脱细胞天然骨基质与诱导性成骨细胞的体外相容性

摘要 背景：前期工作表明TritonX-100处理的脱细胞骨基质已满足组织学和免疫学方面的修复要求。如果细胞能在材料表面很好地生长,将利于进一步进行体内动物实验。 目的：采用细胞培养法在体外评估脱细胞骨基质与诱导后成骨细胞的生物相容性。 方法：第3代骨髓基质干细胞经成骨诱导分化培养液诱导分化为成骨细胞,接种于TritonX-100处理的脱细胞骨基质及羟基磷灰石表面,检测成骨细胞的碱性磷酸酶表达并用扫描电镜观察材料表面的细胞生长情况。 结果与结论：碱性磷酸酶活性分析均表明,TritonX-100处理的脱细胞骨基质在培养48 h之后比羟基磷灰石更利于诱导成骨细胞生长;扫描电镜下可见,成骨细胞在脱细胞骨基质表面呈现立体生长方式,细胞呈球形,并且聚集成簇。体外实验结果显示成骨细胞与脱细胞天然骨基质有较好的生物相容性。 关键词：天然脱细胞骨基质;骨髓基质干细胞;成骨细胞;体外培养;生物相容性 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2011.12.013     

多孔碳酸钙陶瓷与干细胞源性成骨细胞的相容性

背景：国内外的研究证实普通碳酸钙陶瓷作为骨替代材料时具有细胞支架作用。 目的：观察多孔碳酸钙陶瓷与成骨细胞的相容性,及作为骨组织工程支架的可能性。 方法：SD大鼠骨髓基质干细胞经矿化诱导培养、扩增并检测证实其已具成骨细胞表型后,分别与多孔碳酸钙陶瓷支架、普通羟基磷灰石陶瓷支架体外复合培养。 结果与结论：骨髓基质干细胞经体外诱导形成成骨细胞,钙结节、Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶免疫染色结果阳性。多孔碳酸钙陶瓷支架材料与羟基磷灰石陶瓷材料皆有细胞附着生长,但多孔碳酸钙陶瓷支架材料细胞的黏附能力、增殖活力及成骨活性均强于羟基磷灰石陶瓷材料。提示多孔碳酸钙陶瓷支架材料与SD大鼠骨髓基质干细胞源性成骨细胞有良好相容性。     

人牙髓细胞复合不同孔径羟基磷灰石/磷酸三钙支架材料的生物学行为

摘要 背景：有文献表明,通过组织工程的方法将人牙髓细胞复合羟基磷灰石/磷酸三钙多孔支架材料修复牙缺损具有可行性。然而究竟多大孔径的支架材料最有利于人牙髓细胞的生长及分化,至今尚无定论。 目的：观察人牙髓细胞复合不同孔径羟基磷灰石/磷酸三钙支架材料后黏附、增殖和分化等生物学行为。 方法：人牙髓细胞接种至3种不同孔径的羟基磷灰石/磷酸三钙材料上,采用荧光显微镜以及扫描电镜检测细胞在材料表面的黏附生长情况,然后通过细胞的黏附率实验与MTT比色法观察人牙髓细胞在材料表面的黏附与增殖特性。不同孔径的羟基磷灰石/磷酸三钙支架复合人牙髓细胞后分别用生长培养基和矿化诱导液培养,于接种后第4,7,10天检测碱性磷酸酶活性。 结果与结论：人牙髓细胞在3种不同孔径支架材料表面和孔隙内均能顺利黏附并增殖。其中100~300 µm组支架材料黏附率最高,MTT结果显示接种3 d后300~500 µm组能较好地促进细胞增殖。培养10 d后,复合在100~300 µm和300~ 500 µm材料上的人牙髓细胞,其碱性磷酸酶活性显著高于500~700 µm组。提示与500~700 µm孔径相比,孔径为100~ 300 µm和300~500 µm的羟基磷灰石/磷酸三钙材料能更好地促进人牙髓细胞黏附、增殖和分化。     

纳米晶羟基磷灰石/胶原骨与骨髓间充质干细胞的相容性

背景：组织工程支架材料表面的微观和亚微观结构对细胞的黏附与生长有很重要的影响。利用纳米技术和三维造孔技术制备的纳米晶羟基磷灰石/胶原骨模仿了天然骨的成分与微结构特征。 目的：观察体外培养的人骨髓间充质干细胞与纳米晶羟基磷灰石/胶原骨的细胞相容性。 设计、时间及地点：单一样本观察，于2005-09/2006-12在江苏大学医学技术学院完成。 材料：纳米晶羟基磷灰石/胶原骨由清华大学材料科学与工程系研制。人骨髓间充质干细胞由健康成年志愿者自愿捐献，受试者对实验内容知情同意。 方法：全骨髓法体外培养骨髓间充质干细胞，应用成骨诱导剂（地塞米松、维生素C、β-磷酸甘油、碱性成纤维细胞生长因子）诱导向成骨细胞表型转化。将第3代骨髓间充质干细胞与纳米晶羟基磷灰石/胶原骨复合培养14 d。 主要观察指标：通过碱性磷酸酶组织化学染色、Von Kossa染色鉴定诱导培养的成骨细胞的细胞学特性。通过倒置显微镜、扫描电镜观察细胞生长及其在纳米晶羟基磷灰石/胶原骨上的生长情况。 结果：原代培养的骨髓细胞增殖迅速，10~ 12 d左右即可稳定传代，传代细胞7~9 d即可传代。经诱导培养的细胞碱性磷酸酶组织化学染色阳性，Von Kossa染色阳性，可见钙化的基质沉积，呈现典型的成骨细胞形态和生物学特征。构建的骨髓间充质干细胞与纳米晶羟基磷灰石/胶原骨共培养模型中，细胞可在纳米晶羟基磷灰石/胶原骨表面良好贴壁。复合培养8 d,分布于支架材料上的细胞大量增殖、分泌细胞外基质。复合培养14 d，大量细胞在材料表面和孔隙中生长，细胞之间广泛存在突起连接。 结论：纳米晶羟基磷灰石/胶原骨适合种子细胞的贴附、生长和增殖，细胞相容性良好。     

纳米级二氧化锆增韧羟基磷灰石生物复合陶瓷对兔骨髓基质干细胞增殖、分化的影响*☆

摘要 背景：课题组拟对纳米级二氧化锆增韧的羟基磷灰石生物陶瓷进行一些初步研究,主要集中在生物力学匹配性,化学稳定性,以及生物相容性实验,其中体外细胞培养实验具有可控性,可重复性,能很好地反映材料的生物相容性。 目的：比较纳米级二氧化锆增韧的羟基磷灰石、纯羟基磷灰石两种材料对兔骨髓基质干细胞增殖、分化的影响。 方法：将骨髓基质干细胞置于含体积分数为20%胎牛血清的DMEM培养基中培养,传代后改用含β-甘油磷酸钠,地塞米松和维生素C的条件培养基培养。取传至第3代的成骨细胞,以1.0×108 L-1浓度接种于放有材料块的细胞培养板中,培养第1~10天倒置相差显微镜观察细胞生长情况,绘制细胞生长曲线,并进行碱性磷酸酶活性检测。培养第6天的细胞和材料复合物用多聚甲醛固定进行扫描电镜观察。 结果与结论：MTT法测得两种材料培养的细胞生长曲线无显著差异。复合培养的兔骨髓基质干细胞能够保持正常分泌碱性磷酸酶的功能。电镜照片也同样证实了两种材料表面均有细胞的附着。说明纳米级二氧化锆增韧的羟基磷灰石、纯羟基磷灰石均不影响成骨细胞增长分化,具有优良的成骨细胞相容性。 关键词：羟基磷灰石;二氧化锆增韧羟基磷灰石;成骨细胞;生物相容性;生物材料 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2011.03.017     

聚乳酸-壳聚糖纤维/羟基磷灰石-硅酸钙复合支架材料的细胞相容性

背景：实践证明,有机和无机材料单独应用都不是理想的支架材料。聚乳酸具有良好的生物相容性、生物降解性和生物吸收性,聚乳酸类复合材料将成为21世纪最重要的生物复合材料之一。 目的：观察复合支架材料聚乳酸-壳聚糖纤维/羟基磷灰石-硅酸钙对成骨细胞黏附、增殖、分化的影响。 方法：取新生24 h内Wistar大鼠的颅盖骨,采用改良胶原酶消化法进行成骨细胞原代培养。通过倒置相差显微镜、苏木 精-伊红染色、碱性磷酸酶染色、钙结节茜素红染色对获得的细胞进行生物学特性的观察与鉴定。然后将第3代细胞与聚乳酸/壳聚糖纤维、聚乳酸-壳聚糖纤维/硅酸钙、聚乳酸-壳聚糖纤维/羟基磷灰石-硅酸钙三种支架材料体外复合培养。培养3,6,9 d后,采用倒置相差显微镜观察材料周边的细胞形态,通过碱性磷酸酶活性测定法和MTT法观察3种支架材料对细胞分化、增殖的影响。 结果与结论：三种材料均有利于成骨细胞的黏附、生长、分化、增殖,而聚乳酸-壳聚糖纤维/羟基磷灰石-硅酸钙复合支架材料较聚乳酸/壳聚糖纤维、聚乳酸-壳聚糖纤维/硅酸钙支架材料促进成骨细胞的分化增殖效果更好,证实其生物相容性好,有望成为一种新型的骨组织工程支架材料。 关键词：复合支架;细胞相容性;生物材料;成骨细胞;组织工程支架材料;骨组织工程 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.08.016     

丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架对骨髓间充质干细胞增殖分化的支持：优于胶原海绵材料吗？

背景：传统的羟基磷灰石强度低、孔隙度小、骨诱导性和传导性较差。因此,人们采用各种方法制备羟基磷灰石生物复合材料,以改进其性能。 目的：观察丝素蛋白/羟基磷灰石复合材料对骨髓间充质干细胞生物特性的影响,并与常用的胶原海绵相比较。 设计、时间及地点：重复测量观察及多样本观察实验,于2007-01/2008-06在苏州大学附属第一医院骨科实验室完成。 材料：丝素蛋白/羟基磷灰石纳米材料由苏州大学材料学院李明忠教授研制提供,胶原海绵购买于上海其胜公司。 方法：取SD大鼠股骨和胫骨分离提取骨髓间充质干细胞,进行培养,传代。取第3代骨髓间充质干细胞分别接种到丝素蛋白/羟基磷灰石复合材料及三维胶原海绵材料上进行共培养。未加材料,单独培养细胞,作为空白对照组。 主要观察指标：应用倒置显微镜观察细胞生长情况;在培养第2,4,6,8天用MTT法测定细胞增殖情况及测定碱性磷酸酶活性。 结果：①倒置显微镜显示骨髓间充质干细胞能在两种材料上良好地黏附、增殖和生长。②MTT法检测显示两种材料上的细胞增殖明显,碱性磷酸酶活性随培养时间延长而增加,均高于空白对照组。 结论：丝素蛋白/羟基磷灰石复合材料显示出良好的生物相容性,并能促进细胞生长分化,其有望成为胶原组织工程支架材料很好的补充和替代。 关键词：丝素蛋白;羟基磷灰石;组织工程;骨髓间充质干细胞;增殖分化     

羟基磷灰石/胶原蛋白复合支架上骨髓间充质干细胞的增殖与分化

摘要 背景：最近胶原蛋白作为细胞体外三维立体支架材料被大量用于组织工程,但胶原蛋白支架材料机械强度低,很难承受较大外力,为此将胶原蛋白与羟基磷灰石制成复合支架材料,探索复合支架的生物相容性和生物活性。 目的：验证大鼠骨髓间充质干细胞在羟基磷灰石/胶原蛋白复合支架上的增殖与分化情况。 方法：贴壁法分离SD大鼠骨髓间充质干细胞,分别在平板、胶原支架、羟基磷灰石/胶原蛋白复合支架上,观察3种条件下细胞的生长状况,四甲基偶氮唑盐法检测其增殖情况。培养14,21 d后,考察细胞碱性磷酸酶活性及胶原蛋白分泌量。 结果与结论：发现骨髓间充质干细胞在羟基磷灰石/胶原蛋白复合支架上铺展良好,其增殖率显著高于纯胶原蛋白支架上培养的细胞,并高于平板培养细胞。骨髓间充质干细胞在羟基磷灰石/胶原蛋白复合支架上的碱性磷酸酶活性及胶原蛋白分泌量明显高于纯胶原蛋白支架,高于平板培养。结果提示,羟基磷灰石/胶原蛋白复合材料能促进骨髓间充质干细胞的增殖和分化,并诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。 关键词：胶原蛋白;羟基磷灰石;骨组织工程;骨髓间充质干细胞;支架 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.47.014     

自制小牛脱蛋白松质骨与兔皮质骨来源成骨细胞的生物相容性

背景：异种脱蛋白骨与宿主骨骼具有相同的结构,抗原性较低,不会或很少引起宿主免疫反应。 目的：观察自制小牛脱蛋白松质骨与兔皮质骨来源成骨细胞的生物相容性。 方法：将自制小牛脱蛋白松质骨与新西兰大白兔成骨细胞复合培养,设单纯成骨细胞对照组,观察细胞生长、支架材料降解及细胞与支架材料附着情况。 结果与结论：小牛脱蛋白松质骨为多孔网状,孔隙互相通连,细胞在其上附着、生长、增殖。复合培养第3天,有较多的细胞黏附并铺展在支架上;第6天,细胞在支架上完全伸展,呈长梭形;第10天细胞分泌较多基质,重叠生长并连接成网状。实验组复合培养9,12 d时成骨细胞的增殖及分泌情况明显优于对照组(P < 0.05),碱性磷酸酶活性与骨钙素表达高于对照组(P < 0.05)。表明兔皮质骨成骨细胞增殖和成骨能力强,自制的小牛脱蛋白松质骨具有骨诱导性,二者复合具有良好的生物相容性。     

人胚胎骨骨膜来源成骨细胞的分离培养与生物学特性

背景：胚胎骨来源成骨细胞因其低免疫原性和高增殖与成骨活性有可能成为适用于骨组织工程方法异体骨组织缺损修复的种子细胞。冻存复苏后的生物学特点是否能进行进一步临床应用研究有待证实。 目的：建立人胚胎骨骨膜来源成骨细胞的分离培养、保存方法,观察骨膜来源成骨细胞生物学特点。 设计、时间及地点：细胞形态学与生物学特性实验研究,于2005-04/2006-05在天津市口腔医院细胞与组织工程实验室完成。 材料：细胞来源为5月龄自然流产胎儿,产妇及家属知情同意,无菌条件下取长骨骨膜组织。 方法：采用组织块法对成骨细胞进行原代培养,传代培养细胞液氮冻存3~6个月后,选择不同代次细胞复苏培养。 主要观察指标：通过形态学、超微结构,细胞增殖曲线,钙结节Von kossa法染色以及细胞内碱性磷酸酶定量检测与钙钴法染色确定其增殖与成骨活性。 结果：组织块法培养骨膜来源成骨细胞第6天即可获得原代细胞增殖,传代扩增细胞具有典型成骨细胞形态学和生物学活性。苏木精-伊红染色密集融合的成骨细胞与细胞外基质显示转化为脊样骨组织结构排列。经统计学分析定量检测成骨细胞碱性磷酸酶活性与细胞密度有线性正相关关系。液氮冷冻保存后复苏培养复层成骨细胞钙钴法碱性磷酸酶染色阳性率在45%以上,超微结构显示为高分化功能活跃成骨细胞。 结论：胚胎骨骨膜来源成骨细胞具有良好的增殖与成骨活性。深低温液氮冻存成骨细胞复苏后仍能连续传代增殖并具有良好的成骨代谢活性,能够体外借助细胞外基质形成骨样结构。     

模拟失重状态下成骨细胞胰岛素样生长因子1基因表达与降钙素的干预

背景：航天飞行、长期卧床等低重力负荷状态会引起骨吸收和骨形成的代谢紊乱,导致骨质疏松。有研究显示降钙素有直接促进成骨细胞增殖的作用,并可增加成骨细胞胰岛素样生长因子1 mRNA的表达。 目的：观察降钙素和体外模拟失重状态对成骨细胞功能及胰岛素样生长因子1基因表达的影响。 方法：采用二次酶消化法提取新生SD大鼠颅骨的成骨细胞,凝胶化形成成骨细胞海藻酸钠微包囊后进行实验。实验分为正常重力组、模拟失重组、模拟失重+降钙素(10,40,80 IU/L)组。将细胞置于模拟失重三维回转培养器中培养72 h后,检测成骨细胞的增殖、凋亡及碱性磷酸酶活性;采用RT-PCR 方法检测胰岛素样生长因子1、碱性磷酸酶、骨钙素mRNA的表达。 结果与结论：与正常重力组比较,模拟失重组细胞增殖率及培养基中碱性磷酸酶活性均明显降低(P < 0.01),胰岛素样生长因子1、骨钙素、碱性磷酸酶mRNA表达减少,凋亡增多;与模拟失重组比较,模拟失重+降钙素组细胞增殖率,胰岛素样生长因子1、骨钙素、碱性磷酸酶mRNA表达均有所增加,但无剂量依赖关系。说明降钙素可通过上调胰岛素样生长因子1 mRNA表达改善模拟失重条件下成骨细胞的增殖与分泌功能。     

胶原-纳米羟基磷灰石复合支架的细胞相容性

背景：观察成骨细胞在生物材料上的形态、增殖和分化等项目,可评估生物支架材料的生物相容性。 目的：观察复合支架材料纳米羟基磷灰石/胶原对成骨细胞增殖、分化的影响。 方法：取新生24 h内Wistar大鼠的颅盖骨,采用改良胶原酶消化法进行成骨细胞原代培养,取第3代细胞与纳米羟基磷灰石/胶原支架或普通羟基磷灰石材料体外复合培养。培养3,6,9 d后,观察材料周边的细胞形态及支架材料对细胞分化、增殖的影响。 结果与结论：纳米羟基磷灰石/胶原材料较普通的羟基磷灰石材料更有利于成骨细胞的黏附、生长、分化、增殖,证实其生物相容性更好,有望成为一种新型的骨组织工程支架材料。     

静磁场作用下金属离子对成骨细胞的毒性

背景：体内体外实验研究证明,静磁场具有促进成骨细胞分化及骨形成的作用。 目的：观察静磁场作用下金属离子对成骨细胞毒性的影响。 方法：将CoCl2粉末与CrCl3粉末溶于无菌注射用水配制成CoCl2溶液和CrCl3溶液,将金属离子Co2+、Cr3+分别与小鼠颅骨成骨细胞(MC3T3-E1)在不同的磁场强度(1,10,100 mT)下共培养。实验分4组：设Co2++Cr3+组(对照组)和Co2++Cr3+ 分别+1,10,100 mT组。 结果与结论：恒磁场作用下的成骨细胞呈现更加成熟的形态学特征,Co2+、Cr3+金属离子对成骨细胞MC3T3的毒性明显降低;同时G2M(分裂期)分布比例明显增加,细胞停滞在G0G1(休眠期)的比率明显减少;与对照组相比,不同场强磁场加载后,成骨细胞碱性磷酸酶活性明显增强(P < 0.05)。提示一定强度的静磁场可拮抗Co2+、Cr3+金属离子对成骨细胞的毒性作用。     

假体磨损颗粒钴铬离子影响成骨细胞增殖及RANKL、骨保护素的表达

背景：金属-金属假体置入体内后可以发生腐蚀或磨损,释放镍、钴、铬、钛等金属离子,诱导局部炎性因子的释放。 目的：观察Co2+、Cr3+对小鼠成骨细胞增殖的影响,以及成骨细胞暴露在Co2+ 、Cr3+条件下RANKL、骨保护素基因的表达。 方法：体外培养成骨细胞,实验分两组,对照组给予生理盐水,离子组给予钴、铬离子干预。 结果与结论：显微镜直接计数法显示干预后1~6 d对照组随时间推移细胞数目显著增加,离子组则增加不明显。共培养24,48 h后,RT-PCR结果显示离子组RANKL、骨保护素基因表达较对照组均增加,以RANKL增加更显著(P < 0.05),RANKL/OPG mRNA的比率也明显增加。提示金属离子对成骨细胞的增殖有显著抑制作用,且可刺激成骨细胞RANKL、骨保护素mRNA的表达。     

不同强度静磁场对成骨细胞细胞骨架改建的影响☆

背景：静磁场对成骨细胞增殖活性、细胞因子分泌及碱性磷酸酶表达等功能活性影响的机制尚不清楚。 目的：观察不同强度静磁场加载对成骨细胞骨架改建和细胞骨架蛋白表达的影响。 方法：取新生24 h内SD大鼠颅骨进行成骨细胞的培养和鉴定。采用静磁场加载装置对体外培养的成骨细胞进行0,8,50,160 mT的静磁场加载,分别于静磁场加载24,48,72 h应用BODYPY-Phaloidin进行成骨细胞骨架染色,激光扫描共聚焦显微镜和图像处理软件Image J测定细胞骨架蛋白的荧光强度。 结果与结论：8,50,160 mT静磁场加载24,48,72 h,荧光标记的成骨细胞骨架蛋白向细胞核周围集中,荧光强度增强(P < 0.05),其中经50 mT静磁场加载的成骨细胞骨架蛋白的荧光最强。说明一定强度的静磁场可以影响成骨细胞骨架的改建和重组。     

掺锶聚磷酸钙的细胞相容性

摘要 背景：研究显示，以可降解生物陶瓷聚磷酸钙为基材，加入微量锶元素，通过调控材料结构如孔径、孔隙率等性能，可制备出有足够力学强度并可控降解的掺锶聚磷酸钙。 目的：观察成骨细胞与掺锶聚磷酸钙的细胞相容性。 方法：将兔成骨细胞与不同含锶质量分数(0~100%)的掺锶聚磷酸钙体外复合培养，进行形态学和功能测定。MTT法检测掺锶聚磷酸钙中成骨细胞的活力，并测定成骨细胞碱性磷酸酶活性。 结果与结论：在倒置显微镜、扫描电子显微镜和激光共聚焦显微镜下观察到成骨细胞在掺锶聚磷酸钙的表面和孔隙内大量黏附、增殖和生长，并且分泌细胞外基质及细胞表面的大量微绒毛，显示成骨细胞在掺锶聚磷酸钙材料上生长形态良好；同时通过MTT和碱性磷酸酶测定表明细胞功能良好，其中含锶1%掺锶聚磷酸钙细胞增殖活性及碱性磷酸酶活性最高，对成骨细胞无毒性，具有良好的细胞相容性。 关键词：掺锶聚磷酸钙；成骨细胞；锶；细胞相容性；生物材料 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.42.013     

Activated protein C stimulates osteoblast proliferation via endothelial protein C receptor

Introduction

Bone is continually remodeled by the action of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts. Resting osteoblasts are able to proliferate and differentiate into mature osteoblasts when physiologically required, as after tissue injury. Activated protein C (APC) is a serine protease that functions in anticoagulation, anti-inflammation, anti-apoptosis, cell proliferation, and wound repair. In this study, we examined the effect of APC on osteoblast proliferation and differentiation.

Materials and Methods

We examined the presence of protein C in human fracture hematoma by immunohistochemical staining. We then evaluated the effect of APC, diisopropyl fluorophosphate-inactivated APC (DIP-APC) or protein C zymogen on normal human osteoblast (NHOst) proliferation using tetrazolium salt assay in the presence or absence of aprotinin, hirudin, protein C, antibody against protein C, endothelial protein C receptor (EPCR) or protease-activated receptor (PAR)-1. Finally, activation of p44/42 MAP kinase was evaluated by Western blot analysis.

Results

Both APC and DIP-APC increased osteoblast proliferation in a dose-dependent manner, while protein C did not. The APC-induced increased proliferation of osteoblast was not affected by aprotinin, hirudin, and anti-protein C antibody which inhibits the protease activity of APC. Treatment with protein C or anti-EPCR antibody which inhibits APC binding to EPCR inhibited APC-mediated osteoblast proliferation, while treatment with anti-PAR-1 antibody did not. APC promoted the phosphorylation of p44/42 MAP kinase within osteoblasts; this effect was inhibited by the anti-EPCR antibody.

Conclusions

APC stimulates osteoblast proliferation by activating p44/42 MAP kinase through a mechanism that requires EPCR but not PAR-1 or the proteolytic activity of APC. APC generated at fracture sites may contribute to fracture healing by promoting osteoblast proliferation.