外源性IFN—β基因稳定转染对胶质瘤细胞凋亡的影响

目的研究外源性干扰素—β(IFN-β)基因对胶质瘤细胞系SHG-44的诱导凋亡作用，探索胶质瘤基因治疗的新途径。方法利用脂质体转染方法将IFN-β真核表达载体pSV2IFNβ导入人SHG44胶质瘤细胞。应用流式细胞仪和免疫荧光法检测IFN-β基因的稳定转染及表达，利用Hoechst染色、透射电镜观察细胞凋亡情况。结果IFN-β基因成功转染SHG44胶质瘤细胞并得以表达，并诱导SHG44胶质瘤细胞凋亡。结论IFN-β能够诱导入SHG44胶质瘤细胞凋亡，本实验为IFN-β基因治疗人脑胶质瘤的应用奠定了初步基础。     

人IFN-β基因脂质体转染胶质瘤细胞及对其增殖的抑制作用

目的观察β-干扰素(IFN-β)基因脂质体pSV2IFN-β转染人胶质瘤细胞系SHG44及其对SHG44细胞增殖的影响.方法应用流式细胞仪、酶联免疫吸附试验(ELASA)及细胞免疫组织化学染色法检测脂质体pSV2IFN-β转染后,SHG44细胞IFN-β的表达情况;应用四唑盐比色试验(MTT)检测脂质体pSV2IFN-β转染后转染组与对照组SHG44细胞增殖的差异.结果 IFN-β基因脂质体pSV2IFN-β转染SHG44胶质瘤细胞系后4 d和6 d,对肿瘤细胞具有明显的增殖抑制作用,抑制率分别为16.7%和32.7%.ELASA及流式细胞仪蛋白检测均表明转染后胶质瘤细胞具有显著的IFN-β表达(P<0.01),其中在转染后72 h和96 h,IFN-β表达量分别为(35.4±2.7)U/ml和(40.3±3.2)U/ml.免疫组织细胞化学实验也表明转染后的细胞有明显的IFN-β的表达.结论 IFN-β基因脂质体pSV2IFN-β可转染SHG44胶质瘤细胞系,并对胶质瘤细胞的增殖具有显著的抑制作用.     

IFN-β裸DNA对人脑胶质瘤生长的抑制作用

目的探讨β干扰素(IFN-β)基因对人脑胶质瘤生长的抑制作用,以及人IFN-β裸DNA治疗人脑胶质瘤的可行性.方法建立裸鼠SHG44胶质瘤模型,用脂质体包埋法将含IFN-β基因的真核表达载体(pSV2IFN β)注入裸鼠皮下SHG44脑胶质瘤,观察肿瘤生长情况并计算肿瘤体积,通过免疫组化、原位末端转移酶标记(TUNEL)染色以及瘤体坏死区计数检测,了解IFN-β基因对人脑胶质瘤生长的抑制作用.结果 IFN-β在荷瘤裸鼠瘤体内获得表达,裸鼠皮下胶质瘤生长受到抑制,并诱导SHG44胶质瘤细胞凋亡.结论 IFN-β裸DNA能够抑制人脑胶质瘤生长,该实验为IFN-β基因治疗人脑胶质瘤的应用奠定了初步基础.     

过表达钙整合素结合蛋白CIB诱导SHG44胶质瘤细胞凋亡的实验研究

目的 观察CIB基因对人胶质瘤SHG44细胞体外生长和细胞凋亡的影响.方法 构建重组质粒pcDNA3-CIB,转染人胶质瘤细胞株SHG44,MTT观察各组细胞的体外生长情况,流式细胞术(FCM)测定各组细胞的细胞周期和凋亡细胞数量,Western-blot检测CIB转染后凋亡相关蛋白的表达变化.结果 RT-PCR、Western印迹显示pcDNA3-CIB转染组CIB的mRNA及CIB蛋白表达水平明显高于对照组;与对照组细胞相比,转染CIB的SHG44-CIB组细胞牛长明显减缓(P＜0.01),SHG44-CIB组细胞G_1、S期细胞减少,G_2期细胞增多,凋亡细胞增加至19.2%;凋亡相关蛋白Bcl-2表达下调,Bax表达上调.结论 CIB在体外明显抑制SHG44细胞的生长并诱导其发生凋亡,CIB诱导的凋亡可能与Bcl-2及Bax表达的变化相关.     

脂质体介导的huIFN—β基因转染对胶质瘤细胞侵袭力抑制作用研究

目的探讨人β-干扰素（huIFN—β）基因脂质体pSV2IFN—β对人脑胶质瘤细胞体外侵袭力的抑制作用。方法用含huIFN—β基因的脂质体体外转染人脑胶质瘤细胞系SHG44，用Westernblot和细胞免疫荧光染色法检测目的基因的蛋白表达。通过Boyden小室法检测SHG44转染前后细胞体外侵袭力的变化，同时采用明胶酶谱法分析基质金属蛋白酶2（MMP-2）和基质金属蛋白酶9（MMP-9）的比活性。结果转染pSV2IFN—β后，SHG44细胞中的目的基因蛋白有显著表达；磷酸盐缓冲液（PBS）对照组、空载体转染组、pSV2IFN—β脂质体转染组的侵袭性细胞数分别为49．26±14．67、54．63±12．27和18．17±5．42，转染靶基因后SHG44细胞的体外侵袭力受到明显抑制，这与MMPs活性下降的改变相一致。结论转染huIFN—β基因脂质体pSV2IFN—β使脑胶质瘤细胞系SHG44的侵袭力受到明显抑制，提示脂质体介导的huIFN—β基因治疗可能是抗神经胶质瘤侵袭的一个有效的方法。     

Dickopff-1的真核表达载体构建及其对SHG44的作用

目的 构建Diekopff-1(DKK-1)的真核表达质粒,研究SHG44转染DKK-1并经BCNU处理后其生物学特性的变化.方法 将纯化扩增的人DKK-1与真核表达载体peDNA3.1连接后转化人大肠杆菌DH5α感受态扩增重组,以LipofectamineTM2000介导将重组质粒转染SHG44细胞,经G418筛选后进行鉴定.BCNU处理转染DKK-1基因后的SHG44细胞,流式细胞仪检测细胞特性变化.结果 扩增获得的816 bp特异片段,重组质粒经鉴定及测序分析结果 完全一致.重组载体转染SHG44细胞经G418筛选后,转染细胞在DNA、mRNA、蛋白水平均有DKK-1的表达.BCNU处理后的未转染、空质粒转染、重组质粒转染的三组SHG44细胞,平均凋亡率分别为1.0%、1.4%、8.0%.结论 本实验成功构建了pcDNA3.1-DKK-1真核表达质粒,并建立稳定表达DKK-1蛋白的胶质瘤细胞株(SHG44-DKK-1).转染DKK-1能增强SHG44对BCNU的敏感性,促进肿瘤细胞的凋亡.     

华蟾素对人脑胶质瘤细胞SHG44增殖及凋亡的影响

目的初步探讨华蟾素对人脑胶质瘤细胞SHG44增殖、细胞周期分布及凋亡的影响机制。方法利用MTT法、流式细胞仪检测华蟾素对人脑胶质瘤细胞SHG44增殖及细胞周期变化的影响。AO／EB染色、透射电镜观察人脑胶质瘤细胞SHG44凋亡细胞形态学的变化。Westernblot检测Bcl-2与Caspase8蛋白的表达。结果华蟾素（1μg／ml、10μg／ml）对细胞株增殖具有显著抑制作用（P〈0．05）,并呈时间和浓度依赖性。沆式细胞仪检测可见凋亡峰,Go／G。期细胞明显增多（P〈0．05）;华蟾素作用后可使Bcl-2蛋白表达降低．Caspase8蛋白表达升高。结论华蟾素可调控人脑胶质瘤细胞SHG44的周期进程,诱导Bcl-2及Caspase8差异性表达,且具有抑制肿瘤细胞增殖及促凋亡的作用。     

CDC2敲低治疗人脑胶质瘤的实验研究

目的 提供CDC2作为胶质瘤发生发展相关新分子的实验依据.方法 构建针对目的 基因的shRNA逆转录病毒表达载体;对体外培养的人脑胶质瘤细胞及其裸小鼠移植瘤进行转染,观察与目标基因相关的表型变化;荧光实时定量PCR检测mRNA表达,Western印迹检测蛋白表达;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡的变化.结果 shRNA表达载体使人脑胶质瘤细胞株SHG44 CDC2的mRNA、蛋白表达显著下调,同时出现了明显的细胞G2/M期阻滞,细胞生长抑制,凋亡增加.裸小鼠皮下移植瘤明显缩小;肿瘤颅内移植裸小鼠生存期明显延长.结论 CDC2基因过表达是胶质瘤发生发展病因分子之一,敲低其表达可使肿瘤的恶性增殖得到控制.     

脂质体介导CD基因转染SHG-44胶质瘤细胞凋亡的实验研究

目的以含胞嘧啶脱氨酶（CD）基因的pCMVCD重组表达质粒转染SHG-44胶质瘤细胞，体外观察5-氟胞嘧啶（5-FC）对转染CD基因的胶质瘤细胞的凋亡诱导作用。方法体外扩增、酶切鉴定pCMVCD质粒并采用DNA序列测定pCMVCD质粒中的CD基因；脂质体Lipofectamine 2000介导pCMVCD质粒转染SHG-44细胞，G418筛选培养获取抗性细胞克隆（即SHG-44／CD细胞）；免疫细胞化学检测SHG-44／CD细胞的CD基因蛋白水平表达；流式细胞仪、TUNEL实验及透射电子显微镜观察5-FC对表达CD基因的SHG-44／CD细胞凋亡的诱导作用。结果含CD基因的pCMVCD质粒成功转染进入SHG-44细胞，获取了含CD基因的SHG-44／CD细胞，免疫细胞化学染色显示SHG-44／CD细胞成功地表达了CD。在含5-FC的培养液中培养，SHG-44／CD细胞出现典型的凋亡形态，TUNEL显示凋亡细胞比例极高；透射电镜可见凋亡改变；流式细胞术检测凋亡率达18．6％，凋亡率呈剂量依赖性。结论建立了SHG-44恶性人脑胶质瘤细胞的CD／5-FC自杀基因系统。诱导SHG-44／CD胶质瘤细胞产生凋亡可能是脑胶质瘤CD基因疗法的重要机制。     

胶质瘤相关基因Tob的功能研究

目的研究Tob基因在胶质瘤细胞系SHG-44中的功能,为下一步进行试验性治疗提供依据.方法按照Tob基因的GenBank登录号D38305,构建带有绿色荧光蛋白（GFP）和新型抗生素Zeocin抗性基因的pTracer-EF/V5-His A表达载体.利用脂质体将上述表达质粒转入SHG44胶质瘤细胞.在各个不同的培养时段选择2、4、8、16、24、36、48 h分别在倒置显微镜下观察,最后在48 h时取未转染和转染的细胞大约105个作细胞涂片,进行荧光显微镜摄影和GFAP免疫组化染色分析.同时作体外生长曲线和细胞周期的流式细胞术分析.结果酶切鉴定和序列分析均证实Tob基因被成功克隆,将此基因成功转染到SHG-44细胞后,荧光显微镜观察可见用4μg脂质体和2μg DNA,最后用10μg/mLZeocin筛选可以达到90%的阳性细胞数.在转染Tob基因成功的细胞中GFAP染色的阳性率也同样升高.细胞在转染了Tob基因以后生长速度明显变慢,几乎处于停滞状态.流式细胞术分析显示在体外培养24 h后转染阳性细胞G2/M期比例明显减少,而凋亡细胞比例也出现明显的升高.结论Tob基因转染后的胶质瘤细胞生长受到明显抑制,出现向正常胶质细胞的分化和凋亡现象,提示Tob基因确实是一胶质瘤细胞增殖抑制基因,值得进一步做功能研究和实验性基因治疗研究.     

Livin基因短发卡RNA表达质粒的构建及其对胶质瘤Livin基因表达的影响

目的构建凋亡抑制基因livin基因的特异性短发卡RNA（siRNA）真核表达载体,并观察其在人脑胶质瘤细胞中对livin基因表达的抑制。方法设计有小发夹结构的2条livinβ siRNA对应的DNA序列,将其克隆入pSliencer 3.1质粒,构建重组质粒pSliencer-livinβ,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定。以脂质体法将pSliencer-livinβ转染人胶质瘤细胞。采用RT-PCR和Western-blot检测Livinβ蛋白的表达,筛选最有效的一组pSliencer-livinβ质粒。结果酶切及测序证实质粒pSliencer-livinβ构建成功。转染后胶质瘤细胞livinβmRNA和蛋白表达均受到明显抑制。结论成功构建livinβ基因的特异性短发卡RNA（siRNA）真核表达载体能够显著抑制人胶质瘤细胞livinβ基因的表达。     

LRIG1基因对胶质瘤SHG44的放疗增敏作用

目的研究亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白1(LRIG1)对人脑胶质瘤细胞系44细胞(SHG44)的放疗增敏作用。方法采用分子克隆技术,将构建的重组质粒p EGFP-C1-LRIG1转染SHG44,并稳定表达后在荧光显微镜下观察;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术研究放射照射后SHG44中目的基因LRIG1和表皮生长因子受体(EGFR)的信使核糖核酸(mRNA)表达情况;免疫组织化学法分析照射后SHG44中LRIG1和EGFR的蛋白表达差异;采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法分析干预后SHG44的细胞增殖能力;细胞侵袭实验(Transwell)分析干预后SHG44的肿瘤侵袭能力。结果重组质粒p EGFP-C1-LRIG1转染SHG44细胞可稳定表达LRIG1;SHG44+p EGFP-C1-LRIG1细胞相对于SHG44、SHG44+p EGFP-C1细胞,LRIG1与EGFR基因的mRNA和蛋白的表达水平有显著差异(P0.01);且SHG44+p EGFP-C1-LRIG1细胞的细胞活性及侵袭能力较SHG44、SHG44+p EGFP-C1细胞明显下降(P0.01)。结论在胶质瘤SHG44细胞中过表达LRIG1基因可通过下调EGFR表达,抑制SHG44细胞的恶性生物学行为,增加放疗敏感性。     

NF-κB1通过促进BCL2表达抑制胶质瘤细胞的早期凋亡

目的探讨核转录因子-κB1(NF-κB1)在人脑胶质瘤和胶质瘤细胞株U87、SHG44的表达及其与凋亡的相关性;以及NF-κB1对脑胶质瘤的作用机制。方法利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测NF-κB1在非瘤脑组织和不同级别人脑胶质瘤组织中的表达水平。采用脂质体法将化学合成NF-κB1过表达/沉默表达质粒(NF-κB1 shRNA),以及BCL2沉默表达质粒(BCL2 shRNA)转染上述细胞系。通过流式细胞术检测NF-κB1对胶质瘤细胞株U87、SHG44凋亡的影响,并采用Western blotting分别检测NF-κB1、BCL2蛋白的表达水平。结果 qRT-PCR显示,NF-κB1在人脑胶质瘤中表达明显高于非瘤脑组织,并且表达水平随着肿瘤恶性程度的增高而逐渐升高(均P0.05)。在同一人脑胶质瘤标本中BCL2的表达水平与NF-κB1的表达趋势相同。流式细胞术检测结果显示,抑制NF-κB1表达明显促进人脑胶质瘤细胞U87、SHG44的凋亡(均P0.05)。Western blot检测证实,抑制NF-κB1蛋白表达后BCL2蛋白的表达水平也随之降低。结论 NF-κB1通过促进BCL2的表达而抑制胶质瘤细胞的早期凋亡。     

RNA干扰PDGF-B基因对胶质瘤U251细胞凋亡和增殖的影响

目的利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术特定沉默胶质瘤U251细胞株的血小板源生长因子-B(PDGF-B)基因,观察其对U251细胞株细胞凋亡和增殖的影响。方法利用脂质体将针对PDGF-B基因的siRNA转染进入U251细胞,利用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(RTPCR)检测PDGF-B基因表达;Western blot检测显示siRNA转染组PDGF-B蛋白表达,采用MTT法检测胶质瘤U251细胞的增殖,应用流式细胞计数观察抑制PDGF-B基因后胶质瘤U251细胞的凋亡情况。结果 RT-PCR检测PDGF-B基因表达明显下降;Western blot检测显示siRNA转染组PDGF-B蛋白表达明显抑制(抑制率60%),MTT结果显示siRNA转染组U251细胞增殖较对照组明显降低;流式细胞学检测提示降低PDGF-B在胶质瘤细胞的表达能抑制胶质瘤细胞的有丝分裂,促进细胞的凋亡。结论构建针对胶质瘤细胞PDGF-B的RNA干扰质粒并转染人胶质瘤U251细胞株后,可明显抑制U251细胞株PDGF的表达,对人胶质瘤U251细胞株有明显的生长抑制和促进凋亡作用。     

阻断转化生长因子-β信号通路对胶质瘤血管生成拟态的抑制作用

目的 探讨阻断转化生长因子-β(TGF-β)信号通路对胶质瘤血管生成拟态(VM)的影响及其可能机制. 方法 三维培养人脑胶质瘤细胞系U251、SHG44,观察U251培养上清、TGF-β因子对SHG44细胞形成VM的影响;比较0μg/mL(PBS组)、15 μg/mL(Ab15组)、30 μg/mL (Ab30组)TGF-β中和抗体对U251、SHG44细胞形成VM的影响;酶联免疫吸附法(ELISA)检测空白组、PBS组、Ab15组,Ab30组U251培养上清中血管内皮生长因子(VEGF)及血小板衍生生长因子(PDGF)的表达以及空白组、TGF-β组、PBS组、Ab15组,Ab30组SHG44细胞上清VEGF、PDGF的表达. 结果 三维培养时,U251细胞排列形成VM,SHG44细胞并不形成VM,而仅仅相互聚集成大小不等的细胞集落;U251培养上清可以诱导SHG44细胞形成VM,且在培养24～48 h最为明显,TGF-β因子不能诱导SHG44细胞形成VM;PBS组、Ab15组、Ab30组U251细胞环状结构数量依次降低,差异有统计学意义(P＜0.05).与U251上清共培养的SHG44细胞在加入TGF-β中和抗体后,3组细胞形成环状结构数量也依次降低,差异有统计学意义(P＜0.05);与空白组和PBS组比较,Ab15组、Ab30组U251细胞上清中VEGF、PDGF浓度下降,差异有统计学意义(P＜0.05),与空白组和TGF-β组相比,PBS组、Ab15组、Ab30组SHG44细胞上清中两种因子浓度均增高,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 抑制TGF-β信号通路可以使胶质瘤VM形成能力下降,这可能与VEGF及PDGF表达减少有关.     

姜黄素对人胶质瘤SHG44细胞侵袭、迁移的影响

目的 探讨姜黄素对人胶质瘤SHG44细胞侵袭和迁移的影响。方法 胶质瘤SHG44细胞使用含10％胎牛血清DMEM培养基培养,终浓度分别5、10、20、40 μmol/L姜黄素作用24、48、72 h;对照组加入等量二甲基亚砜。CCK-8比色法检测细胞增殖活力;细胞划痕实验检测细胞迁移距离及迁移率;Transwell实验细胞侵袭能力;免疫印迹法检测胶质瘤SHG44细胞基质金属蛋白酶（MMP）2、9表达。结果 姜黄素对SHG44细胞生长具有显著抑制,且呈时间与浓度依赖性（P<0.05）;最佳作用浓度在10~20 μmol/L。与对照组相比,姜黄素作用后,SHG44细胞迁移距离、迁移率、侵袭能力明显降低（P<0.05）,SHG44细胞MMP2、MMP9蛋白表达水平显著下降（P<0.05）。结论 姜黄素可抑制胶质瘤SHG44细胞的增殖,进而抑制细胞的迁移及侵袭能力,且呈时间及浓度依耐性,其机制可能与下调MMP2和MMP9蛋白表达有关。     

重组型Caspase3对U251胶质瘤细胞促凋亡作用

目的探讨由野生型人Caspase3大小亚基颠倒构建的重组型Caspase3促U251胶质瘤细胞的调亡活性。方法运用分子克隆技术,使Caspase3基因大小亚基颠倒构建,并将重组基因克隆入绿色荧光蛋白(GFP)真核表达载体pcDNA3.1中,转染人U251胶质瘤细胞。利用透射电镜和流式细胞仪观察胶质瘤细胞凋亡的生物学特征。结果成功地获得了重组型反向Caspase3基因。经限制酶酶切分析鉴定释放330及550bp片段,PCR法鉴定反向重组成功;构建了重组型Caspase3基因的真核表达载体,转染U251胶质瘤细胞后,重组型Caspase3基因在细胞中表达,电镜显示细胞呈现凋亡的典型形态学特征。流式细胞仪可见细胞凋亡峰。结论重组型Caspase3可促进U251胶质瘤细胞的凋亡。     

TNF-α基因与依托泊甙联合诱导胶质瘤凋亡的实验研究

目的在体外水平(invitro)建立对胶质瘤杀伤作用的TNF-α基因/VP16系统,研究该系统诱导胶质瘤凋亡的作用。方法用逆转录病毒载体将TNF-α基因转染人胶质瘤细胞株SHG-44,经生长抑制试验,比较转TNF-α基因前后SHG-44细胞对依托泊甙(Etioposide,VP16)的敏感性,并通过形态学及流式细胞仪检测VP16诱导转基因细胞凋亡的情况。结果生长抑制试验表明,转染TNF-α基因后的SHG-44细胞对VP16的敏感性是转基因前细胞的10倍(P＜0.01),IC50为0.8μg/mL。流式细胞检测表明,VP16对转TNF-α基因细胞有较强的诱导凋亡的能力。结论VP16对转TNF-α基因SHG-44细胞诱导凋亡的能力大大增加,表明TNF-α基因/VP16系统对胶质瘤的基因治疗有效。     

环加氧酶-2对神经胶质瘤细胞株的多药耐药影响

目的 探讨环加氧酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)在人神经胶质瘤细胞株SHG44发生多药耐药过程中的作用和机制.方法 应用阿霉素浓度递增和间歇诱导法建立SHG44/ADM耐药株,采用过表达COX-2和COX-2特异抑制剂NS398分别干预SHG44/WT和SHG44/ADM细胞株,免疫印迹法检测COX-2和MDR-1的表达量,酶联免疫分析PGE2产生量,荧光分光光度计检测细胞内阿霉素浓度.结果 过表达COX-2增加细胞PGE2生成量,同时增加MDR-1表达和活性;NS398抑制细胞PGE:生成量,减少MDR-1表达和活性.结论 COX-2参与神经胶质瘤细胞的多药耐药.     

p16基因抑制脑胶质瘤细胞恶性增殖并诱导细胞凋亡

目的：探索p16基因在脑胶质瘤发生过程中的作用及其与脑胶质瘤细胞凋亡的关系。方法：采用脂质体,磷酸钙＋DMSO休克转染的方法,分别将外源野生型p16基因导入胶质瘤细胞株U251,SWO,观察p16基因短暂转染与长期稳定转染对胶质瘤细胞的作用,并筛选阳性克隆。同时以空载体质粒pCDNA3为对照,免疫组化,Northern杂交检测p16基因表达,对转染后细胞生长的抑制,细胞周期,凋亡及裸鼠致瘤能力的变化进行分析,结果：外源p16基因的高水平表达显著抑制了胶质瘤U251,SWO细胞的生长,克隆形成率减少,肿瘤细胞发生了G1期阻滞,p16基因短暂转染可诱导胶质瘤细胞凋亡,而长期稳定转染无明显的凋亡诱导作用。结论：外源野生型p16基因可抑制胶质瘤细胞恶性增殖并诱导细胞凋亡,肿瘤细胞的异质性特点与p16基因转染后的“自然选择”作用可能是p16基因长期稳定转染无明显凋亡诱导作用的主要机制。