原代培养乳鼠窦房结细胞的形态学研究

目的 通过对原代培养乳鼠窦房结细胞进行光、电镜观察，了解培养窦房结细胞的形态结构特征。方法 取新生24h Wistar乳鼠的窦房结组织，用差速贴壁结合BrdU处理进行原代细胞纯化培养。结果 在培养的窦房结细胞中观察到有3种不同形态的细胞，即梭形细胞、三角形细胞与不规则形细胞，其中梭形细胞最多，博动频率最快，肌原纤维稀疏排列紊乱，细胞器不发达；三角形细胞与心房肌三角形细胞特征相似。结论 在培养的乳鼠窦房结细胞中，细胞体积小搏动频率快的细胞即是窦房结的起搏细胞。     

原代培养乳鼠窦房结细胞的形态和kir2.1蛋白表达

目的 研究乳鼠窦房结细胞中kir2.1蛋白表达水平,建立一套可靠的乳鼠窦房结定位、细胞培养与鉴定技术,为进一步心脏生物起搏实验奠定基础.方法 在石蜡切片中用HE染色、嗜银染色、髓鞘染色和Mallory磷钨酸-苏木素染色法(PTAH)进行乳鼠窦房结定位和形态学观察;取SD乳鼠的窦房结组织进行原代细胞培养,观察培养细胞的形态和搏动频率,免疫组织化学检测其kir2.1蛋白表达.结果 综合嗜银染色、髓鞘染色和PTAH染色3种方法可准确定位乳鼠窦房结组织.在培养的窦房结细胞中观察到梭形细胞、三角形细胞和不规则形细胞3种有自发性收缩的细胞,其中梭形细胞最多且形态结构特点和搏动频率符合起搏细胞的特点,三角形和不规则细胞与心房肌细胞特征相似.乳鼠窦房结细胞的kir2.1蛋白表达低于心房和心室肌细胞.结论 综合嗜银染色、髓鞘染色和PTAH染色3种方法可以准确定位SD乳鼠窦房结,乳鼠窦房结细胞中kir2.1蛋白表达水平低于心房和心室肌细胞.     

HCN4基因修饰大鼠MSCs体外诱导获得的心脏起搏样细胞动作电位检测

目的 探讨超极化激活及环化核苷酸调控的阳离子通道亚型4(hyperpolarization-activated cyclic nucleotidegated cation channel 4,HCN4)基因修饰大鼠MSCs体外诱导分化的心脏起搏样细胞的动作电位特性.方法 以HCN4基因修饰大鼠MSCs体外诱导获得的具有自发搏动的心脏起搏样细胞为实验组,同期培养的原代乳鼠窦房结细胞为对照组,采用全细胞膜片钳技术对两组细胞的动作电位进行检测.结果 心脏起搏样细胞及原代培养乳鼠窦房结细胞均可记录到具有舒张期自动去极化的动作电位,心脏起搏样细胞的动作电位特性与原代培养的乳鼠窦房结细胞相比,其静息电位、动作电位幅度及动作电位周期均无显著性差异(P＞0.05),但阈电位较原代培养的乳窦鼠房结细胞显著降低(P＜0.01).结论 从电生理角度证实,心脏起搏样细胞的特性与原代培养的乳鼠窦房结细胞相似.     

连续植块培养原代成骨细胞及其特性的比较

目的: 探讨简便、经济、高效的原代成骨细胞培养方法,并比较其特性.方法: 收集1～4次连续植块培养获得的SD乳鼠颅盖骨原代成骨细胞,观察第1～4次连续植块培养获得的成骨细胞在细胞形态、分裂增殖、碱性磷酸酶(ALP)活性及骨钙素和BMP-2免疫组织化学表达的变化.结果:连续植块培养收集的1～4次原代成骨细胞,在细胞贴壁、变形、铺展、汇合时间,Gomori改良钙-钴法ALP活性,骨钙素及BMP-2免疫组织化学染色表达上,均没有明显的区别.结论: 连续植块培养可获得与植块培养性状相同的SD乳鼠原代成骨细胞,且细胞数量多,节约经费、时间,操作简便.     

乳鼠软骨细胞体外培养及生物学特性研究

目的:研究体外培养乳鼠胸骨剑突软骨细胞的原代培养方法,探讨该方法应用的可行性和应用价值.方法:采用胶原酶消化法分离培养乳鼠胸骨剑突软骨细胞,以含20%胎牛血清的高糖DMEM培养液进行培养,并进行细胞接种与传代,用倒置显微镜、电镜及组织学方法观察细胞形态、超微结构.细胞采用ABC法进行Ⅱ型胶原免疫组化染色以及细胞形态观察鉴定软骨细胞起源.结果:(1)原代培养软骨细胞48 h后,大量细胞贴壁生长,呈圆形、长梭形或有2～3个突起,胞质透亮、饱满,7 d后细胞铺满整个培养皿底面.(2)原代软骨细胞呈圆形或多角形,第4代有一半变成梭形,第5代绝大部分变为长梭形;原代软骨细胞胞浆内粗面内质网和线粒体丰富,第3代软骨细胞生长增殖能力强于原代,第5代增殖能力明显减弱.结论:体外培养的乳鼠剑突软骨细胞保持了其体内的基本特征,采用胶原酶消化法分离培养软骨细胞是一种可靠、简便、快速的细胞原代分离培养方法.第3代软骨细胞适合用于软骨组织工程及学术研究.     

模拟缺血预适应对原代培养乳鼠窦房结细胞缺血再灌注损伤的保护作用

目的通过观察不同时间、不同次数的模拟短暂缺血刺激对随后较长时间缺血/再灌注乳鼠窦房结细胞活性的影响,以探讨模拟缺血预适应(IP)对原代培养乳鼠窦房结细胞的保护作用.方法取培养2 d的窦房结细胞,分为对照组、模拟缺血/再灌注(I/R)组及IP1(缺血5 min/再灌注5 min)组、IP2(5 min/5 min×2)组、IP3(5 min/5 min×3)组、IP4(10 min/10 rmin)组、IP5(10min/10min×2)组、IP6(10min/10min×3)组、IP7(20 min/20min)组、IP8(20 mir/20min×2)组、IP9(20 min/20min×3)组,在模拟缺血3 h/再灌注4 h结束后,通过PI染色及MTT比色法检测各组乳鼠窦房结细胞PI染色阳性率及D490值的变化.结果①各实验组乳鼠窦房结细胞D490值均较对照组明显降低(P＜0.01),但IP2组、IP3组、IP4组、IP5组及IP7组D490值却较I/R组明显升高(P＜0.01).②各实验组PI染色阳性窦房结细胞百分率均较对照组明显增高(P＜0.01),但IP2组、IP3组、IP4组、IP5组及IP7组PI染色阳性率却较I/R组显著降低(P＜0.01).结论模拟IP对随后较长时间I/R的乳鼠窦房结细胞具有保护效应,而这种保护作用的产生可能与累计的模拟缺血刺激"总时程"有关.     

KATP通道开放剂对培养乳鼠窦房结细胞模拟缺血时L-型钙电流的影响

目的：观察ATP敏感性钾（KATP）通道开放剂对原代培养的乳鼠窦房结细胞模拟缺血时L型钙电流（L－ICa)的影响以探讨其保护作用机制。方法：取培养2d的原代窦房结细胞,运用常规全细胞膜片钳技术,采用灌流方法研究KATP通道开放剂Pinacidil和Diazoxide对缺血窦房结细胞L－Ica的作用,结果：模拟缺血4h可使窦房结细胞LI－ICa密度显著减少（P＜0．01）,电流密度－电压曲线下移;Pinacidil及Diazoxide则能使缺血的窦房结细胞L－ICa密度明显增加（P＜0．01）,电流密度－电压曲线上移,但两组间无明显的统计学差异,选择性线粒体KATP通道阻官剂5－HD能消除Pinacidil及Diazoxide的上述作用。结论：Pinacidil和Diazoxide可能通过开放缺血窦房结细胞线粒体KATP通道来增加L－ICa密度从而对细胞产生保护作用。     

神经细胞的原代培养及缺血再灌注模型的建立

目的:建立良好的SD乳鼠神经细胞原代培养及缺血再灌注模型。方法:选用SD乳鼠大脑皮质进行细胞培养,采用机械研磨、过滤、胰酶消化、percoll(硅石胶态悬浮液)、密度梯度离心法分离纯化大脑皮质细胞后,选择含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基进行原代培养。利用分离纯化的幼鼠大脑皮质,制作细胞爬片,利用免疫组化进行鉴定。结果:大脑皮质细胞贴壁生长,4～7d基本达到融合,结合形态学及免疫细胞化学鉴定,原代细胞培养97%为神经细胞。而后采用国际上公认的氧糖剥夺发制作缺血再灌注模型。结论:采用机械研磨、过滤、胰酶消化结合percoll:密度梯度离心法分离培养的大脑皮层神经细胞数量多,均一性生长佳,采用国际上公认的氧糖剥夺发制作缺血再灌注模型。为以后实验打下基础。     

梅花鹿免疫细胞活性因子对细胞增殖的促进作用

目的:研究梅花鹿免疫细胞活性因子(SIAF)对组织培养细胞的促增殖活性.方法:采用MTT比色法测定SIAF对FL细胞、L929细胞及原代培养的大鼠乳鼠心肌细胞促增殖活性.结果:SIAF对以上各细胞有显著的促增殖作用.结论:SIAF具有生长因子样活性.     

用于膜片钳研究的乳鼠窦房结细胞的分离与鉴定

目的比较“酶解+差速贴壁”法和“酶解+差速贴壁+5-溴脱氧尿嘧啶核苷（常规培养）”法体外分离培养乳鼠窦房结细胞,寻
找可行的用于膜片钳实验的分离方法。方法取Wistar乳鼠的窦房结组织,分别采用“酶解+差速贴壁”和常规培养法分离培养
窦房结细胞,观察细胞形态结构、搏动频率、膜片钳实验难易程度及成功率。同样方法分离培养心房肌细胞作为对照。结果培
养的窦房结细胞中梭形细胞最多、心房肌细胞中三角形细胞最多。两种方法分离的窦房结细胞中均为梭形细胞最多并均可记
录到自发性动作电位,其中“酶解+差速贴壁”法分离的细胞活性更好,进行膜片钳实验的成功率更高。结论“酶解+差速贴壁”
法能成功分离出乳鼠窦房结细胞,操作步骤简单,细胞损伤小、活性好,能更好地进行膜片钳实验研究。