高特异性PCR方法鉴别乌梢蛇及其混淆品

 目的建立一种简便、准确的乌梢蛇药材DNA分子标记鉴别方法。方法根据乌梢蛇及10种常见混淆品线粒体12SrRNA基因序列,设计一对专用于乌梢蛇的鉴别引物HWL-1和HWH-1,用不同的复性温度PCR扩增,确立特异性反应条件,并利用此方法鉴别从市场上购买的各种乌梢蛇药材。结果PCR结果是在65℃复性温度下,正品乌梢蛇得到约320 bp的扩增带,而混淆品在同样的条件下无扩增带。为检验该方法的准确性,对市售乌梢蛇炮制品随机选取13块进行PCR鉴别验证,其中正品9块,混淆品4块,检出率达100%。结论所设计的鉴别引物对正品乌梢蛇有高度的特异性。PCR方法稳定性高,同种不同个体间的种内差异对鉴定结果无影响。本方法简单、准确、快速、灵敏度高、重现性好。     

基于PCR技术可视化鉴别金钱白花蛇方法的建立

目的 基于聚合酶链式反应(PCR)技术,利用核酸扩增产物,建立一种可以快速鉴定金钱白花蛇中药材真伪的可视化试纸条检测方法。方法 提取金钱白花蛇、赤链蛇及市售样本的基因;根据mtDNA Cytb序列进行对比分析,设计1对特异性鉴别引物,进行修饰物标记;建立鉴别PCR反应体系,使用核酸扩增产物,利用可视化试纸条对市售样本进行真伪鉴定。结果 鉴别引物可将正品金钱白花蛇中药材扩增出500~600 bp之间的特异性条带,而伪混品则不出现相应的特异性条带;可视化试纸条对市售样本进行检测,鉴别效果良好,灵敏度高,可准确鉴定中药材真伪。结论 可视化试纸条可以快速鉴别金钱白花蛇中药材真伪,稳定性高、特异性强,可应用于市场出售金钱白花蛇中药材的鉴定。     

快速PCR方法在蛇类药材真伪鉴别中的应用

为优化获得一种准确、快速、高效鉴别药典所载蛇类药材(乌梢蛇,金钱白花蛇,蕲蛇)真伪品的方法。该研究以蛇类药材经典PCR鉴定方法为基础,采用碱裂解法提取基因组总DNA,加入特异性PCR引物,采用两步法进行PCR扩增,从而对蛇类药材及其混淆品进行鉴别。通过对影响PCR反应时间的退火温度、变性温度、退火时间、变性时间、循环次数等因素进行优化,并对不同型号PCR仪和Taq酶进行考察,分别获得乌梢蛇、金钱白花蛇、蕲蛇快速PCR反应程序。在PCR产物中加入SYBR Green I染料,正品显示出明亮绿色荧光,而混淆品不显示荧光。所建立的蛇类药材快速PCR真伪检测方法可在30~45 min完成,为蛇类药材现场快速鉴定提供技术支持。     

应用位点特异性引物鉴定白花蛇舌草

目的:建立一种简便实用的白花蛇舌草药材的DNA分子鉴定方法.方法:收集目前市场上出现的白花蛇舌草及伪品共9种,分别提取总DNA,扩增rDNA ITS-2区序列,对比所有样品的该段核苷酸序列,并设计能专一性鉴别白花蛇舌草的位点特异性引物.结果:白花蛇舌草及其混淆品在ITS-2区的序列有显著差异.用位点特异性引物对所有样品DNA进行PCR扩增,只有白花蛇舌草有明显的约392 bp扩增产物,而其它8种植物在同等条件下无阳性产物.结论:所设计的鉴别引物对白花蛇舌草有高度的特异性.     

菟丝子、莱菔子与其易混淆品的快速PCR法鉴别研究

完善快速PCR鉴定检测体系,并建立菟丝子或莱菔子的分子鉴别方法。收集不同地区的菟丝子、莱菔子及其易混淆品材料,所有样品进行总DNA的提取,通过对菟丝子、莱菔子及其易混淆样品ITS片段进行扩增、测序,进行同源比对后根据其变异位点设计特异性鉴别引物,采用2步法进行PCR扩增,从而对菟丝子或莱菔子进行鉴别。通过对影响PCR退火温度、变性温度、退火时间、变性时间、循环次数等因素进行优化,并对不同型号PCR仪进行考察,分别获得菟丝子、莱菔子快速PCR反应程序。在稀释后的PCR产物中加入SYBR GreenⅠ染料,正品显示出明亮绿色荧光,而混淆品不显示荧光,且可有效的避免因引物二聚体而存在的假阳性问题。快速PCR方法可以简单快速鉴别菟丝子、莱菔子,为实现药材分子鉴别的现场运用提供技术支撑。     

分子遗传标记技术在中药材鉴定中的应用

目前,用于中药材鉴定的分子标记技术主要有SCAR、RFLP、RAPD、PCR-RFLP、DNA测序和位点特异性鉴别PCR等。近5年来,通过这些分子标记技术的比较,我们发现位点特异性鉴别PCR技术以其简单、快速、准确、重现性好、成本低、抗污染等优点,将有十分广阔的应用前景。本文论述了位点特异性鉴别PCR技术以PCR反应为基础,通过对正品药材及其伪、混品的某些DNA片段的序列研究,找出正品药材的特异性位点,设计出只扩增正品药材的高度特异性的鉴别引物。用此引物对样品DNA进行一次PCR反应,经电泳检测便可准确鉴别样品的真伪。并对今后进一步开展此项工作提出了相应的建议。     

分子遗传标记技术在中药材鉴定中的应用

目前,用于中药材鉴定的分子标记技术主要有SCAR、RFLP、RAPD、PCR-RFLP、DNA测序和位点特异性鉴别PCR等。近5年来,通过这些分子标记技术的比较,我们发现位点特异性鉴别PCR技术以其简单、快速、准确、重现性好、成本低、抗污染等优点,将有十分广阔的应用前景。本文论述了位点特异性鉴别PCR技术以PCR反应为基础,通过对正品药材及其伪、混品的某些DNA片段的序列研究,找出正品药材的特异性位点,设计出只扩增正品药材的高度特异性的鉴别引物。用此引物对样品DNA进行一次PCR反应,经电泳检测便可准确鉴别样品的真伪。并对今后进一步开展此项工作提出了相应的建议。     

金钱白花蛇与三种常见混伪品多重PCR鉴别方法

目的建立一种快速、高效的鉴别金钱白花蛇(银环蛇)与三种常见混伪品的多重PCR方法。方法采用动物DNA提取试剂盒提取金钱白花蛇、赤链蛇、赤链华游蛇与金环蛇DNA;根据各样品COI(动物线粒体细胞色素b基因)序列设计4对不同长度的特异性引物,建立并优化多重PCR反应体系,通过电泳检测扩增产物分子量差异实现4种蛇类的快速鉴别。结果针对金钱白花蛇、赤链蛇、赤链华游蛇与金环蛇所设计的4对引物分别扩增出136、195、244和315bp的目的条带;每对引物特异性扩增,灵敏度为皮克级。结论首次建立了金钱白花蛇与常见三种相似混伪品的多重PCR方法。此方法特异性高,为多重PCR技术体系在中药材金钱白花蛇的快速检测提供参考。     

何首乌及其常见混淆品的matK基因序列分析及鉴别

目的:比较何首乌与其常见混淆品的matK基因序列,从分子水平对中药材何首乌进行鉴定。方法:改良的CTAB法提取基因组DNA,用一对matK通用引物进行PCR扩增,TA克隆后进行测序和序列分析。结果:除毛脉蓼之外,其他混淆品与正品何首乌间的matK基因序列差异较大,不论是核苷酸替代数还是遗传距离,都远远大于不同居群的何首乌之间;进一步比对分析,发现了可以快速鉴别何首乌及其同属混淆品的鉴别位点;运用matK序列分析成功地对3种市售何首乌药材进行了真伪鉴定。结论:根据matK序列特征,能有效区分何首乌及其常见混淆品,matK序列可以作为何首乌药材鉴定的分子标记。     

藏药羌活鱼的COⅠ分子鉴定

对动物线粒体基因COⅠ进行PCR扩增及双向测序,得到羌活鱼及其混伪品无斑肥源和截趾虎的COⅠ基因序列。通过序列分析比对,根据序列差异设计特异性引物SJYW1,SJYW2,改变退火温度及循环数以得到特异性的反应条件。结果表明,当复性温度为54℃,25个循环时,正品羌活鱼在约350 bp处有明显扩增带,而无斑肥源和截趾虎没有扩增带。该实验具有较高的特异性、重复性,可用于羌活鱼的鉴别。     

金钗石斛的位点特异性PCR鉴别研究

目的建立一种简便、实用的金钗石斛的DNA分子鉴别方法。方法根据金钗石斛及其他黄草类、枫斗类石斛的rDNA ITS序列数据库,寻找金钗石斛特异性的序列位点,设计专用于金钗石斛鉴别的PCR引物,用该引物在不同条件下扩增石斛属植物的模板DNA,建立只有金钗石斛具有阳性扩增的PCR鉴别条件。结果在66℃、40 s的复性条件下进行鉴别PCR,金钗石斛的模板DNA扩增出约300 bp的阳性扩增带,而其他39种石斛的模板DNA在同样条件下无扩增产物。结论运用位点特异性PCR能有效地从其他石斛属植物中鉴别出金钗石斛,该方法具有高效、准确、简便、省时的特点,应用前景广泛。     

中药材鳖甲的位点特异性PCR鉴定研究

目的 本研究旨在建立一种简便、实用的鳖甲DNA分子鉴定方法。方法 根据中华鳖和鳖甲混淆品原动物的125rRNA基因片段的序列数据库,找出中华鳖与其它鳖科动物有明显区别的位点,设计1对能特异性鉴别中华鳖的引物,然后利用鳖甲中残存的DNA,通过PCR拉增,即可准确鉴别鳖甲。结果 用这对引物对不同来源的10块鳖甲进行鉴定结果表明,其中有3块为伪品,结果与DNA序列分析鉴定一致。还测定了斑龟和鳖甲一伪品12SrRNA基因片段序列。结论 该引物配置药材鉴定试盒可在鳖甲类药材鉴定使用。     

中药材龟甲细胞色素b基因特异性鉴定研究

 目的 建立一种实用、简便、准确的中药材龟甲DNA分子标记鉴定方法。方法 采用酚-三氯甲烷抽提法和盐析法提取龟甲mtDNA。从GenBank数据库中下载乌龟及常见伪品源动物mtDNA细胞色素b基因序列,经序列比较分析,设计特异性引物,并使用该引物对正品及其伪品mtDNA进行扩增并测序。结果 盐析法提取DNA的浓度高于酚-三氯甲烷抽提法,并且盐析法省时、经济。本实验所设计引物只能扩增正品龟甲mtDNA,测序结果与龟甲同源性100%。结论 盐析法是一套适合从龟甲中提取高质量DNA的方法,本实验所设计的引物具有高度特异性,可用于龟甲类药材的鉴定。     

黄花白及的SCAR分子标记转化研究

目的 建立黄花白及的SCAR标记,为黄花白及的分子鉴定提供科学依据.方法 用随机引物进行随机扩增多态性DNA (random amplified polymorphic DNA,RAPD)标记筛选,获得特异的RAPD标记条带,经回收、克隆、测序后,根据RAPD标记条带的两端序列设计特异引物进行常规PCR反应,以获得序列特征化扩增区(sequence characterizedamplified region,SCAR)标记.结果 利用50对随机引物筛选得到黄花白及的一条896 bp的特异片段,可以区别于小白及、独叶白芨和白及.该序列设计特异引物后,经过多次重复试验,该RAPD标记的特异片段已成功转化为SCAR标记.结论 建立的SCAR标记条带清晰明亮,结果稳定,可作为黄花白及分子鉴定的依据.     

应用PCR-RFLP方法鉴定梅花鹿茸与马鹿茸

目的 建立一种应用限制性片段长度多态性技术鉴别梅花鹿茸与马鹿茸的方法。方法 提取各种鹿茸样品的基因组DNA,通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)对正品鹿茸的特异性片段进行扩增,鉴别鹿茸的真伪,然后对正品鹿茸利用动物通用引物进行PCR扩增,并通过限制性片段长度多态性分析进一步对正品鹿茸的种属来源进行确证。结果 通过对特异性片段的PCR扩增,可将梅花鹿茸及马鹿茸与驯鹿、麋鹿、新西兰鹿等伪品鹿茸加以区分,通过对限制性内切酶Msp I 进行酶切后的片段长度进行分析,可进一步区分梅花鹿茸与马鹿茸。结论 本实验建立了一种基于限制性片段长度多态性技术快速、准确的鉴别鹿茸真伪及种属鉴定的方法,为解决中药易混品种难以鉴定的问题提供了又一个新方法。     

乌头霜霉病病原物分子检测方法的建立

目的:建立乌头霜霉病病原菌快速分子检测方法,为乌头种苗检疫及栽培环境土壤安全性评价提供依据。方法:使用真菌DNA提取试剂盒提取病原菌DNA,采用真菌核糖体内转录间隔区(ITS)通用引物ITS1/ITS4,对病原菌的r DNA-ITS区间序列进行扩增,将聚合酶链式反应(PCR)产物回收纯化并进行序列测定,并将测得的ITS序列同Gene Bank中搜索到的相关ITS序列进行比较,运用DNAMAN比对出特异序列片段,利用特异序列片段通过Primer Premier 5.0设计并筛选特异性引物,建立乌头霜霉病病原菌快速PCR检测方法。结果:从Primer Premier 5.0设计的8对引物中筛选出了灵敏度高、特异性强的引物对L1A/L1B,该引物能够从乌头霜霉病病原菌DNA扩增出670 bp的具有检测价值的明亮条带,利用该引物也能够检测出乌头种苗、成株以及栽培土壤是否存在乌头霜霉病原菌。结论:筛选出的引物对L1A/L1B能够快速、简便、有效地检测出乌头霜霉病病原菌,建立的方法能用于对乌头种苗霜霉病的提前检测或检疫。     

中药地龙中参环毛蚓环介导等温扩增快速检测方法

[目的]建立中药材地龙中参环毛蚓的环介导等温扩增(LAMP)检测技术,实现对参环毛蚓的快速检测。[方法]采集不同产地地龙,提取总DNA后将所提取的总DNA进行线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ亚基(COI)基因片段扩增、测序、比对,判断各产地地龙物种。用设计的LAMP引物组进行地龙LAMP实验,反应结束后向扩增产物中加入核酸染料SYBR GreenⅠ,分别在自然光、紫外光下直接通过肉眼来观察颜色变化及利用琼脂糖凝胶电泳来检测其引物的特异性。[结果]利用新设计的LAMP引物对参环毛蚓实现了特异性扩增,且检出限达40 fg/μL,具有极高的灵敏度。[结论]利用LAMP技术可实现参环毛蚓的现场快速检测。     

蒙成药中“地格达”类原料药材的位点特异性PCR鉴别研究

该文选择8种含有地格达类蒙药原料药材的蒙成药为对象,首先对基原植物肋柱花和苦地丁样品采用改良CTAB法提取其总DNA,使用psbA-trnH片段进行扩增、测序,与GenBank下载的8种蒙成药中其他原料药材psbA-trnH序列进行同源比对后根据其变异位点设计特异性鉴别引物。同时对8种蒙成药进行总DNA的提取,并使用DNA纯化试剂盒进行纯化,通过PCR反应对叶绿体rbcL序列进行扩增,再分别选择肋柱花和苦地丁鉴别引物进行扩增,并将扩增后的产物进行测序。所得序列校正、比对后,进行比对分析。结果表明,地格达-4汤、地格达-8散、地格达-4散中均含有原料药材肋柱花,苦地丁特异鉴别引物扩增分析可以鉴定出利胆八味散、伊赫哈日-12和阿嘎日-35中含有苦地丁。该研究结果说明,位点特异PCR方法用于鉴定蒙成药中原料药材具有一定的可行性。