骨髓间充质干细胞在D-半乳糖衰老小鼠体内的定植

目的：研究骨髓间充质干细胞在D-半乳糖衰老模型小鼠体内的植入情况。方法：采用5%D-半乳糖（0.25ml/10g）连续8周皮下注射建立衰老小鼠模型,并于模型建成后给予骨髓间充质干细胞输注。用PCR检测间充质干细胞在受体小鼠中的植入。结果：骨髓间充质干细胞在受体小鼠中定植。结论：对D-半乳糖衰老小鼠模型用骨髓间充质干细胞进行干预是可行的。     

D-半乳糖诱导间充质干细胞衰老的研究

目的 利用D-半乳糖诱导建立间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）体外衰老模型,并探讨其潜在机制。方法 以正常培养的MSCs做对照组,以分别用1、10、100g/L D-半乳糖诱导的MSCs作为处理组,培养48h后,采用免疫蛋白印迹法（Western blot）检测细胞内AKT与mTOR蛋白磷酸化水平以及衰老相关蛋白p16^Ink4a的变化。同时使用β-半乳糖苷酶试剂盒检测MSCs中β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）表达量的变化。最后用AKT抑制剂预处理D-半乳糖诱导组以明确AKT/mTOR信号通路在MSCs衰老中的作用。结果 与对照组相比,10g/L D-半乳糖作用48h后MSCs中β-半乳糖苷酶表达和衰老相关蛋白p16^Ink4a含量明显增加,同时p-AKT与p-mTOR含量也较对照组增加,加入AKT抑制剂后,衰老组β-半乳糖苷酶表达和衰老相关蛋白p16^Ink4a含量皆有所下降。结论 D-半乳糖能成功诱导构建MSCs体外衰老模型,AKT/mTOR信号通路参与了这一过程。     

脐带间充质干细胞对D-半乳糖衰老模型小鼠的抗衰老实验研究

目的研究人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)对D-半乳糖所致的亚急性衰老小鼠的抗衰老作用。方法对模型对照组和治疗组连续8周颈部皮下注射D-半乳糖(0.25 mg/10 g)以建立衰老模型,两周之后治疗组注射脐带间充质干细胞。检测脐带间充质干细胞治疗前后衰老相关指标:包括小鼠血清、肝组织、脑组织中的过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量的变化。结果模型对照组与治疗组相比,SOD、CAT偏低,MDA含量偏高并且存在显著性差异(P≤0.05),与空白对照组相比,则存在极显著性差异(P≤0.01)。结论脐带间充质干细胞能够显著改善D-半乳糖所致亚急性衰老小鼠的相关衰老指标,具有抗衰老作用。     

精脒对衰老兔骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及机制研究

背景 研究发现衰老兔骨髓间充质干细胞(bone-marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的成骨分化能力减弱,而精脒(Spermidine)对衰老相关疾病具有保护作用.目的 探讨精脒对衰老兔骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及其作用机制.方法 复苏BMSCs并将其分为3组:对照组(Vehicle,培养基中不加入药物),D-半乳糖诱导衰老组(D-gal,培养基中加入40 g/L D-gal诱导BMSCs衰老),Spermidine干预组(Spermidine,培养基中加入40 g/L D-gal + 3 μmol/L Spermidine处理BMSCs).试剂盒检测细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)与还原型NAD+(NADH)比例,MTT法检测细胞增殖活性.成骨诱导培养后,Western blot检测Sirt1蛋白的表达,qPCR检测成骨相关基因的转录水平.结果 与Vehicle组相比,D-gal组细胞内NAD+/NADH比例降低,BMSCs增殖减弱(P<0.05);Spermidine可提高细胞内NAD+/NADH比例并促进BMSCs增殖(P<0.05).成骨诱导培养后,D-gal抑制Sirt1表达并下调成骨相关基因Runx2、Osx和ALP的转录表达(P<0.05);而Spermidine可上调Runx2、Osx和ALP的转录表达(P<0.05).当采用siRNA抑制Sirt1表达后,Spermidine上调成骨相关基因转录表达的作用明显减弱(P<0.05).结论 Spermidine可通过激活Sirt1促进衰老兔BMSCs成骨分化.     

Neuregulin-1对过氧化氢诱导的小鼠骨髓间充质干细胞衰老的影响

目的:探讨Neuregulin-1(NRG-1)对过氧化氢(H2O2)诱导的小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)衰老的影响.方法:用H2O2诱导小鼠BMSCs衰老模型,将BMSCs分为对照组、H2O2组、H2O2+NRG-1组.采用CCK8检测细胞存活率,β-半乳糖苷酶染色法检测细胞衰老,流式细胞术检测细胞周期,实时荧光...     

大豆异黄酮对D-半乳糖所致衰老大鼠的影响

目的探讨大豆异黄酮(soybean isoflavon,SI)对D-半乳糖所致衰老大鼠的作用及其机制。方法以D-半乳糖(D-galactose,D-gal)120 mg/(kg.d)颈背部皮下注射6周,构建大鼠衰老模型,次日以灌胃方式给予SI 100、200、400 mg/(kg.d),连续6周。通过Morris水迷宫观察大鼠学习记忆能力的改变;测量大鼠胸腺指数(thymus weight/body weight,TW/BW)和脾指数(spleen weight/body weight,SW/BW);分光光度法检测血清中丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、脑组织中Na+-K+-ATP酶活性。结果 SI中、高剂量可改善D-半乳糖致衰老大鼠的学习记忆能力,使胸腺指数、脾指数增高;增强血清中SOD活性和脑组织中Na+-K+-ATP酶活性,降低大鼠血清中MDA含量,同模型组比较有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。结论 SI的抗衰老作用可能与抗氧化作用、稳定细胞膜有关。     

吡咯喹啉醌对D-半乳糖致大鼠皮层衰老的影响

目的观察吡咯喹啉醌(PQQ)对D-半乳糖致大鼠皮层神经细胞衰老的影响。方法用D-半乳糖致大鼠脑老化模型,侧脑室注射PQQ,50d后组织切片行H-E和尼氏染色观察皮层神经细胞的形态学变化,测皮层细胞的凋亡率和自由基,免疫组化法和SDS-PAGE检测Bcl-2/Bax和c-fos基因的表达。结果D-半乳糖处理组皮层神经细胞胞体变小,尼氏小体的光密度值降低,细胞的凋亡率和自由基的含量增加,Bcl-2/Bax和c-fos蛋白的表达降低;而PQQ处理组神经细胞胞体的直径和尼氏小体的含量高于对照组,PQQ降低了由D-半乳糖引起皮层组织自由基和细胞凋亡率的增加,Bcl-2/Bax和c-fos表达增加。结论PQQ能延缓由D-半乳糖引起的大鼠皮层神经细胞的衰老。     

小鼠骨髓间充质干细胞自噬与衰老的关系

目的 探讨小鼠骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）自噬与衰老的关系。方法 通过体外分离培 养年轻组小鼠（8 周龄）和老年组小鼠（18 个月龄）BM-MSCs,流式细胞术检测细胞表型,TUNEL 染色检 测细胞凋亡,ELISA 试剂盒检测BM-MSCs 分泌蛋白VEGF、bFGF、IGF-1、HGF 的表达,Western blot 检 测自噬相关蛋白LC3- Ⅰ、LC3- Ⅱ、Beclin 1、ATG12-5、p62 及信号通路蛋白p-Akt、Akt、p-mTOR、 mTOR 的表达。结果 与年轻组比较,老年组BM-MSCs 凋亡增加（P <0.05）,分泌功能下降（P <0.05）,自 噬相关蛋白LC3- Ⅰ、LC3- Ⅱ、Beclin 1、ATG12-5 表达水平下降（P <0.05）,相反p62 蛋白表达水平升高 （P <0.05）,自噬信号通路相关蛋白p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR 表达升高。结论 老年小鼠BM-MSCs 凋亡增加,自噬活性及旁分泌功能下降。     

注射D-半乳糖致大鼠衰老效应的评价

目的评价注射D-半乳糖（D—galactose）的致衰老效应。方法30只雄性Wistar大鼠随机分为对照组、模型1组和模型2组。每组各10只。模型1组每天皮下注射D一-乳糖50mg／kg：模型2组每天腹腔注射D-半乳糖500mg／kg;对照组每天颈部皮下注射等量（50mg／kg）生理盐水。各组大鼠均连续给药6周。观察各组体重增加比例、胸腺指数、脾指数、超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量。结果与对照组比较,模型1组和模型2组体重增加比例降低,胸腺明显萎缩,胸腺指数降低（P〈0．01）;胸腺组织出现明显病理变化;血清中SOD活性明显下降（P〈0．01）。MDA含量明显升高（P〈0．01）。结论皮下注射和腹腔注射D-半乳糖诱导的衰老效应基本相似。     

D-半乳糖衰老大鼠睾丸超微结构的观察

目的:观察D-半乳糖衰老模型大鼠睾丸超微结构的变化.方法:D-半乳糖连续腹腔注射制作亚急性衰老的大鼠模型,透射电镜下观察睾丸超微结构的变化.结果:衰老模型大鼠睾丸超微结构出现明显变化:支持细胞内溶酶体增多,内质网增生、扩张,线粒体嵴断裂;精原细胞内可见胞质内出现许多空泡;并观察到了凋亡小体.结论:D-半乳糖可导致大鼠睾丸超微结构发生明显改变,这可能是D-半乳糖致衰老的作用机制之一.     

白藜芦醇通过保护线粒体功能延缓骨髓间充质干细胞衰老

目的: 探讨白藜芦醇对骨髓间充质干细胞（MSC）衰老的影响及其机制。方法: 分离SD乳鼠（7日龄）MSC,传代培养至第3代后检测0、1、10、50 g/L D-半乳糖对MSC衰老的影响,确定D-半乳糖诱导MSC衰老的最佳浓度。再将细胞随机分为10、50、100 μmol/L白藜芦醇组及对照组。衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色观察各组细胞衰老变化;DCFH-DA染色检测总活性氧水平;MitoSOX Red染色检测线粒体活性氧水平;线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1法）检测线粒体膜电位变化;纯化线粒体膜通道孔（mPTP）比色法检测线粒体膜通道开放水平;蛋白质印迹法检测衰老相关蛋白p53、p16、γ-H2AX表达和细胞质内线粒体细胞色素C外泄水平。结果: 10、50 g/L D-半乳糖可明显增加SA-β-gal染色阳性MSC数量和线粒体活性氧水平（均P < 0.01）。与对照组比较,白藜芦醇组SA-β-gal染色阳性细胞数减少（均P < 0.01）,p53、p16和γ-H2AX表达减少,细胞内总活性氧和线粒体活性氧水平下降（均P < 0.01）,线粒体膜电位下降（P < 0.05或P < 0.01）,膜通道开放水平降低（P < 0.05或P < 0.01）,细胞质内细胞色素C外泄减少。结论: 白藜芦醇可保护MSC线粒体功能,延缓MSC衰老。     

大鼠骨髓间充质干细胞定向诱导为血管内皮样细胞

①目的探讨体外分离和纯化大鼠骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为血管内皮样细胞及其为组织工程血管的构建提供种子细胞的可能性。②方法收集大鼠股骨骨髓血。进行体外扩增培养成纯化的间充质干细胞，取第4—6代生长状态良好的间充质干细胞，用含40ng／mL内皮细胞生长因子（vascular endothelial prowth factor，VEGF）培养液诱导细胞，利用免疫组织化学观察vWF的表这。③结果通过离体培养可使体内环境下低农度的骨髓间充质干细胞实现数目扩增；诱导14天后实验组细胞vWF强阳性表达，接近汇合的细胞外观呈现特征性的鹅卵石样形态。对照组细胞vWF呈阴性表达。④结论体外可以获得足够量的较为单一、具有较强增殖能力的间充质干细胞，而间充质干细胞可以在体外定向分化为具有内皮血管细胞特性的细胞。     

人骨髓间充质干细胞体外分化为雪旺样细胞的方法

目的 :建立人骨髓间充质干细胞体外向雪旺样细胞定向诱导分化的方法。方法 :取健康人骨髓血标本 ,利用percoll(密度为 1.0 73 g·ml-1)分离骨髓单个核细胞 ,在DMEM LG + 10 % (体积分数 )FBS中培养 ,通过流式细胞术对培养细胞进行表型测定 ,对第 2、3、5、8代间充质干细胞进行定向诱导分化 ,用单抗S 10 0、神经胶质纤维酸性蛋白 (glialfibrillargacidicprotein ,GFAP) ,通过免疫组化方法对诱导的细胞进行鉴定。 结果 :经 percoll分离的间充质干细胞可传 16代 ,细胞数增加了大约 6× 10 7倍。流式细胞术结果显示 :percoll分离出来的未经培养的细胞 ,其CD2 9+CD4 4 +CD3 4 -CD4 5 -细胞数为 3 2 .4 7%± 3 .4 9% ,而培养后贴壁细胞中CD2 9+CD4 4 +CD3 4 -CD4 5 -细胞数为 94 .3 8%± 1.5 0 %。诱导后免疫组化染色结果显示 :由 β ME +bFGF预诱导、β ME +bFGF诱导的S 10 0阳性细胞最多 ,可达 90 %± 4 % ,GFAP阳性细胞为 2 1%± 5 %。结论 :人骨髓中间充质干细胞能定向诱导分化成雪旺样细胞。     

大鼠骨髓间质干细胞的BrdU体外标记和体内示踪研究

目的探讨骨髓间质干细胞(BMSCs)的体外标记和体内示踪技术。方法分离培养并鉴定大鼠BMSCs,进行5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记后,体外培养被标记的BMSCs,观察其连续传代后的BrdU可标记时间和标记效率;建立大鼠胃黏膜损伤模型,将分离纯化的BrdU标记BMSCs移植到损伤的胃黏膜下,体内观察BrdU对活体移植BMSCs的示踪作用。结果免疫组化显示体外培养大鼠BMSCs的CD44、CD90表达阳性,CD14、CD45表达阴性,显微结构表现出干细胞特征。进行BrdU标记后,标记阳性率随标记时间延长而增高,48h达高峰,72h仍维持高阳性率。终浓度为10μmol/L的BrdU孵育48h、72h阳性标记率高于5μmol/L BrdU组(P<0.05),但与15μmol/L BrdU组阳性标记率差异无统计学意义(P>0.05),并且连续传代培养21d后也可检测到。BrdU可示踪BMSCs在损伤的胃黏膜下局部定植。结论 BrdU在浓度为10μmol/L、标记时间48h至72h标记效率较高;BrdU标记可用于一定时间段内BMSCs移植入体内后定植和生长的动态示踪观察方法。     

大鼠鼻窦黏膜干细胞的分离培养和成骨能力研究

目的明确大鼠鼻窦结构,尝试体外分离培养鼻窦黏膜干细胞,检测其多向分化能力,为口腔颌面部骨缺损修复治疗的体外研究寻找新的种子细胞。方法选用3月龄SD大鼠,进行口腔颌面部和鼻窦解剖,制作冠状位石蜡切片观察鼻窦形态和黏膜成分。取鼻窦内衬黏膜,改良酶消化法进行间充质干细胞(SMSCs)分离培养,检测其成克隆能力,使用流式细胞术进行间充质干细胞表面标志物鉴定。油红O染色检测SMSCs的成脂肪能力,茜素红染色和碱性磷酸酶(ALP)活性测试检验SMSCs的成骨能力,并与大鼠牙龈来源间充质干细胞(GMSCs)、大鼠骨髓来源间充质干细胞(BMSCs)比较。结果 SD大鼠具有结构清晰的上颌窦,窦腔内衬黏膜呈现典型的三层结构。使用该内衬黏膜能够成功分离培养出具有多向分化能力和成克隆能力且带有间充质干细胞表面标志物的SMSCs细胞。在成骨培养基诱导下,SMSCs胞外基质矿化能力与GMSCs和BMSCs相比差异无统计学意义(P0.05)。但14天时SMSCs的ALP活性显著大于GMSCs(P0.05)。结论 SD大鼠鼻窦内衬黏膜可成功分离培养出具有体外成骨能力的间充质干细胞,为口腔颌面部骨组织工程研究提供新的细胞选择。     

5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞的技术探讨

①目的 探讨5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记骨髓间充质干细胞的可行性。②方法 利用密度为1．073g／mL的Percoll分离骨髓的单核细胞，以含10％胎牛血清的低糖DMEM培养基培养与扩增MSCs细胞，纯度可达95％左右。用BrdU标记骨髓间充质干细胞24、48、72和96小时后的检测标记率。③结果 随着标记时间的延长，标记率逐渐增高，标记72小时后标记率在85％以上。④结论 用BrdU标记骨髓间充质干细胞的最佳时间是72小时，最佳浓度为10μg／mL。     

骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌细胞的初步实验观察

目的体外培养并诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌细胞。方法采用密度梯度离心法和贴壁培养法分离、纯化大鼠骨髓MSCs,在第3代细胞以5-氮杂胞苷进行诱导,用免疫细胞化学的方法鉴定肌细胞及心肌细胞特异蛋白的表达。结果诱导后细胞体积较诱导前增大,而且更加细长,呈长梭形。14d细胞之间出现连接,排列方向渐趋一致。免疫细胞化学染色显示Desmin,α-SarcomericActin和心肌特异性cTnI呈阳性反应。结论MSCs可能具有表达心肌细胞的特异性启动或分化调控基因,5-氮杂胞苷能在体外诱导MSCs向心肌细胞分化。     

人乙型肝炎病毒DNA阳性血清对人骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的影响

目的:探索人乙型肝炎病毒感染血清对间充质干细胞向肝细胞分化的影响,为肝细胞移植提供实验基础.方法:体外分离和纯化骨髓间允质干细胞,接种在肝细胞诱导培养基中,刺激干细胞向肝细胞分化.设立4个实验组加入不同血清:A组,5%(体积分数)胎牛血清(FBS);B组,2.5%(体积分数)FBS+2.5%(体积分数)乙型肝炎感染血清;C组,2.5%FBS+2.5%(体积分数)正常人血清;D组,以含10%(体积分数)FBS的LG-DMEM培养液作为对照.诱导培养后,利用免疫组织化学染色检测肝细胞特异性标志,以及感染细胞是否表达乙型肝炎特异性蛋白.应用糖原染色技术检测细胞合成和储存糖原的功能.结果:诱导组的间充质干细胞表达白蛋白(ALB)和甲胎球蛋白(AFP),并具备合成和储存糖原的功能.B组细胞加入感染血清后,扩增能力受到抑制,少量细胞可表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg),但ALB和AFP的表达阳性率以及糖原储存能力与C组相似.荧光共聚焦技术检查可见部分细胞同时表达ALB和HBsAg.结论:骨髓间充质干细胞在特定的肝细胞诱导条件下具有向肝细胞分化的能力;乙型肝炎感染血清可以明显抑制间充质干细胞的体外扩增,但对其向肝细胞分化没有明显影响.     

淫羊藿苷对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

目的:探讨淫羊藿苷对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。方法:采用差速贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪鉴定表面标志。取第3代细胞加入10-6mol/L淫羊藿苷培养基,对照组仅加入等量普通培养基进行培养。通过镜下观察细胞形态,流式细胞仪测定细胞表面标志,碱性磷酸酶试剂盒测定诱导细胞碱性磷酸酶活性,组织化学染色观察钙化结节形成能力。结果:体外培养的细胞表达CD29、CD44、CD105、CD166。淫羊藿苷诱导组细胞碱性磷酸酶呈阳性反应并有钙化结节形成,而对照组未见钙化结节形成。结论:淫羊藿苷能够诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,可视为一种良好的骨诱导活性因子。