miR-424在人骨髓间充质干细胞分化过程中的表达

目的 筛选可作为人骨髓间充质干细胞(MSCs)分子标记物的microRNA(miRNA).方法 以从骨髓中分离培养的MSCs及其诱导分化的成骨细胞和软骨细胞为实验对象,利用基因芯片检测miRNA的表达情况,由芯片显著性分析(SAM)得到MSCs较其诱导分化细胞高表达的miRNA,再由实时定量PCR进行验证.结果 成功分离培养出MSCs,并分别诱导其分化为成骨细胞和软骨细胞;MSCs及由其诱导分化的成骨细胞和软骨细胞经miRNA芯片检测及SAM分析得到8个MSCs较由其诱导分化的成骨细胞高表达miRNA(has-miR-424、has-miR-34a、has-miR-593、has-miR-10a、has-miR-148a、has-miR-602、mmu-miR-709、mmu-miR-665),3个MSCs较由其诱导分化的软骨细胞高表达miRNA(has-miR-424、PREDICTED_MIR189、mmu-miR-665).其中MSCs较成骨细胞和软骨细胞均高表达的人源性miRNA为has-miR-424,差异倍数分别为6.6倍和4.4倍;在原样本中对进行实时定量PCR的验证,结果提示与诱导分化的成骨细胞相比,MSCs中的has-miR-424表达升高约3.6倍,而与诱导分化的软骨细胞相比,MSCs中的has-miR-424表达升高约3.1倍,结果与芯片结果相符合.结论 MSCs较其诱导分化细胞高表达的miRNA有望成为人骨髓间充质干细胞的一种特异性的分子标记物,这些miRNA对MSCs自我更新和未分化状态起着重要的维持作用.     

白藜芦醇抑制辐射诱导的IL-1β表达

目的 研究白藜芦醇对间充质干细胞(MSCs)受照后产生的炎症因子IL-1β的影响,探讨白藜芦醇对MSCs的辐射防护作用。方法 将间充质干细胞分为空白对照组、单纯照射组与白藜芦醇组,白藜芦醇组预先给予不同浓度的白藜芦醇,经¹³⁷Csγ射线照射后,应用ELISA、Western blot和 RT-PCR等方法检测 IL-1β的分泌和表达。结果 预先给予间充质干细胞50、100和200 μmol/L的白藜芦醇组与单纯照射组相比,IL-1β胞外分泌显著降低(t=83.34、24.48、12.52,P<0.05),同时细胞内IL-1β蛋白表达和mRNA水平也显著降低(t=8.69、14.77、13.90,P<0.05)。结论 白藜芦醇可明显抑制辐射诱导的间充质干细胞炎症因子IL-1β的产生。     

去舒地尔对人骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化的影响

目的 探讨HA-1077（fasuclil，法舒地尔）对人骨髓间充质干细胞（MSCs）分化为表皮细胞的影响。方法 采用直接贴壁法培养并扩增人胚胎股骨骨髓干细胞，免疫细胞化学及流式细胞仪进行表面标志的检测。设对照组、诱导组、HA-1077诱导组1、HA-1077诱导组2，采用免疫细胞化学及流式细胞仪对各组细胞角质蛋白表达变化进行检测，观察其对MSCs分化为表皮细胞的影响。结果 采用直接贴壁法可以获得大量高纯度的人骨髓MSCs，分组培养后第2天开始出现少量细胞角质蛋白阳性表达细胞，随着时间延长，阳性率逐渐提高。7天后流式细胞仪显示单纯诱导组及HA-1077诱导组CK5／8、CKl0／13、CK19阳性率均远高于诱导组（P〈0．01）。结论 HA-1077可能通过抑制Rho-ROCK途径的激活从而促进MSCs体外培养中角蛋白表达的显著提升，Rho-ROCK途径可能在促进MSCs分化为表皮细胞过程中起着重要调控作用。     

重组腺病毒介导noggin诱导骨髓问充质干细胞向神经细胞分化

目的 探讨体外分离、培养大鼠间充质干细胞(MSCs)的方法 ,采用重组腺病毒介导的noggin基因体外诱导方法 ,观察MSCs向神经细胞的定向分化效应.方法 原代培养MSCs 24h开始贴壁,呈梭形,集落样生长,纯化后,采用含noggin基因的重组腺病毒(pAdEasy-1-noggin)感染原代培养的MSCs,诱导骨髓MSCs分化为神经细胞.用鉴定神经特异性烯醇化酶(NSE)、神经元核抗原(NeuN)、神经丝蛋白(NF-200)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的免疫细胞化学方法 对诱导后的细胞进行鉴定.结果 倒置显微镜下观察可见,MSCs经重组腺病毒感染后48h,细胞向神经细胞分化,胞体呈锥形、多角形,由胞体伸出较长的轴突样和树突样突起,且有分支.免疫组织化学鉴定显示,诱导后的细胞能特异性表达NSE、NeuN和NF-200,而GFAP表达阴性.结论 利用密度梯度离心法结合贴壁法可以获得比较纯的MSCs;noggin基因重组腺病毒载体可成功诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化.     

人IL-1 Ra基因真核表达载体的构建及体外转染大鼠骨髓间充质干细胞

目的:构建人IL-1Ra真核表达载体,体外转染大鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)。方法:从PHA活化的人外周血单个核细胞中提取总RNA,RT-PCR法获得hIL-1Ra cDNA,经HindⅢ、EcoRⅠ双酶切,定向克隆到真核表达载体pcD-NA3。经酶切分析及PCR鉴定后,脂质体介导下体外转染大鼠BM-MSCs,免疫荧光法检测hIL-1Ra在大鼠MSCs的表达。结果:获得570 bp大小的IL-1Ra cDNA片段;经酶切分析、PCR鉴定及DNA测序,证实IL-1Ra cDNA定向插入pcDNA3质粒,目的序列与GenBank源序列完全一致;脂质体介导转染48h后,免疫荧光检测到hIL-1Ra在大鼠MSCs的表达。结论:成功构建pcDNA3-hIL-1Ra真核表达载体并在大鼠BM-MSCs中表达,为进一步的hIL-1Ra基因修饰MSCs研究提供了实验基础。     

牵张刺激对大鼠骨髓间充质干细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原表达的影响

目的 研究机械刺激对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesehchymal stem cells,BMSCs)分化的影响.方法 对大鼠BMSCs施以10%形变,1 Hz的周期性单向牵张刺激,并检测牵张不同时段后,其Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA的表达和这2种蛋白的分泌.结果 牵张12 h后,BMSCs Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA的表达与对照组相比增高有显著差异,24 h后,种胶原蛋白的合成与对照组相比有统计学差别.结论 说明机械刺激可以促进BMSCs合成Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白.     

表皮细胞生长因子在体诱导猪骨髓间充质干细胞向皮肤组织分化作用的研究

目的观察表皮细胞生长因子(EGF)在体内是否具有诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)向皮肤组织分化的作用,及其在皮肤创面愈合中的作用。方法抽取小型猪骨髓,体外分离、纯化和培养MSCs,并用5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)进行标记。6只小型猪共48个创面,随机分为EGF MSCs治疗组(A组)、MSCs治疗组(B组)、EGF治疗组(C组)和生理盐水对照组(D组)。观察伤后治疗3、7、14、21及84天的创面,并用病理学、免疫组化方法对创面的修复质量进行评估。结果A组的皮肤创面愈合速度明显快于其它治疗组,并且在皮肤愈合的组织病理等级评分上优于B、C和D组。A组表皮层BrdU和CKp双染阳性细胞比B组更为多见。结论EGF具有在体促进猪骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化,加快皮肤创面愈合速度和提高愈合质量的作用。     

鼠间充质干细胞向成骨细胞定向诱导分化的研究

目的:探讨干细胞向成骨细胞诱导分化的特征。方法:利用成骨细胞诱导体系诱导小鼠骨髓间充质干细胞系(D1细胞)向成骨细胞定向分化,D1细胞诱导不同时间后,运用免疫组化方法检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP),Ⅰ型胶原(typeⅠcollagen,COL1)的表达;RT-PCR检测Osterx和OCN mRNA的表达。结果:细胞诱导培养3、7、14和21 d后结果显示:3 d时ALP、COL1呈阴性表达,7 d ALP呈阳性表达,14 d ALP表达最高,21 d ALP表达明显减少;7 d COL1呈阳性表达,14 d和21 d表达显著增强;14 d有矿化结节形成,21 d形成典型的矿化结节。7 d时OSX和OCN基因表达上调,14 d时OSX基因表达下调,21 d其表达上调;14 d时OCN表达上调,21 d后表达下调。结论:间充质干细胞能定向诱导为成骨细胞,OSX基因的表达是其分化的关键。     

HMGB1促进人骨髓间充质干细胞迁移的实验研究

目的：构建人高迁移率族蛋白（HMGB1）全长编码基因的原核表达载体，诱导和纯化重组蛋白，分析其对人骨髓间充质干细胞的迁移作用。方法：RT—PCR方法从人的单个核细胞中扩增出HMGB1全长编码基因，克隆于原核表达载体pET-24a—d（＋），经IPTG诱导表达，通过亲和层析方法纯化得到携带（His）。标签的HMGB1融合蛋白；RT—PCR方法检测间充质干细胞HMGB1受体的表达；观察HMGB1对人骨髓来源间充质干细胞的迁移作用。结果：构建了融合蛋白HMGB1的原核表达载体，获得了高度纯化的HMGB1融合蛋白。RT-PCR方法检测到间充质干细胞表达HMGB1的某些受体如RAGE和TLR-4。HMGB1在体外能够诱导人骨髓来源的间充质干细胞的迁移。结论：重组HMGB1蛋白能够诱导骨髓间充质干细胞的迁移，此作用有可能通过RAGE和（或）TLR-4介导。     

Human bone marrow mesenchymal stem cells expressing SDF-1 promote hematopoietic stem cell function of human mobilised peripheral blood CD34+ cells in vivo and in vitro

Purpose:?There is mounting evidence demonstrating that stromal cell derived factor-1 (SDF-1) plays an important role in homing of hematopoietic progenitor cells to bone marrow. This study was aimed to assess whether bone marrow mesenchymal stem cells overexpressing exogenous SDF-1 could synergistically promote the homing of CD34⁺ (Cluster of Differentiation [CD]) cells to bone marrow of lethally irradiated severe combined immunodeficiency (SCID) mice.

Methods:?Human SDF-1 complementary Deoxyribonucleic acid (cDNA) was transfected into bone marrow-derived mesenchymal stem cells with recombinant lentiviral vector. The expression of SDF-1 was detected by real-time Polymerase Chain Reaction (PCR) and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), and the ex vivo chemotaxis function on CD34⁺ cells was measured by coculture system and Transwell system. SDF-1 gene-modified mesenchymal stem cell (MSC) and CD34⁺ cells were infused into lethally irradiated SCID mice and the hematopoietic reconstitution in the recipient mice was examined.

Results:?Messenger ribonucleic acid (mRNA) and protein of SDF-1 in infected MSC were significantly higher than that of the non-infected control MSC (p?<?0.05). The infected MSC have significant chemotaxis effect on CD34⁺ cells in?vitro and promote hematopoietic reconstitution after CD34⁺ cell transplantation in?vivo.

Conclusion:?MSC with high-level expression of SDF-1 can synergistically promote hematopoietic reconstitution after CD34⁺ cell transplantation in lethally irradiated SCID mice.     

急性白血病骨髓基质细胞中SDF-1的异常表达研究

目的观察初诊和完全缓解的急性白血病骨髓基质细胞SDF1表达情况。方法分离培养5例初诊急性白血病患者(A组)、5例完全缓解急性白血病患者(B组)、5例正常人或无重大血液系统疾病患者(C组)骨髓基质细胞,ELISA法检测培养上清中SDF1含量。结果A、B、C三组骨髓基质细胞培养上清中SDF1含量分别为2941±374、2891±305、1583±157pg/ml,A、B两组显著高于C组(P<0.05)。结论急性白血病患者骨髓基质细胞分泌SDF1增多,完全缓解后仍存在持续异常。     

SDF-1的表达与造血细胞回巢关系的实验研究

目的 探讨趋化蛋白SDF－1在造血细胞回巢中的作用。方法 采用异基因小鼠骨髓细胞移植动物模型和免疫组化双染色方法，观察趋化蛋白SDF－1的表达与回巢细胞的关系。结果 骨髓内SDF－1主要表达在骨内膜旁、微血管内皮、骨细胞内和供体阳性细胞周围，与非照射组相比，照射预处理组骨髓中的SDF－1在骨细胞中、骨内膜旁有明显高表达，提示放射预处理可能促使髓内各种基质细胞分泌SDF－1，SDF－1与回巢细胞的关系密切。结论 照射预处理可能是增加骨髓基质细胞分泌SDF－1的激发因素之一，SDF－1在造血细胞回巢中有重要作用。     

人胚胎骨髓间充质干细胞的分离与鉴定

目的：摸索分离和鉴定高纯度的人胚胎骨髓间充质干细胞。方法：采用密度梯度离心法，分离含有间充质干细胞的人胚胎骨髓细胞悬液，获得人胚胎骨髓间充质干细胞。用流式细胞仪检测获得的细胞中人胚胎骨髓间充质干细胞含量。结果：获得的细胞中人胚胎骨髓间充质干细胞含量达85％。结论：密度梯度离心法分离获得的人胚胎骨髓间充质干细胞纯度高。     

骨髓间充质干细胞条件培养基对INS-1细胞凋亡的影响

目的 探讨骨髓间充质干细胞条件培养基(BMSC-CM)对促炎因子诱导大鼠胰岛素瘤细胞(INS-1)凋亡的影响及其作用机制.方法 培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)至第3代,收集、浓缩其上清液,获得富含BMSCs分泌因子的条件培养基.用含促炎因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ的培养基处理INS-1细胞48h,造成炎症损伤β细胞模型,加入不同浓度的BMSC-CM继续培养12h,所获细胞分为以下5组:正常对照组,促炎因子组,1×BMSC-CM组,2×BMSC-CM组,4× BMSC-CM组.采用CCK-8法检测INS-1细胞存活率,膜连蛋白V/碘化丙啶(Annexin V/PI)检测细胞凋亡率,二氯荧光素双醋酸盐(DCFH-DA)检测细胞内活性氧(ROS)的生成量.结果 与正常对照组相比,促炎因子组INS-1细胞存活率下降至正常对照组的75.84％±1.53％,细胞凋亡率增加(17.23％±1.77％),细胞内ROS水平明显升高(34.3％±0.80％),差异均具有统计学意义(P＜0.01).而BMSC-CM有效对抗了促炎因子导致的INS-1细胞损伤,其作用呈剂量依赖性,4×BMSC-CM组效果最佳,该组INS-1细胞存活率较促炎因子组升高了11.86％,达到87.7％±2.08％,细胞凋亡率下降至8.67％±1.59％,ROS生成量减少至17.1％±2.14％,差异均具有统计学意义(P＜0.05).结论 BMSC-CM可抑制促炎因子诱导的INS-1细胞凋亡,其作用机制可能与BMSC-CM降低细胞内ROS水平有关.     

经体外预处理人胎儿骨髓间充质干细胞的潜在自身成瘤性

目的评价经体外预处理、启动免疫保护功能的人胎儿骨髓间充质干细胞（hfBMSCs）的潜在自身成瘤性。方法采用流式细胞术检测细胞表型及细胞周期,染色体核型分析检测遗传稳定性,裸鼠皮下接种检测体内成瘤性。结果体外预处理的hfBMSCs呈正常间充质干细胞表型,可通过阻滞细胞周期于G0-G1期抑制hfBMSCs生长增殖（P〈0.05）,对染色体核型无影响,不具备体内成瘤性。结论经体外预处理的人胎儿骨髓间充质干细胞不具有自身成瘤性。     

miR-30a-5p和NUAK1在非小细胞肺癌中的表达及对A549细胞增殖、迁移和侵袭的影响

 目的 研究miR-30a-5p和靶基因NUAK1在非小细胞肺癌中的表达及对A549细胞增殖、迁移侵袭的影响。方法 收集2016-09至2019-03在保定市第一医院行手术切除治疗的非小细胞肺癌患者癌组织和癌旁组织标本64例,QPCR和Western blot分别检测非小细胞肺癌组织样本和细胞中miR-30a-5p和NUAK1的表达;TargetScan网站预测miR-30a-5p与NUAK1间的靶向关系,双荧光素酶报告基因实验和Western blot进行验证;MTT和Transwell实验检测miR-30a-5p及联合过表达NUAK1对A549细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结果 非小细胞肺癌组织中miR-30a-5p的相对表达量(0.33±0.14)低于癌旁组织(1.00±0.21),差异有统计学意义(t=21.237,P＜0.05);非小细胞肺癌组织中NUAK1 mRNA表达(4.13±1.87)和蛋白表达(3.41±1.62)均高于癌旁组织(1.00±0.17、1.00±0.16),差异有统计学意义(t=13.335、11.844,P＜0.05)。非小细胞肺癌细胞系H460、H1299、A549中miR-30a-5p表达量(0.35±0.03、0.51±0.05、0.28±0.03)低于人正常肺上皮细胞BEAS-2B(1.00±0.11),差异有统计学意义(F=77.100,P＜0.05);H460、H1299、A549细胞中NUAK1 mRNA相对表达量(2.98±0.30、2.39±0.24、3.42±0.36)和蛋白相对表达量(3.06±0.31、2.27±0.23、4.12±0.41)均显著高于BEAS-2B细胞(1.00±0.09、1.00±0.11),差异有统计学意义(F=46.660、63.070,P＜0.05)。结论 miR-30a-5p可通过靶向NUAK1抑制非小细胞肺癌细胞A549增殖、迁移和侵袭,提示miR-30a-5p和NUAK1可能成为一种新的临床诊断和治疗非小细胞肺癌的靶点。     

造血干细胞移植预处理对人骨髓间充质干细胞的影响及机制研究

目的:研究造血干细胞移植(HSCT)前的预处理对HSCT患者骨髓间充质干细胞(MSCs)的影响并探讨其机制。方法:原代MSCs克隆培养集落形成单位(CFU-F),对比检测14例正常人和12例恶性肿瘤(恶性淋巴瘤9例、乳腺癌2例、小细胞肺癌1例)HSCT前后骨髓中的MSCs数量;传代培养测定细胞生长曲线,计算细胞倍增时间;流式细胞术测定细胞增殖周期和CD45、CD34、CD44表达。结果:骨髓CFU-F正常人为(29.7±14.1)/1×106MNCs;移植前为(29.3±16.2)/1×106MNCs,移植后为(8.4±3.7)/1×106MNCs,移植前与正常人比较无显著性差异,移植后明显少于正常人和移植前(P<0.01)。MSCs免疫表型为CD34-、CD45-、CD44+;指数增长期MSCs平均倍增时间均约为30h;细胞周期分析显示,正常人、移植前后MSCs的S+G2+M期细胞比例分别为18.2%、17.9%和18.7%,三组比较均无显著性差异。结论:HSCT前预处理对骨髓MSCs有损伤作用,其机理可能是使MSCs细胞数量减少,但不影响其细胞增殖特性。