细胞活力及增殖活性,但在铁浓度1mol/L含铁培养液中细胞活性受到一定影响;经含铁培养液培养5天后,MRI可体外检测标记MSCs,其FSE T2WI和SWAN序列呈低信号改变。     

银杏叶提取物不同剂型对神经元损伤后保护作用的比较研究

目的观察不同制剂工艺生产的两种剂型银杏叶提取物（EGB）对神经元缺氧／复氧损伤的保护作用,探讨EGB在缺血性脑血管疾病中的应用价值,寻求最佳给药途径。方法原代培养新生SD大鼠皮层神经元,建立缺氧／复氧损伤模型。将细胞分为以下6组：正常培养组、缺氧／复氧组、EGB761低剂量组、EGB761高剂量组、EGB1212低剂量组和EGB1212高剂量组。后4组分别在神经损伤前24h给予相应药物处理,采用M丌法测定细胞存活率,乳酸脱氢酶（LDH）释放测定检测细胞毒作用,并观察神经元形态变化。结果缺氧／复氧损伤造成神经元细胞形态的改变,表现为轴突断裂、核固缩、细胞水肿。EGB761和EGB1212预处理可减轻神经元形态学改变。EGB761及EGB1212干预均能提高细胞存活率,减少LDH释放。且呈剂量依赖性。同等剂量下EGB1212对神经元的保护作用优于EGB761（P〈0．05）。结论EGB对缺氧／复氧造成的神经元损害有保护作用,新工艺剂型EGB1212比传统剂型EGB761保护作用更为突出。     

低氧预处理对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖、凋亡和坏死的影响

 目的 探讨低氧预处理对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖、凋亡和坏死的影响及其可能机制。方法 采用全骨髓细胞贴壁法分离培养BMSCs,通过细胞成脂、成骨分化诱导及流式细胞仪检测其表面标志物(CD29、CD90、CD45)鉴定BMSCs;运用siRNA干扰技术沉默低氧诱导因子 1α(hypoxia inducible factor,HIF 1α)基因。将细胞分成6组:正常培养组、正常培养+转染阴性对照组、正常培养+HIF 1α RNA干扰组、低氧预处理组、低氧培养+转染阴性对照组及低氧培养+HIF 1α RNA干扰组,分别采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法、流式细胞仪和乳酸脱氢酶(lactic acid dehydrogenase,LDH)活力测定等方法,检测各组BMSCs的增殖、凋亡和坏死情况;Western blot和real time PCR 检测各组BMSCs中HIF 1α、葡萄糖转运子 1(glucose transporter,GLUT 1)及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的mRNA和蛋白的表达。 结果 培养的BMSCs具有成脂、成骨等多向分化潜能;流式检测呈现CD29和CD90高表达,CD45低表达;低氧预处理可促进BMSCs增殖,减轻坏死,对细胞凋亡无明显影响;低氧预处理组HIF 1α、GLUT 1及VEGF的蛋白及mRNA表达明显高于常氧培养组(P<0.05);给予低氧预处理组siRNA HIF 1α后其HIF 1α、GLUT 1及VEGF的蛋白及mRNA表达均明显低于未干扰前(P<0.05),且细胞增殖受抑制,细胞凋亡和坏死加重(与未干扰前相比,P<0.05)。 结论 低氧预处理可促进BMSCs的体外增殖,减轻坏死,其机制可能与低氧预处理后HIF 1α表达增加及上调其下游基因GLUT 1和VEGF表达有关。     

α-硫辛酸对H9 c2心肌细胞低氧及低氧/复氧损伤的保护作用及其机制探讨

目的：探讨α-硫辛酸(α-LA)对H9c2心肌细胞低氧及低氧/复氧损伤的保护作用及其作用机制。方法研究包括H9 c2心肌细胞低氧实验和低氧/复氧实验两部分,分成常氧组、低氧组或低氧/复氧组、LA组、乙醛脱氢酶抑制剂异黄酮苷(Daidzin)组(Daidzin组)、二甲亚砜(DMSO)溶剂对照组( DMSO组)。采用噻唑蓝( MTT)比色法检测心肌细胞存活率;微量酶标法测定乳酸脱氢酶( LDH)活性;ELISA法检测心肌细胞乙醛脱氢酶2(ALDH2)活性;硫代苯巴比妥酸法检测丙二醛( MDA)水平。结果与常氧组比较,低氧组及低氧/复氧组细胞存活率均下降(P<0．01),LDH活性及MDA含量均升高(P<0．01);与低氧组或低氧/复氧组比较, LA组细胞存活率上升( P <0．01)、ALDH2活性增加( P <0．05)、LDH活性及MDA含量降低(P<0．01);LA组、Daid-zin组、DMSO组3组比较, LA组与DMSO组间存活率、AL-DH2、LDH、MDA比较差异均无统计学意义( P>0．05);Daid-zin组与LA组、DMSO组比较,细胞存活率及ALDH2活性降低(P<0．05),LDH活性及MDA含量升高(P<0．05),差异均有统计学意义( P<0．05)。结论α-LA可通过上调AL-DH2活性并减少过氧化终产物形成,最终减轻心肌细胞低氧及低氧/复氧过程中的氧化损伤。