ERα基因敲除小鼠的繁育及子代小鼠基因型的鉴定

目的 探讨雌激素受体α(ERα)基因敲除小鼠的优化繁育方法及ERα基因敲除小鼠子代鼠的鉴定方法,建立ERα基因敲除小鼠模型,为进一步研究ERα蛋白的功能奠定基础.方法 用4种不同的交配方式观察子代鼠的各表型比率及雌、雄性ERα基因突变纯合子小鼠的繁殖能力;从子鼠鼠尾中提取基因组DNA,用PCR方法扩增ERα基因片段,琼脂糖凝胶电泳后观察结果.HE染色观察雌、雄性ERα<''-/->小鼠生殖系统表型变化.结果 WT、ERα<''+/->、ERα<''-/->各表型小鼠互交繁殖结果基本符合孟德尔遗传规律,且雌、雄性ERα<''-/->小鼠无繁殖能力.与WT比较,雄性ERα<''-/->小鼠睾丸脏器系数降低,睾丸病理变化表现为生精小管管腔膨胀,生精细胞层变薄,且排列不规则;雌性ERα<''-/->小鼠子宫脏器系数降低,子宫和卵巢病变明显,表现为:子宫浆膜、肌层、内膜层细胞排列不规则,卵巢有囊性病变、充血,无黄体.结论 雌、雄性ERα<''+/->小鼠交配是繁育ERα<''-/->小鼠的较好方法;实验所用PCR方法能够精确鉴定ERα<''-/->小鼠,ERα<''-/->小鼠的获得为ERα蛋白功能的实验研究提供了较理想的动物模型.     

LSS基因敲除小鼠的饲养、繁殖及基因型鉴定

探讨羊毛固醇合成酶(LSS)基因敲除鼠的繁育和基因型分析.将引进杂合子小鼠进行饲养并繁育,提取其基因组DNA,利用PCR反应扩增目的 基因片段,鉴定出小鼠的基因型;Westem blot分析并比较LSS基因敲除杂合子小鼠和野生型小鼠的肝脏、皮肤组织中LSS蛋白的表达情况.成功的繁育出LSS基因敲除小鼠,使用PCR鉴定其...     

BAMBI基因敲除小鼠的繁育、基因型鉴定

目的 探讨BAMBI-/-小鼠的繁殖和鉴定方法,筛选出足够数量的BAMBI-/-小鼠,为研究BAMBI基因在肥胖、能量代谢等方面的生理功能提供实验动物.方法 将引进的2对BAMBI-/-小鼠扩繁后,以与背景品系C57BL/6J野生型（WT）回交的方式获得BAMBI＋/-小鼠,再将BAMBI＋/-小鼠进行互交大量繁殖.提取幼鼠尾部组织DNA,利用PCR方法鉴定基因型;选取BAMBI-/-小鼠取肩胛部位棕色脂肪组织（BAT）,腹股沟部位皮下白色脂肪组织（sWAT）,性腺周围白色脂肪组织（gWAT）和肝脏,利用实时PCR方法检测BAMBI mRNA的表达量.结果 BAMBI＋/-小鼠互交扩繁,短期能获得大量小鼠;C57BL/6J野生型（WT）、BAMBI＋/-和BAMBI-/-各表型结果基本符合孟德尔遗传规律;BAMBI-/-小鼠敲除效率理想.结论 BAMBI＋/-小鼠互交是繁育BAMBI-/-小鼠的较好方法;PCR方法能够准确鉴定BAMBI-/-小鼠.     

miR-100基因敲除小鼠模型的构建及基因型鉴定

目的探讨miR-100基因敲除小鼠模型的构建及基因鉴定。方法将引进的miR-100^flox/flox小鼠与EIIa-Cre小鼠进行交配繁育出F1代小鼠,将F1代小鼠中基因型为miR-100^flox/-的雌雄小鼠继续进行交配,获得F2代小鼠,待小鼠1周龄时剪尾部组织提取DNA,PCR法扩增目的基因片段,琼脂糖凝胶电泳进行基因型结果判定。结果结果显示有所需要的miR-100基因敲除纯合子小鼠,将获得的敲除纯合子小鼠再交配,就可获得更多的基因敲除纯合子小鼠。F1代杂合子小鼠交配获得的F2代小鼠中出现3种基因型:miR-100^flox/flox、miR-100^flox/-、miR-100^-/-,使用PCR法成功鉴定出了子代小鼠的基因型。同时剪取miR-100敲除纯合子小鼠、miR-100^flox/flox小鼠及miR-100敲除杂合子小鼠的耳朵提取RNA,然后进行qRT-PCR验证miR-100的表达情况。qRT-PCR结果显示,miR-100基因全身敲除纯合子小...     

SRC-3基因敲除小鼠的饲养繁殖及鉴定

目的繁殖和鉴定SRC-3基因敲除小鼠.方法将所引进的杂合子小鼠进行饲养并繁殖,繁殖成功后其子代中将会出现野生型、杂合子以及纯合子3种基因型,提取每只小鼠尾部基因组DNA,用PCR法进行鉴定,一旦获得雄性纯合子,就将其与雌性杂合子交配,依照孟德尔遗传定律就有可能获得较多的基因敲除纯合子小鼠.结果SRC-3杂合子小鼠的饲养和繁殖均获得成功,亦获得了较多的基因敲除纯合子小鼠.结论正确的饲养繁殖以及鉴定方法是从杂合子中获得SRC-3基因敲除纯合子小鼠的有效途径.     

Alk-SMase基因敲除小鼠的饲养繁殖及鉴定

目的 :为了繁育和鉴定碱性鞘磷脂酶(Alkaline sphingomyelinase,alk-SMase)基因敲除小鼠,将引进的基因敲除小鼠进行饲养繁殖,杂合子、纯合子用于继续保种。方法:对其幼鼠剪尾提取基因组DNA,采用PCR方法进行基因型鉴定;取alkSMase表达组织做HE染色进行形态学比较。结果 :对引进小鼠已成功饲养和繁殖,并得到纯合alk-SMase基因缺失型小鼠。结论:正确的饲养、繁殖及基因鉴定方法对于基因敲除小鼠的获得和保种具有重要的意义。     

ASIC1基因敲除小鼠的繁殖及基因鉴定

饲养并繁殖酸敏感离子通道1(ASIC1)基因敲除杂合子小鼠,提取小鼠尾部组织DNA,采用聚合酶链反应( PCR)方法鉴定子代小鼠基因型. ASIC1 基因敲除小鼠的繁育和鉴定均获得成功,子代小鼠基因型分别为杂合子( ASIC1+/-)、纯合子( ASIC1-/ -)和野生型( ASIC1+/ +).     

补体C3基因敲除小鼠基因型鉴定的PCR条件优化

目的对补体C3基因敲除小鼠基因型鉴定的PCR反应体系及扩增程序进行优化,检测PCR优化体系的适用性和灵敏性。方法通过改进引物设计、改变PCR反应过程中Mg2＋浓度、引物浓度、退火温度、模板DNA浓度及反应循环次数,分析比较PCR扩增效果。结果优化后的补体C3基因敲除小鼠基因型鉴定的PCR反应体系中,Mg2＋浓度在2-4mmol/L,引物浓度在0.025-0.4μmol/L,循环次数在30-45次之间均能扩增得到清晰均一的特异性条带;同时,引物退火温度在55.5℃-69.6℃范围内均适用;优化后PCR体系能够检测的最低DNA浓度为1.41ng/μl,即模板DNA在反应体系中的总量为约2.82ng.结论已经建立的优化后的PCR基因扩增体系特异性高且稳定可靠。     

FMR1基因敲除小鼠的繁殖及基因鉴定

目的繁殖和鉴定脆性X智力低下蛋白基因敲除小鼠。方法引进FMR1基因敲除小鼠,提取每只小鼠尾部基因组DNA,用PCR法进行鉴定,获得的雄性纯合子子代小鼠与杂合子雌鼠进行交配。结果 FMR1基因敲除小鼠的饲养和繁殖获得成功,获得较多的基因敲除纯合子小鼠。结论正确的饲养繁殖以及鉴定方法是获得FMR1基因敲除纯合子小鼠的有效途径。     

鞘氨醇激酶2(SphK2)基因敲除小鼠繁殖及基因型鉴定

目的 繁殖和快速鉴定鞘氨醇激酶2(SphK2)基因敲除小鼠.方法 将SphK2敲除杂合子小鼠进行配种繁殖,提取子代小鼠尾部DNA,用PCR方法检测子代小鼠基因型.结果 SphK2杂合子小鼠的饲养及繁殖均获得成功,获得子代小鼠,基因型分别为杂合子(SphK2+/-)、纯合子(SphK2-/-)和野生型(SphK2+/+).结论 SphK2基因敲除小鼠的繁育和鉴定均获得成功,为进一步研究SphK2生物学功能提供了理想的动物模型.     

水通道蛋白3基因敲除小鼠的饲养繁殖及鉴定

目的: 繁殖和鉴定水通道蛋白3(AQP-3)基因敲除小鼠。方法: 将引进的杂合子小鼠进行饲养并繁殖,繁殖成功后其子代中将会出现野生型、杂合子以及纯合子3种基因型,提取每种基因型小鼠尾部基因组DNA,用PCR法进行鉴定,将其雄性纯合子与雌性杂合子交配,依照孟德尔遗传定律就有可能获得较多的基因敲除纯合子小鼠。结果: AQP-3杂合子小鼠的繁殖和饲养均获得成功,亦获得了较多的基因敲除纯合子小鼠。结论: 正确的饲养繁殖以及鉴定方法是从杂合子中获得AQP-3基因敲除纯合子小鼠的有效途径。     

类固醇受体辅活化子-1基因敲除小鼠的繁殖与筛选

目的 繁殖和鉴定SRC-1基因敲除小鼠.方法 将所引进的雄性野生型小鼠和雌性SRC-1基因敲除小鼠进行交配繁殖,繁殖成功后其子代均为杂合子,杂合子和杂合子再交配就可以得到野生型、杂合型及纯合子3种基因型,提取每只小鼠尾部基因组DNA,用PCR法进行鉴定,一旦获得雌性和雄性纯合子,其子代就均为纯合子.结果 SRC-1小鼠的饲养和繁殖均获得成功,亦成功获得了较多的SRC-1基因敲除纯合子小鼠.结论 正确的饲养繁殖以及筛选方法,可以获得较多的SRC-1基因敲除纯合子小鼠.     

雌激素β受体在成年雄性大鼠脑内的免疫组化定位研究

目的 为了研究雌激素作用于神经系统的机制,研究了近年发现的雌激素β受体免疫阳性物质在雌性大鼠脑内的分布。方法 应用免疫组化S－P法并结合硫酸镍铵增强显色技术。结果 ①免疫阳性物质主要位于神经元的细胞核内,部分细胞的核周质和突起内也有浅谈的着色;也有部分神经元仅仅胞浆呈阳性;②最强阳性信号见于前嗅核、大脑皮质、斜角带垂直部、小脑浦肯野细胞、上丘各部、动眼神经核、红核、蓝斑、三叉神经运动核以及斜方体内、外侧核;中等强度的染色见于斜角带水平部、终纹床核、视前内侧核、乳头体内侧核以及黑质;较弱的阳性细胞见于下丘脑核团、未定带、杏仁复合体的部分核团以及脑桥网状核后部;微弱的阳性信号见于隔外侧核、苍白球、嗅结节岛、海马。结论 雌激素β受体在成年大鼠脑组织内有广泛的分布,在脑组织内雌激素可能通过β受体这一新的信号途径发挥多种重要的调控作用。     

雌激素受体α基因多态性与原因不明月经过少的相关性研究

目的:探讨西南地区雌激素受体α(estrogen receptor α,ERα)基因多态性与原因不明月经过少的关系。方法:选择西南地区100名原因不明月经过少患者为实验组,100名月经正常者作为正常对照组。应用分子生物学的方法分析ERα基因1号内含子内切酶PvuⅡ,XbaⅠ限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP),观察ERα基因多态性基因型在实验组与对照组中的基因型分布。结果:P基因型频率实验组为47.5%,对照组为30.5%(OR=1.810,P=O.012)。X基因型频率实验组为20.5%,对照组为32.0%(OR=0.641,P=0.036);PvuII和XbaI限制性片段长度多态性在两组中均呈多态性分布。结论:ERα基因多态性与原因不明月经过少有关,P等位基因可能是其危险因素;X等位基因可能是其保护因素。     

雌激素受体2基因多态性与绝经后女性骨密度的相关性研究

目的探讨雌激素受体2(estrogen receptor beta,ESR2)基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)与绝经后女性的骨密度(bone mineral density,BMD)是否相关。方法使用双能X线骨密度仪测量重庆市140例绝经后女性第2～4腰椎(L2～L4)及左股骨颈BMD值。采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术分析ESR2基因第5外显子T1057G和G1082A及第8外显子G1730A SNPs。结果在全部受试者中,ESR2基因第5外显子1057T位点仅检测到VV1种基因型;G1082A基因型RR、Rr及rr频率分别为81.43%、17.14%及1.43%;G1730A基因型AA及Aa频率分别为87.86%及12.14%,aa基因型缺失;G1082A和G1730A SNPs的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。校正年龄、体质量、绝经年限等BMD影响因素后,G1082A SNP与L2和L4BMD显著相关(P<0.05),而与L3及股骨颈BMD无明显关联(P>0.05);G1730ASN...     

雌激素受体β基因多态性与原因不明月经过少的关系

目的:探讨西南地区雌激素受体β(ER-β)基因多态性与原因不明月经过少的关系。方法:选择西南地区100名原因不明月经过少患者为实验组,100名正常月经者作为对照组。应用分子生物学的方法研究ER-β基因RsaI和AluI限制性片段长度多态性和5号内含子的高变区CA重复序列多态性在实验组与对照组中分布。结果:RsaI和AluI限制性片段长度多态性在两组中均呈多态性分布。分离出9种CA重复序列等位基因,正常组和实验组的等位基因的分布频率差异无显著性。以重复次数n≤20作为SS型,n>20为LL型,再比较两组病人SS型和LL型等位基因的分布频率,差异有显著性。结论:ER-β基因多态性与原因不明月经过少有关,R等位基因可能是其保护因素,SS型等位基因可能是原因不明月经过少的危险因素。     

乳腺癌中p~(53)基因的表达及与雌激素受体的关系

目的　研究乳腺癌中 p53 基因的表达对乳腺癌生物学行为影响的意义。方法　应用S -P免疫组织化学方法对 5 4例乳腺癌石蜡包埋组织进行检测 ,研究乳腺癌组织中p53 基因的表达率、表达特点与临床病理和雌激素受体 (ER)的关系。结果　在人的乳腺癌中 p53 蛋白阳性染色主要位于细胞核中 ,阳性表达率为 5 5 .6 % ;ER阳性表达率为 46 .3% ;p53 基因阳性表达与乳腺癌组织学分级呈正相关 (P <0 .0 5 ) ;与临床病理分期无关 (P >0 .0 5 ) ;与淋巴结是否发生转移呈正相关 (P <0 .0 5 ) ;与ER受体表达呈负相关 (P <0 .0 5 )。结论　p53 基因突变参与了乳腺癌的发生和发展 ;p53 蛋白抑制了乳腺癌ER的分化。     

Relationship between estrogen receptor gene polymorphism and clinical indexes as-sociated with coronary heart disease ＊

Objective: To investigate the relationship between estrogen receptor (ER) gene and the clinical indexes associated with coronary heart disease ( CHD). Methods: By means of polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) , we analyzed ER gene polymorphism in 84 CHD patients and 61 healthy subjects and non-CHD inpatients. The clinical indexes associated with CHD were analyzed in relation to the three ER genotypes. Results: There were significant differences in the incidence of hypertension (58.62% ), fibrinogen (Fib) concentration (3. 5±0. 8 g/L) , body mass index (BMI, 25. 1±3. 2) , HDL-C concentration (1.0±0. 2 mmol/L) between PP genotype group and other genotype groups (P <0. 05). Conclusion: ER gene polymorphism may affect ER-mediated cardiovascular protective effect by modulating the expression of ER.     

雌激素受体a基因PvuⅡ和XbaI多态性与子痫前期相关性研究

目的：研究雌激素受体Ot（ERa）基因PvuⅡ和XbaI酶切位点多态性,从遗传学角度探讨其在子痫前期（preeclampsia,PE）发生及发展中的作用,并筛选易感基因,为PE的诊断和治疗提供科学依据。方法：PE组为南京地区135例诊断为PE的患者,组内进一步分为轻度PE组（n=64）和重度PE组（n=71）;选取南京地区122例年龄、孕周与PE组均无统计学差异的正常孕妇作对照组。采用聚合酶链反应一限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术检测ERa基因PvuⅡ和XbaI酶切位点的多态性。结果：（1）ERa基因PP、Pp、pp基因型实验组分别为20例（14．81％）、62例（45．93％）、53例（39．26％）,其中轻度PE组分别为12例（18．75％）、27例（42．19％）、25例（39．06％）,重度PE组分别为8例（11．27％）、35例（49．29％）、28例（39．44％）;对照组分别为13例（10．65％）、44例（36．07％）、65例（53．28％）。等位基因P、P实验组分别为102例（37．78％）、168例（62．22％）,其中轻度PE组分别为51例（39．84％）、77例（60．16％）,重度PE组分别为51例（35．92％）、91例（64．08％）;对照组分别为70例（28．69％）、174例（71．31％）。ERa基因PvuⅡ酶切位点的基因型分布PE组与对照组之间及PE组组内差异均无统计学意义（组间P=0．077,PE组组内P=0．440）;等位基因频率分布PE组与对照组之间比较差异有统计学意义（P=0．029）,但PE组组内比较差异无统计学意义（P=0．506）。（2）ERa基因XbaI酶切位点基因型（XX、Xx、XX）及等位基因（X,X）频率分布在PE组与对照组之间及PE组组内差异均无统计学意义（组间：基因型P=0．736,等位基因P=0．602;组内：基因型P=0．152,等位基因P=0．172）。结论：（1）ERa基因PvuⅡ酶切位点多态性与PE的发生存在一定的相关性,P等位基因可能是其危险因素,携带P等位基因的孕妇可能更易发展成为PE。（2）ERa基因XbaI酶切位点多态性与PE的发生无明显关联。（3）ERa基因的PvuⅡ及XbaI酶切位点多态性与PE的病变程度无明显相关。     

卵巢切除对小鼠基底前脑内雌激素β受体表达的影响

目的 研究卵巢雌激素对小鼠基底前脑内雌激素β受体（ER－β）表达的影响，探讨雌激素作用于基底前脑的机制。方法 以切除卵巢的小鼠为模型，采用硫酸镍铵增强显色的免疫组化SP法检测基底前脑内ER－β表达的变化。结果 卵巢切除使小鼠基底前脑内ER－β表达降低，第3天到最低水平，然后逐渐恢复，第20天后基本上达到这水平。结论 卵巢雌激素使小鼠基底前脑内ER－β表达表达呈时间依赖性改变，并可能通过ER－β这一新的受体途径发挥对该部位神经结构与功能的调控。