变性高效液相色谱法检测鲍曼不动杆菌喹诺酮耐药基因突变

目的通过运用变性高效液相色谱(DHPLC),研究鲍曼不动杆菌耐药表型与其染色体上gyrA和parC基因突变的关系。方法采用微量肉汤稀释法测定左氧氟沙星和加替沙星对90株临床分离鲍曼不动杆菌的最低抑菌浓度(MIC);采用基因外序列进行同源性分析,PCR扩增鲍曼不动杆菌的gyrA和parC基因,对PCR产物进行DHPLC检测及DNA测序。结果 90株鲍曼不动杆菌中,对左氧氟沙星和加替沙星耐药率分别为63.3%和60.0%;同源性分析可分成9种基因型,90株扩增出了343bp的gyrA基因和327bp的parC基因产物。9种基因型中,3种表型耐药的基因型PCR产物经DHPLC检测均出现异常双峰或者多峰。测序证实gyrA基因存在83位Ser→Leu突变,parC基因在80位同样出现Ser→Leu突变,同时parC基因还存在多个位点的同义突变;敏感株运用DHPLC检测只出现单峰,测序未发现突变。结论运用DHPLC检测可以快速发现细菌耐药基因的突变,鲍曼不动杆菌对喹诺酮类药物的耐药与gyrA和parC基因的高频突变相关。     

耐左氧氟沙星大肠埃希菌gyrA/gyrB/parC/parE基因突变研究

目的了解耐氟喹诺酮大肠埃希菌gyrA／gyrB／parC／parE基因突变情况。方法用Kirby—Bauer琼脂扩散法筛选耐左氧氟沙星大肠埃希菌;采用聚合酶链反应（PCR）对gyrA／gyrB／parC／parE基因进行扩增,并进行PCR扩增产物直接双向测序,分析上述基因突变情况。结果PCR扩增耐菌株gyrA／gyrB／parC／parE基因,获得目的片段,测序结果显示,氟喹诺酮耐药基因突变集中在gyrA基因83、87位ser→Leu、Asp→Asn突变;parC基因55位Ser→Leu突变,部分菌株尚存在62位Gln→Glu第二突变点;未发现gyrB、parE突变。结论靶位点gyrA和parC的改变,是本地大肠埃希菌对氟喹诺酮类耐药的主要机制。     

gyrA和parC介导的铜绿假单胞菌对环丙沙星耐药机制研究

目的了解十堰地区耐氟喹诺酮类铜绿假单胞菌(PA)的药敏情况及gyrA和parC基因突变情况。方法用Vitek32对110株PA进行鉴定和药敏检测,对临床常用抗生素的药敏情况进行分析,琼脂稀释法测定60株耐环丙沙星(CIP)的PA对CIP的最低抑菌浓度(MIC),限制性长度多态性分析法(PCR-RFLP)检测耐CIP的PAgyrA和parC基因突变情况。结果耐药菌株对哌拉西林/他唑巴坦的敏感率最高(68.3%)。在60株耐CIP的PA中有42株(70.0%)耐药菌株发生gyrA基因的83位点突变,密码子发生ACC→ATC改变,编码83位氨基酸的碱基发生突变Thr→Ile(ACC→ATC),有38株(63.3%)耐药菌株发生parC基因87位点突变Ser→Leu(TCG→TTG),同时发生两种突变的共36株(60.0%)。结论耐氟喹诺酮类PA对临床常用抗生素的敏感性降低,并呈多重耐药,药物作用靶位gyrA和parC的基因突变为其耐氟喹诺酮类药物的主要机制。     

志贺菌gyrA、parC基因突变与喹诺酮类耐药

目的探讨DNA旋转酶A亚单位（gyrA）和拓扑异构酶Ⅳ C亚单位（parC）基因突变与志贺菌耐喹诺酮类药物的相关性。方法用聚合酶链反应（PCR）检测志贺菌喹诺酮耐药决定区（QRDR）相关gyrA、parC基因并挑选11株菌扩增片段进行DNA测序，分析突变位点与药敏结果的关系。结果11株扩增片段测序结果显示，9株耐萘啶酸菌均在gyrA83位发生有意义突变TCG（Ser）→TTG（Leu），宋内志贺菌未发生parC基因突变，5株耐萘啶酸、诺氟沙星和／或环丙沙星中介敏感福氏志贺菌在parC80位发生有意义突变AGC（Ser）→ATc（Ile）。结论志贺菌对喹诺酮类药物耐药严重，福氏志贺菌比宋内志贺菌更耐此类药物，靶酶基因突变是其耐喹诺酮类药物的主要机制之一，gyrA Ser83→Leu突变是导致志贺菌临床株对萘啶酸耐药的关键突变。parC基因突变在gyrA基因突变的基础上才会发生，parC突变可能引起诺氟沙星和／或环丙沙星不敏感。     

宋内志贺菌对喹诺酮类抗菌药物的耐药性研究

目的 检测宋内志贺菌对喹诺酮类抗菌药物的耐药情况,探讨染色体介导DNA旋转酶A亚单位(gyrA)和拓扑异构酶ⅣC亚单位(parC)基因突变或(和)质粒介导qnrA基因存在与宋内志贺菌耐喹诺酮类药物的相关性.方法 用K-B纸片扩散法对58株宋内志贺菌进行耐药性检测;PCR法检测宋内志贺菌喹诺酮耐药决定区(QRDR)相关gyrA、parC基因,并根据药敏结果 挑选5株菌扩增片段进行DNA测序;PCR法扩增qnrA基因片段.分析宋内志贺菌gyrA、parC基因突变或(和)qnrA基因存在与喹诺酮类药物耐药性的关系.结果 宋内志贺菌对萘啶酸的耐药率高达94.8%.58株宋内志贺菌中,8株检出qnrA基因,5株测序gyrA、parC基因的菌株中,4株萘啶酸耐药菌株均在gyrA 83位发生有义突变TCG(Ser)→TTG(Leu),但未发生parC基因突变,gyrA基因突变菌株对萘啶酸全耐药.qnrA基因阳性菌株对5种喹诺酮类药物抑菌圈中位数比较都缩小;对NAL、氧氟沙星的耐药率高于qnrA基因阴性菌株(P<0.05),差异有统计学意义.结论 gyrA Ser83分→Leu突变是导致宋内志贺菌临床分离株对喹诺酮类药物耐药的关键突变,宋内志贺菌若携带质粒介导qnrA基因则会导致对喹诺酮类药物的敏感性下降,若两者同存也可引起喹诺酮类药物耐药增强,除萘啶酸耐药外对其他喹诺酮类药物也可呈中介.     

粪肠球菌Ⅱ型拓扑异构酶基因突变与耐氟喹诺酮类药物关系的研究

目的 检测粪肠球菌对氟喹诺酮类药物的敏感性,探讨Ⅱ型拓扑异构酶基因突变与耐氟喹诺酮类药物的关系.方法 用二倍琼脂稀释法检测6种氟喹诺酮类药物对60株粪肠球菌临床分离株的体外抗菌活性,随机筛选出11株对环丙沙星不同程度耐药菌,PCR扩增gyrA,gyrB,parC,parE基因的喹诺酮耐药决定区(QRDR),产物测序后分析.结果 6种药物的相对抗粪肠球菌活性(MIC50,MIC90)从强到弱为:妥舒沙星＞加替沙星,司帕沙星＞左氧氟沙星＞氧氟沙星,环丙沙星;以妥舒沙星抗菌活性最强,氧氟沙星和环丙沙星抗菌活性最差;序列比较发现,有9株耐药株Ⅱ型拓扑异构酶基因发生突变,突变发生在gyrA基因(6株)和parC基因(9株),其中编码gyrA的Ser83→Ile,Arg和编码parC的Ser80→Ile,Arg的密码子表现出高频突变,gyrB和parE编码的氨基酸序列没有改变;未发现gyrA突变单独存在,同时具gyrA和parC突变的MIC值是仅具parC突变菌株MIC值的4倍以上.结论 氟喹诺酮类抗菌药新品种妥舒沙星、加替沙星和司帕沙星的抗粪肠球菌活性较老一代药物更强;粪肠球菌对老一代氟喹诺酮类药物存在不同程度的耐药;gyrA基因83,87位突变及parC基因80,84位突变都可引起粪肠球菌对氟喹诺酮类药物产生耐药,但以parC基因80住突变为主;低耐药株往往是parC基因单位点突变,高耐药株同时合并有gyrA基因双位点突变.     

南京地区鲍曼不动杆菌喹诺酮类药物耐药基因突变的研究

目的 调查南京地区鲍曼不动杆菌对喹诺酮类药物的耐药情况,并研究其耐药机制。方法 在南京地区的医院随机收集了73株鲍曼不动杆菌,历时9个月。定量肉汤稀释法测定菌株对左氧氟沙星、环丙沙星和加替沙星3种喹诺酮类药物的MIC,PCR扩增gyrA基因和parC基因并进行酶切分析,选取部分PCR扩增产物进行测序。结果 鲍曼不动杆菌对左氧氟沙星耐药率为39．7％（29／73）;对环丙沙星耐药率为76.7％（56／73）;对加替沙星耐药率为32．9％（24／73）。对3种喹诺酮类药物均耐药的有16株,占21．9％。PCR—RFLP显示,对gyrA基因,耐药株有80．4％（45／56）不能被Hinf Ⅰ酶切,敏感株100％（17／17）被Hinf Ⅰ酶切;对parC基因,耐药株73．2％（41／56）不能被Hinf Ⅰ酶切,敏感株有88.2％（15／17）被Hinf Ⅰ酶切。测序结果：耐药株中的gyrA和parC基因存在突变,敏感株中则不存在突变,并在耐药株中发现gyrA和parC基因新的点突变,Genbank号分别为DQ270238和DQ270239。结论 南京地区鲍曼不动杆菌对喹诺酮类药物耐药情况严重,其耐药与gyrA和parC基因突变有关。     

志贺菌gyrA、parC基因突变与喹诺酮类耐药

目的探讨DNA旋转酶A亚单位(gyrA)和拓扑异构酶ⅣC亚单位(parC)基因突变与志贺菌耐喹诺酮类药物的相关性。方法用聚合酶链反应(PCR)检测志贺菌喹诺酮耐药决定区(QRDR)相关gyrA、parC基因并挑选11株菌扩增片段进行DNA测序,分析突变位点与药敏结果的关系。结果11株扩增片段测序结果显示,9株耐萘啶酸菌均在gyrA 83位发生有意义突变TCG(Ser)→TTG(Leu),宋内志贺菌未发生parC基因突变,5株耐萘啶酸、诺氟沙星和/或环丙沙星中介敏感福氏志贺菌在parC 80位发生有意义突变AGC(Ser)→ATC(Ile)。结论志贺菌对喹诺酮类药物耐药严重,福氏志贺菌比宋内志贺菌更耐此类药物,靶酶基因突变是其耐喹诺酮类药物的主要机制之一,gyrA Ser83→Leu突变是导致志贺菌临床株对萘啶酸耐药的关键突变。parC基因突变在gyrA基因突变的基础上才会发生,parC突变可能引起诺氟沙星和/或环丙沙星不敏感。     

多重耐药性鲍曼不动杆菌耐药基因及菌株聚类分析

目的了解临床分离到的鲍曼不动杆菌耐药相关基因存在状况和菌株间的亲缘性。方法药敏试验用PhoenixTM100系统检测。用PCR扩增β-内酰胺酶基因、氨基糖甙类药物修饰酶基因、DNA拓扑异构酶基因等,并用DNA测序仪证实。结果247株鲍曼不动杆菌对亚胺培南和美洛培南耐药率最低,仅为3.2%、4.1%。20株多重耐药性鲍曼不动杆菌中,17株具TEM型β-内酰胺酶基因,氨基糖甙类药物修饰酶基因aac（3）-Ⅰ、aac（3）-Ⅱ、aac（3）-Ⅲ、aac（3）-Ⅳ、aac（6′）-Ⅰ、ant（2″）-Ⅰ、ant（3″）-Ⅰ基因检出率分别为80%、15%、30%、70%、15%、55%、80%。20株对环丙沙星耐药的鲍曼不动杆菌gyrA密码子均由TCA→TTA,氨基酸由Ser83→Leu,而85%菌株（17/20）的ParC氨基酸序列发生Ser80→Leu替代。聚类分析显示存在2株克隆株,其耐药表型基本一致。结论本院鲍曼不动杆菌携带多种β-内酰胺酶、氨基糖甙类修饰酶等耐药基因,喹诺酮耐药决定区基因突变是细菌耐受喹诺酮类药物重要原因。聚类分析表明,本院的鲍曼不动杆菌存在克隆传播。     

临床分离气单胞菌喹诺酮类的耐药机制研究

摘要:目的探讨临床分 离气单胞菌属细茵(Aeromonas spp. )喹诺酮类药物耐药机制。方法收集从北京友谊医院2017年腹泻患者粪便标本中分离的气单胞菌,采用微量肉汤稀释法检测其对喹诺酮类药物的敏感性,提取菌株核酸进行PCR扩增,测序分析气单胞茵喹诺酮耐药决定区(quinolone-resistancedeter mining region, QRDR)及喹诺酮耐药质粒相关( plasmid-mediated quinolone resistance, PMQR)基因。结果共收集 111株气单胞菌,其中7株(6.3%)对萘啶酸(NAL)和环丙沙星(CIP )均耐药,54株(48.6%)对NAL耐药但对CIP敏感,50株(45.0%)对NAL和CIP均敏感。QRDR测序结果显示,NAL耐药菌株gyrA基因第83位发生丝氨酸(Ser)突变,突变为异亮氨酸(le)、缬氨酸(Val)或酪氨酸(Tyr)。对NAL-CIP耐药的菌株中,除了 gyrA基因突变外,parC基因第87位Ser突变为Ile。 CIP 敏感的104株菌株中,仅有7株parC基因第87位Ser突变。PMQR基因检测结果显示,QnrS基因检出率为7.2%(8株) ,aac(6'')-lb-cr 基因检出率为6.3%(7株),且QnrS和aac(6'' )-1b-cr基因检出 主要集中在CIP耐药菌株中,CIP耐药菌株PMQR基因检出率为85.7%。结论气单胞菌喹诺酮低水平耐药主要与 gyrA基因第第83位突变或QnurS基因有关。gyrA基因第83位突变和parC基因第87位突变Ser87lle联合PMQR基因存在时,可能与气单胞茵对喹诺酮的高水平耐药相关。     

多重耐药鲍曼不动杆菌<I>gyrA</I>基因突变与环丙沙星耐药关系研究

目的　研究多重耐药鲍曼不动杆菌（MDR-ABA）IgyrA/I基因突变与环丙沙星耐药关系。方法　以鲍曼不动杆菌IgyrA/I基因序列为靶序列，用PCR+DNA测序等方法对62株临床分离株gyrA基因突变进行对比研究。结果　在53株耐环丙沙星MDR-ABA菌中，有52株IgyrA/I基因的83位表现出突变，其突变方式全为TCATTA，导致氨基酸丝氨酸亮氨酸； 8株环丙沙星敏感和1株环丙沙星中介的MDR-ABA菌IgyrA/I基因无突变。结论　临床分离的MDR-ABA菌对环丙沙星耐药的分子机制主要表现为IgyrA/I基因83位氨基酸密码子突变。     

Activity of clinafloxacin, compared with six other quinolones, against Acinetobacter baumannii clinical isolates

The in vitro activity of clinafloxacin was studied in comparison with ciprofloxacin, levofloxacin, moxifloxacin, nalidixic acid, sparfloxacin and trovafloxacin against Acinetobacter baumannii clinical isolates. Clinafloxacin showed a MIC(90) of 4 mg/L, whereas the remaining quinolones showed a MIC(90) equal to or higher than 16 mg/L. MIC(50) determination in the presence of reserpine resulted in a two-fold decrease, except for trovafloxacin, which decreased four-fold, and for moxifloxacin and nalidixic acid, which did not change. The effect of reserpine was most pronounced among strains with a low level of resistance to quinolones. The MIC of clinafloxacin for strains with no mutation in either gyrA or parC genes ranged from 0.008 to 0.25 mg/L. In strains with a single mutation at amino acid codon Ser83 of the gyrA gene, the MIC of clinafloxacin ranged from 0.12 to 1 mg/L, whereas strains with a double mutation, one in the gyrA gene and another in the parC gene, showed a range of MIC of clinafloxacin from 1 to 8 mg/L. Therefore, clinafloxacin shows good activity against strains carrying a single mutation in the gyrA gene, and hence a second mutation is required for the microorganism to express resistance.     

嗜麦芽窄食单胞菌对氟喹诺酮类抗菌药的耐药机制研究

目的探讨嗜麦芽窄食单胞菌的DNA解旋酶和拓扑异构酶Ⅳ与氟喹诺酮类抗菌药物的耐药关系。方法选择氟喹诺酮类抗菌药物耐药且主动外排表型机制阴性的临床分离菌株19株和氟喹诺酮类抗菌药物敏感株10株,对其gyrA和parC的喹诺酮决定区域的基因进行PCR扩增,扩增产物进行测序,BLAST比对分析其氨基酸序列。采用SPSS软件进行统计学分析。结果 19株耐药菌的gyrA和parC基因各有7株菌核苷酸发生了碱基替换改变但均为同义突变,有2株菌在gyrA基因中124位氨基酸发生了突变由谷氨酸变为天冬氨酸（GAA→GAC）,在氟喹诺酮类抗菌药物敏感组中也同样有1株发生同样的突变,两组比较差异无统计学意义（P〉0.05）。结论嗜麦芽窄食单胞菌对氟喹诺酮类抗菌药物耐药与主动外排泵、外膜的通透性降低有关,但与解旋酶和拓谱异构酶Ⅳ的靶位点改变无显著关系。     

耐喹诺酮铜绿假单胞菌药物作用靶位改变的研究

目的：探讨铜绿假单胞菌对喹诺酮类药物的耐药机制。方法30株对环丙沙星耐药的铜绿假单胞菌,采用 PCR方法扩增DNA解旋酶和拓扑异构酶Ⅳ的基因 gyrA,gyrB,parC和 parE,再测序查找是否存在位点突变,同时用脉冲场电泳（pulsed-field gel electrophoresis,PFGE）对菌株进行同源性分析。结果30株菌中,28株菌出现 gyrA基因扩增片段的137位点均有C→T突变,导致T83I改变;17株菌gyrB基因扩增片段的351位出现G→C突变,导致G466A改变;21株菌的 parC基因扩增片段的277位点有 C→U 突变导致 S87L 改变;2株菌 parE 基因在不同位点出现 C→U 突变,导致A425V和 A473V改变。30株菌可分为6个克隆,其中 A克隆4株,仅有 gyrA突变;B克隆7株,有 gyrA和 parC两种基因发生突变;C克隆3株,有gyrA和gyrB两种基因发生突变;D克隆14株,同时有 gyrA,gyrB和 parC三种基因发生突变;其他克隆2株,仅在 parE位点发生突变。结论该组菌株的靶位突变型与流行克隆型密切相关,同一流行型的菌株药物作用靶位的改变相同,并与环丙沙星的 MICs值的高低呈正比,突变基因数越多,MICs 值越高。4种基因中 gyrA基因突变频率最高,且该突变比其他靶位的突变对药物与靶位结合的影响更大,是需要关注的重点。     

鲍曼不动杆菌对喹诺酮类药物的耐药机制分析

目的 探讨鲍曼不动杆菌（Acinetobacterbaumanii,Ab）对喹诺酮类药物的耐药机制。方法收集2007年11月至2008年10月全国多省市21家医院院内下呼吸道感染住院患者痰标本2698份进行培养鉴定,对Ab分离株进行药敏检测,采用聚合酶链反应对Ab的不同耐药基因进行扩增,并进行序列分析。结果2698份痰标本共计培养出39株Ab。对环丙沙星耐药率为61．54％,对左氧氟沙星耐药率为53．85％。39株Ah中有30株（76．92％）发生parC基因突变,19株（48．72％）发生gyrA基因突变,15株同时发生parC基因和gyrA基因突变。结论Ab对喹诺酮类药物耐药机制主要与gyrA、parC基因突变有关。     

Comparison of gyrA and parC mutations and resistance levels among fluoroquinolone-resistant isolates and laboratory-derived mutants of oral streptococci

Laboratory-derived fluoroquinolone-resistant mutants were obtained by serial passage of Streptococcus sanguis and Streptococcus anginosus isolates on agar containing increasing concentrations of old and new fluoroquinolones, ofloxacin and DU-6859a, respectively. Sequencing of an S. sanguis isolate exposed to DU-6859a showed that resistance was associated with two mutations in the quinolone resistance determining region (QRDR) of the gyrA gene (Ser83-->Phe; Glu87-->Lys), and with a mutation in the parC gene (Ser79-->Ile). However, different mutations in the gyrA gene (Ser83-->Tyr) and parC gene (Ser79-->Phe) were found in a S. sanguis isolate exposed to ofloxacin. A fluoroquinolone-resistant isolate, QR-95101, from a dental infection, had a single mutation in the gyrA gene (Ser83-->Phe) and in the parC gene (Ser79-->Phe). Two fluoroquinolone-resistant mutants, QS-701OFm and QS-701DUm, were obtained from S. anginosus QS-701, by exposure to ofloxacin and DU-6859a, respectively. These mutants showed a common substitution at codon 83 (Ser-->Phe) in the gyrA gene but had different substitutions at codon 87 (QS-701OFm, Glu-->Gln; QS-701DUm, Glu-->Lys). They also had different substitutions at codons 79 and 135 in the parC gene (QS-701OFm, Ser79-->Leu but no change at Glu135; QS-701DUm, Ser79-->Ile and Glu135-->Gln). The resistance levels of the DU-6859a-selected resistant S. sanguis mutant QS-951DUm to DU-6859a, ofloxacin, ciprofloxacin and norfloxacin were higher than those of the ofloxacin-selected resistant mutant QS-951OFm. However, ampicillin susceptibilities of these mutants were not different from the parental strains. In S. anginosus, the DU-6859a-selected fluoroquinolone-resistant mutant QS-701DUm was resistant to all the fluoroquinolones tested, while the ofloxacin-selected mutant QS-701OFm was resistant to three fluoroquinolones, but not DU-6859a. The results indicate that different fluoroquinolones select distinct mutations in the QRDR of the gyrA and parC genes in oral streptococci. The gyrA or parC mutation in oral streptococci may determine the levels of fluoroquinolone resistance.     

上海地区肺炎链球菌对氟喹诺酮类的敏感性及其喹诺酮耐药决定区突变研究

目的了解上海地区临床分离肺炎链球菌对氟喹诺酮类等抗菌药物的敏感性，并对氟喹诺酮类敏感菌株的喹诺酮耐药决定区（QRDR）突变进行初步研究。方法收集上海地区部分医院2004-2005年共176株肺炎链球菌临床分离株，用琼脂稀释法测定环丙沙星、左氧氟沙星、加替沙星和莫西沙星等15种抗菌药物的抗菌活性，并选取部分左氧氟沙星敏感肺炎链球菌菌株进行QRDRPCR扩增、测序。结果176株受试菌株中．PSSP、PISP和PRSP各占48．9％、47．1％和4．0％，受试菌株对环丙沙星、左氧氟沙星、加替沙星和莫西沙星敏感率均为100％。QRDR的扩增测序结果发现，20株左氧氟沙星MIC1～2mg／L的敏感菌株中，19株的parC、parE基因上已存在不同程度的氨基酸突变．包括ParC：Phe 105→Leu／Asp136→Tyr，Pare：Asp435→AsnjIle460→ValjAsn477→Lys．而在gyrA、gyrB基因上仅发现点突变，未导致相关氨基酸突变。结论上海地区未发现氟喹诺酮类耐药肺炎链球菌临床分离株，但左氧氟沙星MIC1～2mg／L的敏感株中已发现QRDR一级突变现象，突变的基因位点均见于parC、pare基因。