肺动脉高压患者Ⅱ型骨形成蛋白受体基因启动子-142G>A突变的研究

目的 探讨Ⅱ型骨形成蛋白受体(BMPR2)基因启动子突变与肺动脉高压发病的关系.方法 对1例家族性肺动脉高压(FPAH)、19例特发性肺动脉高压(IPAH)患者和50名健康成人进行BMPR2基因启动子区转录起始点上游-2022 bp的DNA序列测定.分别将突变型和野生型BMPR2基因启动子区片段插入pGL3-basic双荧光素酶报告基因载体中,获得pGL3-BMPR2启动子-突变型重组质粒和pGL3-BMPR2启动子-野生型重组质粒.以2种重组质粒分别转染人肺动脉平滑肌细胞(HPASMC)和人肺动脉内皮细胞(HPAEC),用Veritas微孔板发光检测仪检测突变型和野生型BMPR2基因启动子区片段在2种细胞中的转录调控活性(结果以萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶活性比值表示).应用MAPPER软件分析突变型和野生型BMPR2基因启动子区转录因子结合位点.结果 在1例36岁女性FPAH患者的BMPR2基因启动子区发现杂合子突变-142G>A.突变型BMPR2基因启动子片段在HPASMC和HPAEC中的转录活性(分别为9.58±3.85、59.07±25.54)均明显低于野生型(分别为16.80±3.55、115.58±38.02,均P<0.05),而且缺失转录因子Sp3结合位点.结论 BMPR2基因启动子-142G>A突变可能与FPAH发病有关.     

一例原发性肺动脉高压家族的临床与遗传学特点

目的 阐明家族性原发性肺动脉高压(PPH)的临床与遗传学特点。方法 对河南省驻马店地区1例PPH家系成员进行了详细的临床及实验室检查。采集所有家系成员外周血并提取DNA,设计BMPR2基因外显子1-13含侧翼内含子序列引物,对聚合酶链式反应(PCR)扩增产物纯化后测序,与正常BMPR2基因序列比较。以100名正常志愿者的临床检查和测序结果作为对照。结果 发现先证者及其弟弟和先证者之女共3人患有重度肺动脉高压,肺源性心脏病,心脏扩大,心功能Ⅲ级。其中以先证者病情最为严重,35岁时发病。先证者之母于42岁发病,43岁去世;而先证者之女13岁即已发病。先证者其他家系成员临床检查未见异常。测序证实先证者等3例患者的BMPR2基因11号外显子的第491位密码子发生C—T转换,导致该位置编码的精氨酸(R)变为色氨酸（W),而其他家系成员没有发现此突变。对照组未见临床及遗传学检查的异常。结论 BMPR2基因的R491W错义突变可致汉族人群家族性PPH的发生,提示与白种人一样,BMPR2基因也是我国PPH重要的致病基因。此突变表型在本家系中表现出症状严重,外显率高的特征,且没有健康携带者,并有发病年龄逐渐提前的趋势。     

华人遗传性混合息肉病综合征BMPR1A基因种系突变检测

[目的]探讨遗传性混合息肉病综合征华人家系中BMPR1A基因是否存在种系突变.[方法]34个家系成员外周血提取基因组DNA,利用聚合酶链式反应分别扩增BMPR1A基因全部外显子,进行DNA测序与突变分析,对突变外显子PCR扩增产物作变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定.[结果]家系12和2所有发病成员BMPR1A基因2号外显子位于codon23处缺失11个碱基(AAAGTCAGAAA),同时2号外显子PCR扩增产物变性聚丙烯酰胺凝胶电泳也发现异常迁移条带,而家系中正常成员的检测未发现这一突变.[结论]两华人HMPS家系中BMPR1A基因缺失突变与疾病共遗传,该基因极可能是HMPS华人家系的致病基因.     

两个多发性内分泌腺瘤病2A型家系RET基因突变研究

目的总结2个多发性内分泌腺瘤病2A（MEN2A）型家系的临床特点,及MEN2A家系RET基因突变类型。方法对2个MEN2A家系进行临床调查,分析其临床特点。提取2个家系成员外周血基因组DNA,扩增先证者RET原癌基因的外显子10、11,13—16,并行Sanger测序,测得突变所在的外显子后,将其亲属相应外显子的扩增产物进行测序。结果家系1的先证者及其哥哥的10q11．2外显子11（密码子634）RET原癌基因发生点突变：Cys643Trp。家系2的先证者其兄长存在10q11。2外显子11（密码子634）RET原癌基因发生点突变：Cys643Arg,筛查出1个家系成员为基因突变携带者。结论RET原癌基因第11外显子Cys643Trp杂合突变及Cys634Arg杂合突变,均为MEN2A的致病基因．此2个家系患者虽然突变类型不同,但两家系患者在起病方式、发病年龄及临床表现均相似。基因检测是诊断MEN2A的有效方法。     

TWO NOVEL MUTATIONS IN PHENYLALANINE HYDROXYLASE GENE AND IN VITRO EXPRESSION ANALYSIS ON MUTATION ARG252GLN

INTRoDUCTIoNPhenylketonuria(PKU)isanautosomalrecessivediseasecausedbythedeficiencyofaliver-specificen-zyme,phenylalaninehydroxylase(PAH).Itisoneofthemostcommoninbornerrorsofmetabolismwithaprevalenceof1in17OOOnewbornChinese(l).Recent-ly,theuseofalternativemolecularapproachesforstudy-ingPKUpatientsfromvariousethnicgroupsworldwidehasrevealedatleast14OdifferentpointmutationsinthehumanPAHgene(2,3),andmorethanl3mutationshavebeenreportedinChinesepopulations(4～9)'Tofurtherinvestigatethemol…     

蛋白C基因C5498T致Ⅰ型遗传性蛋白质C缺陷症

目的 对一个遗传性Ⅰ型蛋白C(PC)缺陷症家系进行基因突变的检测。方法 分别用ELISA和发色底物法测定血浆蛋白Ｃ活性和抗原。用PCR法对先证者PC基因的9个外显子及其侧翼、内含子2序列进行扩增,PCR产物纯化后直接测序,检测其基因突变。突变位点经限制性内切酶分析证实。结果先证者的蛋白C活性和抗原分别为26％和1．43g／L。先证者表现为PＣ基因外显子3区杂合错义突变Ｃ5498T,引起Arg15→Ｔrp。在基因启动子区存在2405C／T、2418A／G、2583A／T多态性。结论 该突变导致遗传性Ⅰ型PC缺陷症。     

Biochemical activity and gene analysis of inherited protein C and antithrombin deficiency in two Chinese pedigrees

Background We identified the gene mutations in two Chinese pedigree of type Ⅰ hereditary protein C deficiency and type Ⅰ hereditary antithrombin deficiency.Methods The plasma level of protein C activity (PC: A), protein C antigen ( PC: Ag) , protein S activity, antithrombin activity (AT: A) and antithrombin antigen (AT: Ag) of propositi and two family members were detected using ELISA and chromogenic assay, respectively. All exons and intron-exon boundaries of protein C gene and antithrombin gene were analyzed by direct sequencing of the corresponding amplified PCR products in DNA from the propositus.Results The plasma PC: A and PC: Ag of propositus 1 was 26% and 1.43 mg/dl, respectively. The PC: Ag and PC: A of his father were normal. The decreased PC: A level was seen in his mother and 4 of his maternal pedigree. PS: A and AT: A were all normal in pedigree 1 members. A C5498T heterozygous mutation in exon 3 of protein C gene, resulting in the substitution of Arg for Trp at the 15th amino acid, was identified in propositus 1 and 8 of his relatives. The plasma AT: A and AT: Ag of propositus 2 was 48.6% and 10.4 mg/dl, respectively. The reduced AT: A and AT: Ag levels were found in his father and 5 of paternal pedigree. PC: A, PC: Ag and PS: A were all in normal range. A heterozygous 13387-9G deletion in exon 6 of antithrombin gene was identified in propositus 2. This mutation introduced a frameshift and a premature stop at codon 426 and existed in 6 members of pedigree 2.Conclusion The C5498T heterozygous mutation in exon 3 of protein C gene, first reported in China,leads to type Ⅰ hereditary protein C deficiency. The 13387-9G deletion, a novel mutation, can cause antithrombin deficiency and thrombosis.     

一个复合杂合突变导致的遗传性凝血因子XII缺陷症家系分析

目的：对一个复合杂合基因突变导致的遗传性凝血因子XII（FXII）缺陷症家系进行实验室表型和基因突变分析,寻找致病基因并初步探讨其分子发病机制。方法：检测先证者及其家系成员（共3代5人）血浆凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血因子VIII促凝活性（FVIII:C）、凝血因子Ⅸ促凝活性（FIX:C）、凝血因子XI促凝活性（FXI:C）、XII促凝活性（FXII:C）和FXII抗原含量（FXII:Ag）等指标以明确诊断。采用PCR直接测序法分析先证者F12基因所有的外显子及其侧翼序列,对可疑的突变反向测序进行验证,并对家系成员的相应突变位点区域进行检测。采用ClustalX-2.1-win软件和4个在线生物信息工具（Mutation Taster、Poly-Phen-2、PROVEAN和SIFT）分析氨基酸突变位点的保守性和突变对蛋白质功能的可能影响;用Swiss-Pdb Viewer 4.0.1软件对突变位点进行蛋白模型相互作用分析。结果：先证者APTT为59.1 s,明显延长;FXII:C和FXII:Ag分别降低至4%和5%,其父亲、母亲、女儿的FXII:C和FXII:Ag降低至32%～37%。基因分析发现先证者F12基因第13号外显子存在复合杂合基因突变,即c.1561G＞A杂合错义突变（p.Glu502Lys）和c.1637T＞C杂合错义突变（p.Met527Thr）;其父亲为p.Met527Thr携带者,母亲和女儿为p.Glu502Lys携带者。保守性分析结果表明,Glu502和Met527在同源物种间高度保守;4个在线生物信息学软件对该两个突变的预测结果一致,均预示很可能是有害突变,可引起相关疾病。突变蛋白模型分析显示,野生型Glu502与His365之间形成1条氢键,Glu502替换为Lys502导致氢键的消失;野生型Met527与Leu524之间形成1条氢键,Met527替换为Thr527导致Thr527-Leu524之间增加2条氢键。结论：该先证者F12基因第13号外显子上存在p.Glu502Lys和p.Met527Thr复合杂合突变,推测该突变遗传自具有血缘关系且分别存在p.Glu502Lys和p.Met527Thr杂合子的父母,并与该家系FXII水平降低有关。     

家族性与散发性肥厚型心肌病基因突变的对比研究

目的 研究中国家族性及散发性肥厚型心肌病（HCM）患者的致病基因突变位点的异同。方法 对10个家系中36例HCM患者及50例散发的HCM患者进行B肌球蛋白重链（MYH7）、肌钙蛋白T（TNNT2）及肌球结合蛋白C（MYBPC3）扫描,聚合酶链式反应扩增,双脱氧末端终止法测序。结果家族性HCM患者中,3个家系的13例HCM患者发现MYH7错义突变,分别为18号外显子发生G12601A突变（Arg663His）、23号外显子发生G15373A突变（Glu924Lys）、20号外显子发生T13659C突变（Ile736Thr）,散发的50例HCM患者中,有1例发现MYH7的20号外显子上T13659C突变。所有HCM患者均未发现TNNT2基因突变。家族性HCM患者中有2个家系共4例发现MYBPC3基因突变：2例为18号外显子上的Arg502Trp、2例为13号外显子碱基插入突变,即在7425～7426间插入CGGCA,导致Arg346fs移码突变;50例散发性HCM患者中未发现此基因突变。结论 MYH7和MYBPC3可能为我国家族性HCM的主要致病基因之一,而我国散发性HCM患者MYH7和MYBPC3基因突变率低;TNNT2可能不是我国HCM患者的主要致病基因。     

多发性内分泌腺瘤病2A家系的RET原癌基因突变研究

目的 检测一个多发性内分泌腺瘤病2A(MEN 2A)型家系的RET原癌基因突变情况。方法 提取16名家系成员外周血基因组DNA，对RET原癌基因第ll外显子进行聚合酶链反应(PCR)，PCR产物进行直接基因测序。结果 家系中l例病理确诊嗜铬细胞瘤的患者存在RET原癌基因第ll外显子634密码子错义突变；另外筛查出2名家系成员为该突变基因携带者，其中l例经B超发现甲状腺结节性病灶伴血清降钙素升高。结论 MEN2A的诊断达到了基因水平，对家系基因筛查可以早期诊断该疾病。     

全外显子组测序发现一家族性扩张型心肌病致病基因

 目的 对一扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy, DCM)家系行全基因组外显子测序以寻找该家系的致病基因。方法 收集在复旦大学附属中山医院就诊的1位DCM患者及其家系成员的临床资料,采集相关家系成员外周血并抽提DNA,对该家系5名成员行全基因组外显子测序,寻找致病基因,用Sanger测序对家系其他成员进行验证。结果 通过对家系患者与正常人测序结果比对分析,同时经过多个生物数据库数据过滤,发现LMNA基因6号外显子上存在的杂合突变 c.961 C>T (p.Arg321Ter)为该家系的可能致病基因突变。LMNA c.961 C>T无义突变导致LMNA编码蛋白质过程提前终止,相应蛋白质功能异常,进而导致该家系中此突变基因的携带者出现心功能异常。结论 本研究应用全基因组外显子测序从一DCM家系中发现其致病基因及突变位点:LMNA c.961 C>T (p.Arg321Ter),突变导致该家系相关成员心功能异常。此位点在汉族人群中尚属首次报道。     

伴皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病四个家系的NOTCH3基因突变研究

目的 报告4个伴皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病(CADASIL)家系的NOTCH3基因突变特点。方法 对4个经临床和病理检查证实的CADASIL家系中的先证者作NOTCH3基因编码区外显子1～12的聚合酶链反应(PCR)和DNA测序,对家系2和4中的部分亲属也作了同样的检查。结果 4个家系中的先证者均发现有NOTCH3基因的杂合性错义突变,先证者1为外显子3的268C→T突变,先证者2为外显子3的322C→T突变,先证者3为外显子3的328C→T突变,先证者4为外显子11的1819C→T突变,分别造成Notch3蛋白质R90C、C108R、R110C和R607C4个位点氨基酸的替换。其中先证者2的C108R突变尚未见文献报道。在家系2和家系4中,部分成员也携带与先证者同样的突变。结论 这4个家系的CADASIL病均由NOTCH3基因的突变引起,不同位点的基因突变导致相似的临床表现。     

低钾型周期性麻痹患者的临床及基因特征

目的 分析低钾型周期性麻痹患者的临床特征及基因突变特点。方法 对32例低钾型周期性麻痹患者进行基因筛查,发现6例存在基因突变,回顾性分析这6例患者的临床及基因特征,并进行家系研究。基因检测应用聚合酶链式反应后直接测序。结果 6例患者均青少年发病,5例发作有明确诱因,检测血钾低且补钾治疗有效。5例患者有明确低钾型周期性麻痹家族史。患者基因突变分别为CACNA1S基因c.1583G>A（p.Arg528His）、c.2627T>A（p.Val876Glu）、c.2690G>A（p.Arg897Met）及c.2700G>C（p.Arg900Ser）突变以及SCN4A基因c.2015G>A（p.Arg672His）和c.2024G>A（p.Arg675Gln）突变,其中CACNA1S基因p.Arg528His和SCN4A基因p.Arg672His为热点突变,Arg897Met为新的突变位点。结论 6例低钾型周期性麻痹患者临床表现典型,存在CACNA1S或SCN4A基因的胚系突变,CACNA1S Arg897Met为新的突变位点。     

一个新的双重杂合突变Met306Val和Thr181Asn导致的遗传性凝血因子Ⅶ缺乏症

目的 对1例遗传性凝血因子Ⅶ（FⅦ）缺乏症患者及其家系成员进行凝血因子Ⅶ（FⅦ）基因分析,揭示其发病的分子机制。方法提取先证者及其家系成员外周血基因组DNA,聚合酶链反应（PCR）法扩增FV0基因8个外显子及其侧翼序列,核苷酸序列分析检测FV0基因异常;将先证者突变序列、家系成员和100名正常人相应序列的PCR产物用限制性内切酶EC091I消化,以进一步确定基因突变位点并排除基因多态性;用蛋白质分子模型模拟软件对基因突变的分子结构病理学进行分析。结果先证者FV0基因8号外显子的10833位核苷酸发生A→G杂合突变,导致Met306Val;先证者7号外显子的9643位核苷酸发生C→A杂合突变,导致Thr181Asn。家系分析前者遗传于母亲,后者遗传于父亲,先证者胞妹为A10833G（Met306Val）杂合子。蛋白质空间构型模拟分析发现,Met306Val突变位于FⅦ分子的表面,产生空间位阻影响蛋白的结构和功能。结论FⅦ基因Met306Val和m18lAsn双重杂合突变是导致该遗传性凝血因子Ⅶ缺乏症的分子机制;推测Met306Val突变改变了蛋白质分子的空间构型,从而影响FⅦ蛋白的功能。Met306Val突变是一种国际上尚未报道的新的突变类型。     

应用变性高效液相色谱技术筛查一个正常血钾性周期性麻痹家系的SCN4A基因突变

目的 应用变性高效液相色谱(DHPLC)技术筛查一发生Met1592Val替换的正常血钾性周期性麻痹(normoKPP)家系的SCN4A基因,证实该突变为疾病相关突变,并总结其在此家系的临床表型特点。方法 总结一normoKPP家系14例患者的临床特点,应用DHPLC技术筛查SCN4A基因全部24个外显子,并对发现异常洗脱峰者进行测序。结果 该家系具有典型的normoKPP临床特征,无肌强直表现及早显、性别偏移现象,病程呈良性过程,发病早晚与症状严重程度及预后无相关。DHPLC筛查发现在外显子1及24存在杂合二倍体,测序及连锁分析证实位于外显子1的突变为良性多态性,外显子24的Met1592Val替换为疾病相关突变。结论 国人存在Met1592Val突变,此突变可导致normoKPP。normoKPP与高钾性周期性麻痹临床表现相似,两者可存在共同突变。     

一种新型纤维蛋白原β链错义突变导致的遗传性低纤维蛋白原血症

目的：对临床发现的1例遗传性低纤维蛋白原血症进行基因及表型分析,探讨其分子发病机制。方法：采集先证者及其家系成员共2代6人的外周血,采用STAGO自动化血凝仪检测凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶时间（TT）、D-D二聚体（D-D）和纤维蛋白降解产物（FDPs）;凝血酶凝固法（Clauss法）与免疫比浊法分别测定血浆纤维蛋白原活性（Fg:C）和抗原水平（Fg:Ag）。PCR扩增纤维蛋白原FGA、FGB和FGG基因的所有外显子和侧翼序列,PCR产物纯化后直接测序进行基因分析。分别用Swiss-PDViewer、在线分析系统对突变蛋白的结构、突变位点的保守性进行预测分析。结果：先证者PT和TT均延长,Fg:C（0.82 g/L）和Fg:Ag（1.19 g/L）明显降低;基因分析发现先证者FGB基因存在c.425T＞G杂合突变,导致纤维蛋白原Bβ链上121位亮氨酸突变为精氨酸（Leu121Arg）。其父亲及儿子也存在该突变位点。蛋白模型分析显示Leu121突变为Arg121后,氨基酸极性发生改变,并且新增与Try117、Met118、Trp125之间的氢键;蛋白同源性分析显示：Leu121在脊椎动物间有较高的保守性。结论：纤维蛋白原Bβ链Leu121Arg杂合突变是引起该家系遗传性低纤维蛋白原血症的主要原因。     

Identification and analysis of mutations of the Wilson disease gene in Chinese population

Ｗｉｌｓｏｎｄｉｓｅａｓｅ (ＷＤ)ｉｓａｌｅｔｈａｌａｕｔｏｓｏｍａｌｒｅｃｅｓｓｉｖｅｄｉｓｏｒｄｅｒｏｆｃｏｐｐｅｒｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ,ａｎｄｉｓｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄｂｙａｃｕｔｅｏｒｃｈｒｏｎｉｃｌｉｖｅｒｄｉｓｅａｓｅａｎｄ/ｏｒｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃｄｅｆｉｃｉｔｓｄｕｅｔｏｃｏｐｐｅｒａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｉｎｌｉｖｅｒａｎｄｂｒａｉｎ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｉｓｔｏｒｅｍｏｖｅｔｈｅｅｘｃｅｓｓｃｏｐｐｅｒｂｙｃｈｅｌａｔｉｎｇａｇｅｎｔｓｓｕｃｈａｓｐｅｎｉｃｉｌｌａｍｉｎｅ1　…     

基因检测在Ⅳ型埃勒斯-当洛综合征诊断中的意义

目的 埃勒斯-当洛综合征(Ⅳ型)是临床罕见病例,诊断困难,基因检测技术可明确该病诊断.方法 设计Col3A1基因引物,提取患者外周血标本DNA,PCR扩增后行测序分析碱基突变点,确认氨基酸变化位置,结合临床特征进行疾病诊断.结果 患者Col3A1基因外显子30的第2209个碱基及内含子15的第327碱基出现套峰.在2209位碱基出现G-A的突变,造成第698个氨基酸变化,由丙氨酸(Ala)改变为苏氨酸(Thr),即:P.A698T(c.2209G＞A),突变来源于先证者家系.结论 基因检测可以明确埃勒斯-当洛综合征诊断,对临床有指导意义.

Abstract：

Objective To ascertain the diagnosis of such a rare disease as Ehlers-Danlos syndrome type Ⅳ by the technique of DNA(deoxyribonucleic acid)analysis.Methods The primer sequences of Col3A1 gene were designed. Genomic DNA was isolated from the peripheral blood samples. The amplification of polymerase chain reaction(PCR)was performed and direct sequencing used to screen the mutations.A definite diagnosis was made in conjunctions with clinical features.Results Two nucleotide mutations for Col3A1 were found. One was in intron 15 while another in exon 30. The latter was an important mutation of a G to A transition(c.2209G＞A)resulting in alanine to threonine substitution at position(p.Ala698Thr).The mutations were inherited from proband of pedigree.Conclusion Genetic testing of Col3A1 mutation can facilitate an accurate diagnosis of Ehlers-Danlos syndrome.     

一个遗传性非综合征型耳聋家系的 GJB2基因突变分析

目的：对1个遗传性非综合征型耳聋家系的临床表型特征进行分析,并选取 GJB2基因进行突变检测。方法详细询问病史和临床检查后,提取患者及家系成员的外周血基因组 DNA ,PCR 扩增 GJB2基因的外显子及外显子和内含子的交界区域,然后对扩增产物进行 DNA 测序和 BLAST 比对进行突变分析。结果该家系所有患者为迟发性、渐进性、早期以高频听力下降为主的感觉神经性聋。 GJB2基因突变分析检测到6种单核苷酸多态,其中 c ．79G ＞ A （p ．Val27Ile）和 c ．341G ＞ A （p ． Glu114Gly）为已知单核苷酸多态,而位于3′‐UTR 的 g ．4159T ＞ C 、g ．5142G／T 、g ．5227G／A 、g ．5352T ／C 突变为本研究新发现。结论该家系未发现 GJB2外显子致病性突变,遗传性非综合征型耳聋存在明显的遗传异质性。     

Wilson病ATP7B基因突变研究

目的：研究肝豆状核变性（WD）ATP7B基因常见突变种类和形式,以期建立WD的ATP7B基因突变热点的检测平台。方法：提取30名WD患者外周血基因组DNA,聚合酶链反应（PCR）扩增ATP7B基因第5、8、12号外显子,并进行DNA直接测序。结果：30例WD患者共检测到6种ATP7B基因突变,均为点突变,8号外显子检测到5种突变,突变频率40.00%;12号外显子检测到1种突变,突变频率23.33%;5号外显子未检测到突变。结论：ATP7B基因第8和12号外显子可能是WD基因突变热区,以Arg778Leu和Arg952Lys为高频突变位点,WD患者的基因突变检测应首选第8和12号外显子。