心脏脱细胞支架的制备及其生物相容性

目的:优化心脏脱细胞支架的制备方法,评价所制备的脱细胞支架的基本生物学特征。方法:联合应用十二烷基硫酸钠(SDS)和聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)对大鼠心行逆行主动脉灌流制备心脏脱细胞支架。同时,将间充质干细胞(MSCs)接种到支架上构建细胞支架复合体,采用H-E染色及扫描电镜分别对制备支架及复合体进行评价。结果:心脏脱细胞支架大体呈半透明囊状。组织学染色及扫描电镜观察示支架呈多孔网状或束状结构,未见细胞核残留。荧光显微镜观察示MSCs沿支架纤维黏附生长,未见明显坏死细胞。结论:本研究运用灌流法成功制备脱细胞彻底且细胞外基质保留较完整的心脏脱细胞支架,既拥有天然三维结构且具有良好的生物相容性。     

骨髓间充质干细胞与膀胱脱细胞基质支架的生物相容性

背景：国内外许多研究者一直寻找理想的种子细胞与合适的支架材料复合,试图模拟接近正常生理功能的组织工程化尿路替代物。 目的：探讨骨髓间充质干细胞与兔膀胱脱细胞基质支架的生物相容性。 方法：采用密度梯度离心法分离培养兔骨髓间充质干细胞,将第3代兔骨髓间充质干细胞接种到兔膀胱脱细胞基质上进行复合培养,每天进行细胞计数,连续12 d,绘制细胞生长曲线,以单独培养骨髓间充质干细胞为对照组。 结果与结论：骨髓间充质干细胞成功种植到膀胱脱细胞基质上,倒置显微镜下可见骨髓间充质干细胞从膀胱脱细胞基质边缘爬出,膀胱脱细胞基质周围有大量长梭形骨髓间充质干细胞生长。接种5 d内,两组细胞均呈现出平缓生长的状态,接种6-9 d,生长曲线逐渐变得陡峭,细胞呈倍数状态进行分裂生长,速度较快,接种10-12 d,再次趋于平缓状态。两组细胞生长曲线基本重合,可推断兔骨髓间充质干细胞与膀胱脱细胞基质生物相容性良好。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

不同方法制备脱细胞猪主动脉瓣膜支架的组织结构

背景：理想的脱细胞方法要求既能完全去除供体细胞,降低免疫原性,又能保留天然瓣膜的胶原纤维、弹力纤维等细胞外基质成分,以保持足够的机械强度。 目的：采用不同洗剂制备脱细胞猪主动脉瓣膜支架,对比其组织结构,探讨最为有效的脱细胞瓣膜支架制备方法。 方法：20个新鲜猪主动脉瓣膜随机分为新鲜对照组、去污剂组、酶消化组和去污剂-酶消化组,后3组分别使用Triton X-100、胰蛋白酶以及二者联合的方法制备脱细胞瓣膜支架,对比支架大体形态、苏木精-伊红染色、Mallory-Heidenhain染色和电镜下超微结构的不同。 结果与结论：经脱细胞处理后,去污剂组瓣叶柔软、光滑,苏木精-伊红染色少量核物质存留、纤维排列规整,Mallory-Heidenhain染色胶原纤维和弹性纤维相交错,电镜下呈波浪状排列、原纤维横纹清楚;酶消化组瓣叶局部塌陷,苏木精伊红染色细胞完全去除、纤维排列较紊乱,Mallory-Heidenhain染色胶原纤维和弹性纤维呈网状排列,电镜下纤维部分断裂、原纤维横纹存在;去污剂-酶消化组瓣叶柔软、光滑,苏木精伊红染色细胞完全去除、纤维完整,Mallory-Heidenhain染色胶原纤维和弹性纤维平行排列,电镜下纤维完好,但排列稀疏,原纤维横纹清晰。说明3种方法均可有效去除供体细胞,保持纤维结构相对完整,在完全清除供体细胞并保持纤维支架完整性方面,Triton X-100联合胰蛋白酶的方法更为有效。     

兔骨髓间充质干细胞与异体脱细胞耳软骨支架的体外复合*

背景：耳软骨作为脱细胞基质可选择的支架,进行脱细胞处理可去除了软骨细胞的抗原性,从而与种子细胞具有良好的相容性。 目的：体外提取、培养兔骨髓基质干细胞,并与异体脱细胞耳软骨支架复合,观察其生物相容性。 方法：提取兔骨髓间充质干细胞行体外培养,诱导为软骨细胞,以胰蛋白酶-曲拉通联合法获得脱细胞软骨支架,将两者于体外复合,10 d后复合支架固定行组织学染色及扫描电镜观察。 结果与结论：兔骨髓间充质干细胞体外诱导14 d可形成软骨细胞,Ⅱ型胶原免疫细胞化学示胞浆呈棕黄色;兔耳软骨脱细胞基质呈乳白色,组织学染色及扫描电镜观察示经脱细胞后支架孔隙均匀,结构完整,仍保存大量酸性黏多糖及胶原成分。其孔径长度(33.70±4.33) μm,孔隙率(65.23±7.35)%。 复合支架组织学染色及扫描电镜示两者黏附良好,并伴有多量基质分泌。说明兔骨髓间充质干细胞诱导为软骨细胞与异体脱细胞耳软骨有良好的生物相容性。     

脱细胞随机肌腱支架促进骨髓间充质干细胞骨向分化

目的:探究随机肌腱细胞外基质(ECM)支架对骨髓间充质干细胞(BMSCs)活力和分化的影响。方法:从Sprague-Dawley大鼠股骨和胫骨中提取BMSCs,体外培养,观察细胞形态,并利用流式细胞术鉴定细胞干性。采用1%Triton X-100和DNase/RNase混合液对鼠尾肌腱进行脱细胞处理,利用HE染色和DNA含量测定考察肌腱组织中细胞核残余情况。制备胶原纤维随机排列的肌腱ECM支架,培养BMSCs,以孔板中生长的细胞为对照组,利用Live/Dead染色和CCK8法考察细胞的活力和形态;利用RT-qPCR检测肌腱标志物I型胶原蛋白(Col I)、肌腱特异转录因子scleraxis(SCX)及成骨标志物碱性磷酸酶(ALP)和Runt相关转录因子2(RUNX2)的表达水平。结果:HE染色结果显示,经过脱细胞处理后肌腱组织内无细胞残余,且DNA含量从(481. 7±15. 8)μg/g显著性降至(31. 0±3. 8)μg/g(P<0. 05),脱细胞处理成功。7 d时,种植在支架上的BMSCs的活力较对照组显著增强(P<0. 05);14 d时,种植在支架上的BMSC...     

静态与动态下脱细胞猪主动脉瓣种植人成纤维细胞初步研究

目的 探索在脱细胞猪主动脉瓣膜材料上种植人成纤维细胞的方法与效果；材料和方法 采用在脱细胞猪主动脉瓣膜材料上静态与动态种植人成纤维细胞，并对其结果进行比较研究。结果 静态种植不能在猪主动脉瓣叶的两侧形成完整的单层人成纤维细胞融合层；而经过动态种植，在一定条件下可以在猪主动脉瓣叶两侧形成完整的单层人成纤维细胞融合层；结论 动态种植较之静态种植易达到形成完整均匀的细胞种植效果。     

骨髓间充质干细胞-脱细胞真皮基质对大鼠表皮缺损的修复

目的研究骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)-脱细胞真皮基质(acellular dermal matrix,ADM)对SD大鼠皮肤表皮缺损的修复。方法培养SD大鼠骨髓细胞,增殖提纯传代至4代时,成骨成脂,流式细胞仪检测鉴定BMSC,然后将其接种到ADM,2d后移植到皮肤表皮缺损的SD大鼠体内,连续5周观察其修复效果。结果 BMSC-ADM修复SD大鼠皮肤表皮缺损效果良好,5周后,肉眼可见材料与组织结合紧密,有弹性,颜色接近皮肤。结论 BMSC-ADM可以作为修复SD大鼠皮肤表皮缺损的组织工程材料。     

脱细胞胶原基质双层材料与骨髓间充质干细胞的生物相容性研究

目的 对脱细胞胶原基质双层材料和骨髓间充质干细胞（BMSCs）间的生物相容性进行研究.方法 将BMSCs与脱细胞胶原基质双层材料共培养作为实验组,单独培养的BMSCs为对照组,对BMSCs的生长和增殖情况进行研究,扫描电镜下观察细胞在材料上的贴附生长情况,并采用CCK-8法测定细胞活性.结果 扫描电镜结果显示BMSCs在脱细胞胶原基质双层材料上生长良好.CCK-8法测得的BMSCs与脱细胞胶原基质双层材料共培养的生长曲线显示,实验组与对照组间差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 脱细胞胶原基质双层材料具有较好的生物相容性,这为脱细胞胶原基质组织工程支架双层材料下阶段在体内动物中的应用提供了科学依据.     

骨髓间充质干细胞-海螵蛸复合支架的细胞毒性评估

文题释义：骨髓间充质干细胞复合海螵蛸支架：以中药海螵蛸为载体支架,骨髓间充质干细胞为种子细胞,二者共同培养构建复合生物支架,经过各项生物安全性测评后应用于骨缺损的治疗。制作过程为：选用第3代骨髓间充质干细胞,经0.25%胰酶消化制成细胞悬液,将细胞浓度调整为5×10⁸ L^-1,用移液枪将骨髓间充质干细胞悬液缓慢逐滴滴加于24孔板中的海螵蛸上,200 μL/孔,分2次缓慢接种,尽量不使细胞从材料上溢出,置于培养箱中培养4 h,待细胞充分黏附于海螵蛸支架材料后,缓慢逐滴加入培养液700 μL,将支架与细胞复合培养8 d,两三天换液1次。细胞毒性评估：是采用受试物与细胞共同培养的方法,对样品进行毒理学风险评估。生物材料应用于体内后,可能与体内细胞的细胞膜、细胞器、蛋白质合成、DNA合成等相互作用,产生细胞毒性。根据ISO10993-5标准,在复合支架应用于临床治疗前,需通过复合材料浸提液试验以测定其对细胞活性、功能、遗传的影响。  摘要背景：作为骨组织工程的修复材料,应具有良好的生物相容性及降解吸收性,许多学者在此方面也做了较深入的研究,但中药复合细胞生物支架的研究较少。目的：参照《医疗器械生物学评价标准》,对兔骨髓间充质干细胞-海螵蛸生物复合支架进行体外细胞毒性检测,评估复合支架的毒性等级,为临床应用生物支架提供实验依据。方法：依照ISO标准按“材料面积∶浸提介质体积=3-6 cm²∶1 mL”制作骨髓间充质干细胞-海螵蛸生物复合支架材料浸提液。制备L-929细胞悬液,将细胞浓度调整至1×10⁷ L^-1进行接种培养,设置阳性对照组(含苯酚的DMEM培养液)、实验组(材料浸提液)、阴性对照组(新鲜DMEM培养液)。培养24,48,72 h采用MTT法检测L-929细胞吸光度值,计算各组细胞的相对增殖率,评估复合支架毒性等级。结果与结论：实验组、阴性对照组、阳性对照组吸光度值在不同时间点不完全相同(P=0.000 < 0.01),各时间点内比较,实验组与阴性对照组吸光度值均明显高于阳性对照组(P < 0.01);兔骨髓间充质干细胞-海螵蛸生物支架细胞毒性为1级。结果说明兔骨髓间充质干细胞-海螵蛸生物支架无明显毒性作用,符合生物材料应用要求。  ORCID: 0000-0002-0003-6228(彭雅) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

物理联合化学或化学方法处理去抗原异种松质骨支架与骨髓间充质干细胞的细胞相容性**

背景：研究证明去抗原异种松质骨支架具有良好的理化性能和三维立体多孔结构,但应用于临床还需要考虑其安全性和生物相容性。 目的：比较物理联合化学及化学方法处理去抗原异种松质骨支架与羊骨髓间充质干细胞的细胞相容性。 方法：用梯度密度离心法分离培养羊骨髓间充质干细胞,四甲基偶氮唑盐比色法检测物理联合化学及化学方法处理去抗原异种松质骨支架材料对骨髓间充质干细胞增殖的影响。取第3代骨髓间充质干细胞,接种在两种支架上共同培养,倒置相差显微镜和扫描电镜观察细胞在两种支架材料上的形态、黏附、生长和增殖情况。 结果与结论：物理联合化学组细胞毒性为0或1级,细胞能在材料上良好地黏附、增殖、生长,细胞活性未受到支架材料的影响。化学组细胞毒性为3级,细胞在材料上生长受到抑制,支架孔隙内无细胞黏附。提示经过物理联合化学处理的去抗原异种松质骨支架材料与羊骨髓间充质干细胞具有良好的生物相容性;单纯经过化学处理的支架材料生物相容性较差,不符合生物材料安全性标准。     

脂肪间充质干细胞分化为内皮细胞并体外构建组织工程心脏瓣膜

背景：组织工程心脏瓣膜是利用组织工程技术将种子细胞种植于瓣膜支架上所构建的一种人工瓣膜,目前国内外研究主要集中于种子细胞来源及支架选择上。 目的：探讨人脂肪间充质干细胞体外向内皮细胞诱导分化后的细胞作为种子细胞,脱细胞猪主动脉瓣膜作为支架体外构建组织工程心脏瓣膜的可行性。 方法：利用吸脂术采集脂肪组织,分离、培养脂肪间充质干细胞,流式细胞仪鉴定细胞表型;免疫细胞化学方法及RT-PCR检测细胞分化标志物;应用Triton X-100联合胰蛋白酶的方法制备脱细胞猪主动脉瓣支架,将体外培养扩增的诱导分化后的内皮细胞种植于支架上构建组织工程心脏瓣膜,光镜及电镜下观察组织工程心脏瓣膜的组织学结构。 结果与结论：脂肪组织分离培养的脂肪间充质干细胞向内皮细胞诱导分化后表达CD31、CD34、CD144、Ⅷ因子和内皮型一氧化氮合成酶等内皮细胞特异性抗原;脱细胞猪主动脉瓣膜支架脱细胞完全,弹力纤维及胶原纤维保持完整;构建的组织工程心脏瓣膜可见支架上排列连续的单细胞层。提示脂肪间充质干细胞在体外向内皮细胞诱导分化后已初步具有内皮细胞功能,在脱细胞猪主动脉瓣膜支架上生长良好,可以在体外初步构建组织工程心脏瓣膜。     

组织工程心脏瓣膜的构建：现状与前景

背景：目前临床上应用的心脏生物瓣和机械瓣都存在一些缺陷和不足,而组织工程心脏瓣膜有可能避免这些问题的出现,成为瓣膜替代物的理想选择。 目的：探讨构建组织工程心脏瓣膜的实验研究进展。 方法：应用数据库检索的方法分析关于组织工程心脏瓣膜的实验研究文献,组织工程心脏瓣膜的三大要素为种子细胞、支架材料和细胞种植。 结果与结论：心脏瓣膜修复和置换是目前治疗心脏瓣膜性疾病的主要外科手段。目前,主要用于构建组织工程心脏瓣膜的种子细胞有血管内皮细胞、内皮祖细胞以及骨髓间充质干细胞等。经脱细胞处理的支架具有良好的生物力学性能和组织相容性,细胞种植后支架表面会形成一层连续的细胞层,其构建的组织工程心脏瓣膜是可行的。组织工程心脏瓣膜有着良好的应用前景,但目前还有很多问题需要解决,还处于研究的初级阶段。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

骨髓基质干细胞复合煅烧骨的皮下成骨

背景：研究证明骨髓基质干细胞与煅烧骨支架材料结合后可形成组织工程化骨,但在动物体内的生物相容性及皮下诱导成骨的能力国内报道较少。 目的：观察骨髓基质细胞复合异种煅烧骨植入BALB/c裸鼠背部皮下的成骨性能及煅烧骨材料作为组织工程骨支架材料的可行性。 方法：选用经脱脂及脱蛋白处理后高温煅烧形成的骨支架材料与梯度密度离心法分离培养至第3代的羊骨髓基质干细胞构建细胞-煅烧骨复合物植入BALB/c裸鼠背部皮下,选同期对侧背部皮下植入单纯煅烧骨为对照组。 结果与结论：煅烧后的松质骨块为白垩色,表面呈蜂窝状多孔结构,保留了天然松质骨的多孔状空间结构。骨小梁结构完整,孔隙相互连通。骨髓基质干细胞接种到煅烧骨后24 h可见大量细胞黏附于支架上,7 d后细胞分泌大量细胞外基质,细胞与基质分界不清,细胞能在材料上良好地黏附、增殖与生长,细胞活性未受到支架材料的影响。植入4周后,两组均可见煅烧骨边缘出现少量残片,细胞-煅烧骨复合物组煅烧骨孔隙周边可发现骨细胞,对照组煅烧骨表面可见纤维结缔组织包绕。植入后8周,两组均可见到煅烧骨部分降解为片状类骨质,周围有成纤维细胞包绕,排列紧密,形态多样,细胞-煅烧骨复合物组煅烧骨孔隙内可见煅烧骨表面有排列成行的成骨细胞,孔隙间有散在淋巴细胞浸润。对照组标本可见孔隙内有大量结缔组织长入,未见明显成骨迹象。结果说明,经高温煅烧后的松质骨材料,具有良好的生物相容性和生物安全性,可作为骨髓基质干细胞的良好载体,复合后植入体内能够诱导新生骨组织形成,可作为骨缺损组织工程修复的支架材料。     

脱细胞猪主动脉瓣叶的生物力学特性和免疫反应性

目的：探讨脱细胞猪主动脉瓣叶构建组织工程心脏瓣膜支架的可行性。方法：经胰酶-EDTA、表面活性剂、核酸酶处理，去除瓣叶的细胞成分，测定脱细胞瓣叶的生物力学特性，同时行大鼠皮下包埋实验，观察其免疫反应性。结果：瓣叶中的细胞成分能完全去除，获得无细胞的纤维网状支架。脱细胞瓣叶与新鲜瓣叶有基本相同的应力-应变曲线及应力-松弛曲线，而弹性模量、面积比、松弛强度、断裂强度和断裂伸长率两者无显著差异。脱细胞瓣叶的免疫反应性明显降低。结论：猪主动脉瓣叶经脱细胞处理后可以作为组织工程心脏瓣膜的支架材料。     

Enhancement of mesenchymal stem cell attachment to decellularized porcine aortic valve scaffold by in vitro coating with antibody against CD90: a preliminary study on antibody-modified tissue-engineered heart valve

The importance of cell adhesion to the scaffold in the tissue-engineered heart valve remains to be determined. The current study examined the feasibility of conjugating antibody against CD90 to a decellularized porcine aortic valve scaffold and binding mesenchymal stem cells to that scaffold through interaction with a cell surface antigen. After decellularization, the porcine aortic valve was reacted with biotin, avidin, and biotinylated anti-rat CD90 antibody sequentially and inserted into a laminar flow system used to test the effect of laminar shear stress. Rat bone mesenchymal stem cells (BMSC) were injected and circulated in a flow system to study the ability of anti-CD90 antibody to trap and immobilize cells on the valve surface. The results demonstrated that anti-CD90 antibody on the valve surface remains bound, even under high shear conditions. Compared with the control valve (no antibody), the modified (antibody-coated) valve immobilized significantly more rat BMSC (p < 0.05). Thus, the avidin-biotin system can be used to attach anti-CD90 antibody to these valves, and the bound antibody can immobilize rat BMSC in a flow chamber, suggesting that antibody-modified scaffolds might be used to fabricate shear stress-resistant, tissue-engineered heart valves.     

心脏瓣膜组织工程支架的制备及细胞种植

为了探讨心脏瓣膜组织工程支架的制备及细胞种植 ,我们将新鲜猪心瓣膜用胰蛋白酶及 DNA酶消化去除细胞 ,光镜和电镜观察其结构 ,并将人脐静脉内皮细胞株、猪颈动脉内皮细胞和狗肌成纤维细胞滴种在脱细胞猪心瓣膜上 ,HE和免疫组化染色观察。结果显示胰蛋白酶联合 DNA酶消化去除了所有细胞 ,而瓣膜的三维结构保持完好。种植的人内皮细胞几乎完全覆盖了瓣膜的表面 ,猪内皮细胞在瓣膜上呈斑块状生长 ,狗肌成纤维细胞不但生长于瓣膜表面 ,且渗透到基质内部生长。这表明 ,胰蛋白酶联合 DNA酶消化是一种较为理想的猪瓣膜脱细胞方法 ;人和猪血管内皮细胞及狗肌成纤维细胞均能在猪瓣膜支架上较好地黏附和生长。     

体外构建人工仿生骨膜

背景：小肠黏膜下层既具有良好的生物相容性和降解性,又富含多种生长因子,能明显促进细胞的黏附、增殖及分化,在国外已被广泛应用于骨与软骨、血管、皮肤、膀胱、平滑肌及胰岛等组织的修复,且已表现出良好的组织工程化细胞支架性能。 目的：探讨兔骨髓间充质干细胞经体外诱导成成骨细胞与猪小肠黏膜下层复合构建组织工程骨膜的可行性。 方法：采用贴壁筛选法分离2周龄健康新西兰大白兔骨髓间充质干细胞,并进行体外扩增培养、诱导分化及鉴定。将经成骨诱导分化的骨髓间充质干细胞与猪小肠黏膜下层复合构建组织工程骨膜,观察细胞在生物材料上的附着、生长、增殖情况。 结果与结论：接种5 d后,细胞散在附着于小肠黏膜下层材料上,细胞形态呈圆形,细胞之间无连接;10 d后细胞之间形成桥粒连接,成骨细胞伸出突起,与小肠黏膜下层贴附;15 d后细胞增殖,分泌基质,在小肠黏膜下层表面形成多层细胞组成的复层膜样结构。表明将骨髓间充质干细胞诱导成成骨细胞后与猪小肠黏膜下层复合可构建组织工程骨膜,有可能成为理想的组织工程支架材料。     

基因转染脐带间充质干细胞与丝素蛋白构建组织工程脂肪

背景：目前国内外构建组织工程脂肪的方法并不完善,虽然构建出了脂肪,但效果不理想。 目的：探讨一种新的构建组织工程脂肪的方法,观察携带重组人胰岛素基因慢病毒载体转染的人脐带间充质干细胞与丝素蛋白复合后在Wistar大鼠体内构建组织工程脂肪的能力。 方法：分离培养人脐带间充质干细胞,将携带重组人胰岛素基因慢病毒载体以最适MOI=10转染人脐带间充质干细胞,将转染组与未转染组(对照组)的人脐带间充质干细胞分别接种于丝素蛋白支架,移植于Wistar大鼠背部皮下。移植后12周取材,行荧光原位杂交技术鉴定、组织形态学和扫描电镜观察。 结果与结论：①油红O染色显示,两组移植物均呈阳性,证明移植物已在体内合成为脂肪组织,转染组脂肪样细胞数量明显高于对照组(P < 0.01)。②苏木精-伊红染色显示,两组移植物组织结构与正常脂肪组织相似,可见明显新生血管。转染组支架材料降解明显,炎性细胞浸润明显少于对照组,新生血管数量也多于对照组。③扫描电镜观察提示,转染组移植物内脂肪样细胞聚集成团,其结构与正常脂肪组织相似;对照组脂肪样细胞散在分布于支架孔隙内。④提示胰岛素基因能明显促进人脐带间充质干细胞成脂肪化,携带重组人胰岛素基因慢病毒载体转染的人脐带间充质干细胞与丝素蛋白支架复合后,在Wistar大鼠体内能构建出组织工程化脂肪组织,其结构类似正常脂肪组织。     

骨形态发生蛋白12诱导骨髓间充质干细胞构建组织工程肌腱

背景：以往肌腱损伤的修复方法有端端吻合、自体肌腱移植、同种异体肌腱或人工肌腱移植等,但均有其各自缺点。 目的：探讨以家兔骨髓间充质干细胞为种子细胞,骨形态发生蛋白12诱导,聚羟基乙酸复合材料作为支架材料,预构组织工程化肌腱重建家兔跟腱缺损的可能性。 方法：家兔抽取股骨近端骨髓,分离所得细胞传代至第2代,加入10 μg/L骨形态发生蛋白12诱导分化,并与Ⅰ型胶原溶液按一定比例移植于预张的聚羟基乙酸缝线上预制组织工程化肌腱备用。将家兔制备成跟腱缺损模型,分别采用不同方法修复跟腱缺损：组织工程化肌腱修复,Ⅰ型胶原-聚羟基乙酸缝线修复,丝线行端端修复。修复12周对各组肌腱行形态学、力学及组织病理学观察。 结果与结论：修复12周家兔肌腱组织病理切片：组织工程化肌腱组可见大量梭形纤维母细胞顺应力学方向排列均匀分布于胶原中,纤维细胞明显增多,胶原致密;Ⅰ型胶原-聚羟基乙酸缝线组可见部分纤维组织增生伴少许肉芽组织形成,胶原纤维呈松散网丝状,细胞排列紊乱分布不均;丝线组可见纤维组织旁见大量肉芽组织形成。修复12周家兔肌腱生物力学强度：骨形态发生蛋白12+聚羟基乙酸重建肌腱的力学强度明显优于Ⅰ型胶原-聚羟基乙酸组,与丝线缝合组差异无显著性意义;但骨形态发生蛋白12+聚羟基乙酸重建肌腱的力学强度低于正常肌腱。提示以自体骨髓间充质干细胞作为种子细胞,骨形态发生蛋白12诱导,以聚羟基乙酸为支架,可望构建组织工程化肌腱。构建的组织工程肌腱具有一定的生物力学特性,能用于修复跟腱缺损。     

骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化

背景：以骨髓间充质干细胞构建组织工程气管尚缺乏理想的特异性表面标志物,对其鉴定主要依赖细胞形态学、细胞表型及诱导分化的功能进行分析。 目的：体外分离培养、鉴定兔骨髓间充质干细胞,观察在特定条件下向气管软骨细胞分化的潜能。 方法：无菌环境取兔骨髓,经全骨髓贴壁筛选法分离培养细胞至第2代,流式细胞术鉴定第1、第2代细胞表面抗原CD44、CD45的表达。无菌环境取气管,经酶消化法分离培养气管软骨细胞,甲苯胺蓝染色鉴定软骨细胞蛋白聚糖的合成。在使用转化生长因子β1的基础上,将骨髓间充质干细胞与气管软骨细胞通过Transwell小室非接触式共培养,倒置显微镜观察细胞形态,甲苯胺蓝染色鉴定蛋白聚糖的合成,荧光实时定量PCR鉴定Ⅱ型胶原和蛋白聚糖 mRNA的表达。 结果与结论：分离、培养的细胞呈长梭形、不规则形聚集生长,传代后细胞生长速度明显增快,呈鱼群状聚集生长。第1代有96.97%的细胞表达CD44、13.72%的细胞表达CD45,第2代有99.11%的细胞表达CD44、8.54%的细胞表达CD45。气管软骨细胞甲苯胺蓝染色阳性。在诱导后,骨髓间充质干细胞形态逐渐由长梭形变为三角形或不规则形,表达软骨细胞特异性Ⅱ型胶原和蛋白聚糖 mRNA基因,甲苯胺蓝染色示阳性。结果表明全骨髓贴壁筛选法可成功分离培养骨髓间充质干细胞,第2代纯度较高,且在特定诱导条件下具有分化为气管软骨细胞的潜能。