小鼠釉丛蛋白成熟肽编码区cDNA克隆

克隆小鼠釉丛蛋白成熟肽编码区基因。方法：设计引物,以小鼠牙胚ｃＤＮＡ文库为模板,利用ＰＣＲ方法,扩增出小鼠釉丛蛋白成熟区的基因片段,将所得基因片段插入ｐＢＳ质粒载体,转化到大肠杆菌ＸＬ－１－Ｂｌｕｅ后挑选阳性克隆,提取重组质粒ＤＮＡ,通过限制性酶切和部分核苷酸序列分析鉴定性克隆。结果：重组质粒ｐＢＳ－ｔｕｆｔｅｌｉｎ的酶切图谱和序列分析结果与国外文献报道一致。结论：克隆到小鼠釉丛蛋白成熟编码区基因     

小鼠成釉蛋白成熟肽编码区cDNA序列的克隆

目的：克隆小鼠成釉蛋白（ＡＭＢＮ）成熟肽编码区基因。方法：用异硫氰酸胍一步法从昆明新生小鼠磨牙牙胚组织中抽提总ＲＮＡ,用Ｏｌｉｇｏ（ｄｔ）作引物逆转录合成牙胚ｃＤＮＡ,然后利用ＰＣＲ方法,从ｃＤＮＡ中扩增出小鼠成釉蛋白成熟区的基因片段（约１．１ｋｂｐ）,将所得基因片段插入ｐＴＺ１８质粒载体,转化到大肠杆菌ＤＨ５α后挑选阳性克隆,提取重组质粒ＤＮＡ,通过限制性酶切和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果：重组质粒ｐＴＺ－ＡＭＢＮ的酶切图谱和部分序列分析结果与国外文献报道一致。结论：克隆到小鼠成釉蛋白成熟肽编码区基因     

小鼠釉原蛋白成熟肽编码区cDNA的克隆和部分序列分析

目的：克隆小鼠釉原蛋白（ＡＭＧ）成熟肽编码区基因。方法：用异硫氰酸胍一步法从昆明新生小鼠磨牙牙胚组织中抽提总ＲＮＡ,用Ｏｌｉｇｏ（ｄｔ）作引物逆转录合成牙胚ｃＤＮＡ,然后利用ＰＣＲ方法,从ｃＤＮＡ中扩增出小鼠釉原蛋白成熟区的基因片段（约６７０ｂｐ）,将所得基因片段插入ｐＢＳ质粒载体,转化到大肠杆菌ＤＨ５α后挑选阳性克隆,提取重组质粒ＤＮＡ,通过限制性酶切和部分核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果：重组质粒ｐＢＳ－ＡＭＧ的酶切图谱和序列分析结果与国外文献报道一致。结论：克隆到小鼠釉原蛋白成熟肽编码区基因。     

小鼠牙本质涎蛋白成熟肽编码区cDNA克隆和部分序列分析

目的：克隆小鼠牙本质涎蛋白（ＤＳＰ）成熟肽编码区基因。方法：用异硫氰酸胍一步法从昆明新生小鼠磨牙牙胚组织中抽提总ＲＮＡ,用Ｏｌｉｇｏ（ｄｔ）作引物逆转录合成牙胚ｃＤＮＡ,然后利用ＰＣＲ方法,从ｃＤＮＡ中扩增出小鼠ＤＳＰ成熟区的基因片段（约１．４ｋｂｐ）,将所得基因片段插入ｐＢＳ质粒载体,转化到大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ后挑选阳性克隆,提取重组质粒ＤＮＡ,通过限制性酶切和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果：重组质粒ｐＢＳ－ＤＳＰ的酶切图谱和部分序列分析结果与国外文献报道一致。结论：克隆到小鼠ＤＳＰ成熟肽编码区基因,正在进行该基因的表达和活性鉴定。     

小鼠成釉蛋白基因cDNA全序列的克隆

目的 筛选与小鼠牙胚发育相关的特异基因。方法 利用随机引物、反转录酶合成特异和非特异探针，采用差异显示方法筛选小鼠牙胚cDNA文库，挑选阳性克隆并测序。结果 得到6个阳性克隆，经测序证实其中1个克隆序列与大鼠成釉蛋白序列高度同源：其中用pTriplEX 3′引物测得的526个碱基序列与大鼠成釉蛋白基因5′端的32－580序列有497个碱基一致，5′引物测得的567个碱基序列与大鼠成釉蛋白基因3′端的1285－1854序列有533个碱基一致。结论 筛选到小鼠釉基质特异蛋白－成釉蛋白基因的cDNA全序列。     

小鼠牙本质涎蛋白成熟肽编码区cDNA 隆和部分序列分析

目的：克隆小鼠牙本质涎蛋白（ＤＳＰ）成熟肽编码区基因。方法：用异硫氰酸胍一步法从昆明新生小鼠磨睡胚组织中抽提总ＲＮＡ,用Ｏｌｉｇｏ（ｄｔ）作引物逆转录合成牙胚ｃＤＮＡ,然后利用ＰＣＲ方法,从ｃＤＮＡ中扩增出小鼠ＤＳＰ成熟区的基因片段（约１．４ｋｂｐ）,将所得基因片段插入ｐＢＳ质粒载体,转化到大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ后挑选阳性克隆,提取重组质粒ＤＮＡ,通过限制性酶切和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果     

犬IGF-I编码区cDNA克隆及其序列分析

目的：克隆犬胰岛素样生长因子(IGF—Ⅰ)编码区基因，构建重组真核表达载体。方法：从犬左心室组织中提取总RNA，通过RT—PCR获取IGF—1 cDNA编码区全序列，将其与pcDNA3．1( )质粒载体连接，构建重组真核表达载体pcDNA3．1( )／IGF—1，转化大肠杆菌DH5α后，随机挑选数个克隆，提取质粒DNA，通过限制性酶切和核苷酸序列鉴定阳性克隆。结果：重组质粒pcDNA3．1( )／IGF—1的酶切图谱和序列分析结果与国外文献报道一致。结论：克隆到IGF—1编码区基因，成功构建重组真核表达载体pcDNA3．1( )／IGF—1。     

成骨蛋白—1成熟蛋白编码区cDNA克隆与序列分析

目的：克隆成骨蛋白－１（ＯＰ－１）成熟蛋白编码区基因。方法：用一步酸酚法从中国健康人胎盘组织中提取总ＲＮＡ，用Ｏｌｉｇｏ（ｄｔ）作引物逆转录合成胎盘ｃＤＮＡ文库，然后利用ＰＣＲ的方法，从ｃＤＮＡ文库中扩增出编码人ＯＰ－１成熟区的基因片段，将所得基因片段插入ｐＧＥＭ－３ｚｆ（＋）载体，转化大肠杆菌后挑选阳性克隆，提取双链ＤＮＡ模板，用ＡＢＩＤＮＡ自动测序仪进行序列测定分析。结果：克隆和测序结果与国外文献报道一致。结论：在国内第一次克隆到ＯＰ－１的成熟蛋白编码区基因。     

小鼠牙本质涎磷蛋白成熟蛋白编码区cDNA克隆与部分序列分析

目的 克隆小鼠牙本质涎磷蛋白（ｄｅｎｔｉｎ ｓｉａｌｏｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ,ＤＳＰＰ）成熟蛋白编码区基因。方法 用异硫氰酸胍一步法从昆明新生小鼠磨牙牙胚组织中抽提总ＲＮＡ,用Ｏｌｉｇｏ（ｄｔ）作引物逆转录合成牙胚ｃＤＮＡ,然后利用ＰＣＲ方法,从ｃＤＮＡ中扩增出小鼠ＤＳＰＰ成熟区的基因片段（约３ｋｂｐ）,将所５得基因片段插入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ质粒载体,转化到大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ     

牙胚中上游刺激因子部分序列的cDNA克隆

目的：克隆牙胚中上游刺激因子（upstream stimulatory factor,USF)基因编码区特异片段。方法：从生后5d balb/c鼠牙胚中抽提总RNA，用随机引物逆转录合成cDNA，然后 用PCR方法借助特异性引物以cDNA中扩增小鼠USF1基因片段（289bp），电泳检测、回收目的片段，将所得的基因片段连接至Teasy质粒载体，并转化到大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆，扩大培养，提取重组质粒DNA，酶切分析和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果：酶切图谱显示质粒重组，克隆成功，序列分析结果与国外报道一致。结论：在牙胚中克隆到USF1基因片段。     

小鼠Dlx-5 cDNA的克隆及序列测定

目的 :扩增小鼠Dlx 5的特异性片段 ,构建重组质粒并进行序列测定 ,为进一步的蛋白表达、抗体制备、基因转染等研究奠定基础。方法 :提取E14d小鼠的下颌弓组织总RNA ,以反转录cDNA为模板进行PCR反应 ,克隆Dlx 5至PMD 18T载体上并测序。结果 :从胎鼠下颌弓组织中克隆到Dlx 5基因片段约 869bp ,重组质粒经酶切显示获得正确重组子 ,测序结果与已知序列吻合。结论 :成功地从小鼠下颌弓中克隆到了Dlx 5基因 ,提示胎鼠的下颌弓组织中有Dlx 5基因的表达。     

四种生长因子对体外培养的人牙乳头细胞表达核心结合因子a1的研究

目的：探讨4种生长因子对体外培养的人牙乳头细胞中核心结合因子a1（core binding factor al，cbfal）表达的影响。方法：体外培养人牙乳头细胞，转染pcDNA3-cbfal重组质粒，G418筛选建立稳定表达cbfal的细胞模型PC-3，分别在正常细胞和PC-3细胞中加入不同浓度的BMP-2、TGF-β1、FGF-2、EGF，采用RT-PCR、Western blot、免疫组织化学的方法，观察这4种生长因子在人牙乳头细胞中对cbfal基因表达、蛋白合成、蛋白表达部位的影响。结果：200ng／mLBMP-2和50ng／mL的FGF-2刺激正常人牙乳头细胞6h后cbfal的表达明显升高，而20和40ng／mL的TGF-β1作用12h，能抑制稳定转染cbfal基因的细胞中cbfal mRNA的表达；EGF则对人牙乳头细胞中cbfal的表达没有显著影响。结论：BMP-2和FGF-2可以上调人牙乳头细胞中cbfal的表达，TGF-β1对cbfal的表达有抑制作用，EGF则对人牙乳头细胞中cbfal的表达没有显著影响。     

cbfa1在人牙乳头细胞中的免疫组织化学研究

目的：构建pcDNA3-cbfal重组质粒，瞬时转染人牙乳头细胞，观察cbfal在转染前后的表达。方法：用EcoRV和XbaⅠ双酶切pcDNA3空载体和pGEM-5z-f-cbfal质粒，电泳回收后进行连接，连接产物转化DH5α，进行酶切鉴定和PCR分析。采用脂质体法瞬时转染人牙乳头细胞，制备细胞爬片。免疫组织化学染色。结果：共挑出7个阳性转化子，酶切和PCR分析结果均显示重组质粒构建成功。正常人牙乳头细胞中cbfal表达阴性，瞬时转染24h后，cbfal表达阳性。结论：成功构建了pcDNA3-cbfal真核表达载体。人牙乳头细胞无cbfal的表达，当转染正义的cbfal重组质粒后出现cbfal的表达。为进一步研究cbfal在牙乳头细胞中的作用奠定了基础。     

小鼠牙本质磷蛋白cDNA的克隆和部分序列分析

目的：克隆小鼠牙本质磷蛋白（ＤＰＰ）ｃＤＮＡ。方法：用异硫氰酸胍一步法从小鼠牙胚组织中抽提总ＲＮＡ,用ｏｌｉｇｏ（ｄｔ） 作引物逆转录合成牙胚ｃＤＮＡ,然后利用ＰＣＲ 方法,从ｃＤＮＡ 中扩增出小鼠ＤＰＰｃＤＮＡ基因片段（ 约１ ．６ｋｂ）,将所得基因片段插入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ 质粒载体,转化到大肠杆菌ＸＬ１ － Ｂｌｕｅ 后挑选阳性克隆,提取重组质粒ＤＮＡ,通过酶切分析和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果：酶切图谱和部分序列分析结果与国外文献报道一致。结论：克隆到小鼠ＤＰＰｃＤＮＡ 基因片段。     

人成釉蛋白编码区cDNA的克隆和N端肽的融合表达

目的 :克隆人成釉蛋白 (Ameloblastin)编码区基因并原核表达其N端肽。方法 :抽提人牙胚总RNA ,用Oligo(dt)作引物逆转录合成人牙胚cDNAs,然后利用PCR方法 ,从cDNAs中扩增出人成釉蛋白编码区cDNA序列 ,将所得基因片段插入 pGEM -TEasy质粒载体 ,转化入大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆 ,提取重组质粒DNA ,通过限制性酶切和核苷酸序列测定鉴定阳性克隆。将所克隆序列的 5’端 5 5 8bp的片段连入原核表达载体 pGEX - 4T1并在大肠杆菌中诱导表达 ,SDS -PAGE分析。 结果 :克隆片段测序结果与GenBank数据库收录的序列一致 ,经诱导表达见Mr为 4 6× 10 3 的融合蛋白。结论 :克隆到人成釉蛋白编码区cDNA ,并在大肠杆菌中表达了人成釉蛋白N端肽     

Runx2/cbfa1在人牙胚发育过程中的表达

观察核心因子Runx2/cbfa1在人牙胚发育过程中的表达,探讨cbfa1在牙齿发育过程中的作用。方法:制备人牙胚发育各期标本,免疫荧光法观察cbfa1在人牙胚发育过程中的表达情况。结果:在牙胚发育的不同时期均可见不同的时空表达模式。蕾状期表达比较广泛;帽状期内外釉上皮细胞和牙囊中呈强阳性表达,中间层也为强阳性,牙乳头为弱阳性;钟状早期,前成牙本质细胞处有强阳性表达;钟状中后期,成釉细胞为强阳性,成牙本质细胞为阴性,而牙囊部位仍为强阳性。结论:Runx2/cbfa1转录因子在人牙胚整个发育过程中的表达状况,提示该因子可能在牙胚各期的发育起一定作用,参与了各种成牙相关细胞的分化和硬组织的形成。     

cbfa1反义核酸对体外培养小鼠牙胚发育的影响

目的：采用反义核酸技术，用特异的、与cbfa1 mRNA互补的AS—ODN，抑制cbfa1在体外培养牙胚的翻译，观察它对牙齿发育及矿化的影响，探讨其在牙齿发育中的作用。方法：设计合成cbfa1反义核酸，应用所建立的牙胚体外培养体系，用光镜和电镜观察小鼠牙胚被cbfa1反义核酸阻断表达后发育的情况。结果：在缺乏cbfa1情况下，与对照组相比，实验组牙胚在体外虽然可以继续生长发育至钟状晚期，但形成的基质较薄，且基质中胶原纤维排列稀疏，粗细不等，方向杂乱。此外，成釉细胞与成牙本质细胞的发育均显幼稚。结论：cbfa1可能不仅仅参与了牙齿的矿化，还在成牙本质细胞和成釉细胞的分化中起重要的作用。     

cbfa1反义核酸对体外培养小鼠牙胚发育与矿化的影响

目的:采用反义核酸技术,用特异的与cbfa1mRNA互补的AS ODN抑制cbfa1在体外培养牙胚的翻译,利用电镜及ALP、OC等指标观察其对牙齿发育及矿化的影响,探讨其在牙齿发育中的作用。方法:设计合成cbfa1反义核酸,应用所建立的牙胚体外培养系统,用电镜观察小鼠牙胚被cbfa1反义核酸阻断表达后发育的情况,并且检测ALP、OC表达量的变化。结果:在缺乏cbfa1的情况下,与对照组相比,形成的基质较薄,且基质中胶原纤维排列稀疏,粗细不等,方向杂乱,ALP、OC表达量均有明显变化。结论:cbfa1可能是通过调控ALP和OC等靶基因的表达参与了牙齿发育矿化过程。     

小鼠PeriostinC端编码区cDNA克隆及其序列分析

目的：从小鼠牙周膜组织中克隆PerostinC末端编码区基因。方法：用异硫氰酸胍一步法从昆明成年小鼠牙周膜组织中抽提总RNA,用Oligo(dt)作引物逆转录合成cDNA,然后利用PCR技术,从cDNA中扩增出小鼠PeriostinC末端编码区的基因自然（约940bp）,将所得基因片段插入p RSET-B载体,转化大肠杆菌DH5α后随机挑选数个克隆,提取质粒DNA,通过限制性酶切和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果：重组质粒pRSET-B-Periostin的酶切图谱和序列分析结果与国外文献报道一致。结论：克隆到小鼠该蛋白C端编码区基因。