问号钩端螺旋体赖株基因组中一个新溶血基因的表达及功能鉴定

目的对问号钩端螺旋体赖株基因组中LA0202基因进行克隆表达并对重组蛋白的溶血活性进行初步鉴定。方法以问号钩端螺旋体赖株基因组DNA为模板,PCR扩增LA0202基因并重组到原核表达载体pET28b(+),重组质粒经限制性核酸内切酶酶切并经测序鉴定后,在大肠埃希菌BL21中诱导表达重组蛋白。制备绵羊血平板对表达的重组蛋白进行溶血活性鉴定。RT-PCR检测钩端螺旋体赖株体外培养时LA0202基因的转录。结果在大肠埃希菌中成功表达LA0202基因,表达的重组蛋白具有溶血活性。RT-PCR结果显示钩端螺旋体赖株体外培养时LA0202基因发生了转录。结论问号钩端螺旋体赖株体外培养时LA0202基因发生了转录,LA0202可能为一个新的溶血素基因。     

问号钩端螺旋体胶原酶在钩体病豚鼠模型的肺组织中的表达

目的通过克隆、表达问号钩端螺旋体赖型赖株的胶原酶基因colA(LA0872),以及制备抗胶原酶的多克隆抗体,观察胶原酶在钩体病豚鼠模型的组织中的表达,为研究其致病机制奠定基础。方法以问号钩端螺旋体赖型赖株基因组DNA为模板,用PCR扩增colA,产物克隆到表达载体pET-28b(+)中,构建含colA的重组质粒;将重组质粒转入E.coli Rosetta(DE3)菌株内,IPTG诱导表达后用Ni-NTA His-Bind亲和层析柱纯化重组蛋白;用纯化的重组蛋白免疫家兔制备抗胶原酶的多克隆抗体;Max Vision二步法染色检测胶原酶在感染钩端螺旋体的豚鼠肺组织中的分布。结果克隆表达目的基因,并成功制备了抗胶原酶的多克隆抗体。免疫组化显示在出血的肺组织中存在胶原酶。结论钩体病豚鼠模型的肺组织中有胶原酶的表达,并且存在于有钩端螺旋体分布的部位。本研究为进一步探讨胶原酶在钩端螺旋体侵袭和宿主组织出血中所起的作用奠定了基础。     

钩端螺旋体的分子分型方法

钩端螺旋体（Leptospira,简称钩体）,属于螺旋体目螺旋体科钩端螺旋体属,分为两个种：双曲钩端螺旋体（Leptospira biflexa）和问号钩端螺旋体（Leptospira interrogans）;前者为腐生性钩端螺旋体,通常对人和动物不致病;后者为寄生性、     

螺旋体传染病

洪雅县钩端螺旋体病流行特征分析；问号钩端螺旋体lipL21基因改建及其表达产物免疫原性变化和定位；梅毒螺旋体TpN15重组抗原的克隆与表达;杭州市莱姆病血清流行病学调查;     

健康人群血清钩端螺旋体抗体调查

钩端螺旋体病（Leptospirosis，简称钩体病），是由致病性钩端螺旋体（Leptospira interrogans，简称钩体）引起的一种分布广泛的自然疫源性疾病，我国是受钩体病危害十分严重的国家。1937年汤择光首次报告3例钩端螺旋体病，1955年本病被列入法定传染病，迄今全国累计发病人数已超过250万。平均病死率约为1％。近年来我校面向全国十几个省市自治区招生，我们曾对本省籍在校学生钩端螺旋体感染情况进行过研究，为了解来自其他省市自治区学生钩端螺旋体感染状况，我们又对本校2003、2004级外省籍学生进行了血清钩端螺旋体抗体检测。     

螺旋体传染病

钩端螺旋体主要属特异性蛋白抗原分布及其免疫性研究，钩端螺旋体毒力因子研究现状，肺出血型钩端螺旋体病CT表现及与临床的关系（附17例分析），钩端螺旋体HpL21基因真核表达质粒的构建及其在HeLa细胞中的表达。     

江西口岸及国检监管区鼠类感染钩端螺旋体的检测及基因序列分析

目的为了解江西省口岸及国检监管区鼠类携带的钩端螺旋体情况,2015年7-12月,对江西省2个一类口岸和9个国检监管区捕获的鼠类携带的钩端螺旋体进行了检测。方法采用荧光定量PCR和特异性PCR扩增两种方法对样本进行检测。结果研究发现捕获的107只鼠类中存在12例致病性钩端螺旋体阳性,阳性率为11.2%。包括褐家鼠6只,黄毛鼠3只,黄胸鼠1只,社鼠2只,分布在昌北机场、康替龙国检监管区、南丰国检监管区、鹰潭国检监管区和瑞金国检监管区。同源性对比和系统进化分析显示,12例钩端螺旋体中11例为问号钩端螺旋体,另1例为博氏钩端螺旋体。结论在江西口岸及国检监管区鼠类中存在问号钩端螺旋体和博氏钩端螺旋体感染。两种PCR检测方法均可适用于口岸及国检监管区对钩端螺旋体的检测,防止相应传染病在口岸的爆发与传播,保卫口岸安全。     

钩端螺旋体赖株豚鼠感染模型的建立和免疫组化法对钩体抗原的检测

目的　建立钩端螺旋体赖型赖株感染豚鼠的动物模型 ,并用免疫组化法检测钩端螺旋体抗原在组织中的分布。方法　不同剂量钩端螺旋体赖株通过腹腔内注射感染豚鼠 ,观察豚鼠发病情况 ,及时解剖死亡豚鼠 ,HE染色观察肝、肾、肺等器官病变 ,EnVision二步法染色检测肝、肾、肺组织中钩体抗原。结果　感染后豚鼠发病 ,死亡与感染的钩端螺旋体剂量明显相关 ,大体标本及HE染色光镜下均出现典型钩体病病变。免疫组化显示在肝、肾、肺组织中均存在钩体抗原。结论　通过钩端螺旋体赖株腹腔注射的方法成功地建立了豚鼠动物模型。应用EnVision二步法染色 ,可有效显示组织中的钩体抗原。为进一步研究钩端螺旋体发病机制奠定了基础。     

广西钩端螺旋体病致死因素的相关性研究

目的 为了解广西钩端螺旋体病的发病机制,掌握钩端螺旋体致死因素及其相关性因素,提出钩端螺旋体病的防治对策.方法 收集2003～2005年广西的钩端螺旋体死亡病例的个案调查表进行回顾性分析研究.结果 7例患者中有6例是因肺出血而死亡,1例是因肾型合并DIC而死亡;7例患者均有接触疫水或疫土的接触史,并且都有发热、全身乏力、腓肠肌压痛等典型钩端螺旋体病的临床症状和体征.结论 广西钩端螺旋体病的致死因素与其流行季节、接触史相关,并且与赫氏反应有关.     

不同毒力钩端螺旋体引起的细胞因子表达的差异

目的通过比较不同毒力钩端螺旋体引起豚鼠细胞因子表达的差异,探讨钩端螺旋体病的炎症反应及其发病机制。方法豚鼠腹腔内分别注射致病性钩端螺旋体赖型有毒株Lai株,赖型无毒株IPAV株,以及非致病性钩端螺旋体Patoc型Patoc1株,观察豚鼠各脏器的病理改变;EnVision二步法检测钩端螺旋体在各脏器中的分布;应用Real-ti me RT-PCR法检测豚鼠血液中细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-12、MCP-1mRNA的表达。结果钩端螺旋体IPAV株和Patoc1株不能引起豚鼠组织病变,但是在感染早期引起细胞因子的高表达;而Lai株可以引起典型的钩端螺旋体病病变,但是在感染早期引起细胞因子较低表达。结论致病性钩端螺旋体赖型毒力株Lai株引起的细胞因子的表达明显低于非致病钩端螺旋体Patoc型Pa-toc1株和赖型无毒株IPAV株,可能与钩端螺旋体病炎症反应轻微有关,有利于钩端螺旋体逃避宿主的免疫反应,在体内繁殖扩散。     

钩端螺旋体外膜蛋白LipL32的重组表达及在ELISA检测中的初步应用

目的 构建L32—pQE32重组质粒，诱导表达重组钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL32，建立以重组外膜蛋白为基础的抗体间接ELISA检测方法。方法 采用PCR法从钩端螺旋体DNA中获取编码LipL32的基因片段。构建重组克隆载体pGEM—T／L32和表达载体L32—pQE32。转化受体菌E．coliDH5α和E．coliM15，IPTG诱导表达重组LipL32蛋白。Ni—NTA亲和层析纯化重组LipL32蛋白。以纯化的重组LipL32蛋白为抗原。特异的钩体抗血清进行ELISA实验。结果 扩增出约750bp的LipL32成熟蛋白基因。LipL32基因插入pQE32表达载体。表达产物6个组氨酸与LipL32蛋白的融合蛋白相对分子量约为31kDa。与预期27．6kDa大小一致。SDS-PAGE电泳显示：LipL32蛋白主要以包涵体形式表达。ELISA显示LipL32蛋白能与钩体抗血清特异结合。方阵滴定试验确定以100ng／孔包被酶标板，酶标抗体稀释度1：20000作为工作浓度。结论 LipL32蛋白能在大肠杆菌中表达，Ni—NTA亲和层析可有效纯化重组LipL32蛋白。重组LipL32蛋白具有结合活性。初步建立了以重组LipL32蛋白为抗原的钩端螺旋体抗体间接ELISA检测方法。     

钩端螺旋体lipL21基因真核表达质粒的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的构建钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL21基因片段的真核表达重组质粒．利用脂质体体外转染HeLa细胞，探讨其在体外真核细胞中的表达情况，为寻找新的预防钩端螺旋体病的候选疫苗分子提供实验依据。方法应用PCR技术从钩端螺旋体黄疸出血群赖型56601株基因组模板中扩增lipL21基因，纯化回收后克隆入pUCM-T载体，再亚克隆入真核表达载体poD-NA3．1（＋），运用脂质体2000将重组体pcDNA3．1（＋）-lipL21转染入HeLa细胞，细胞免疫组化法观察目的基因的表达。结果双酶切及测序鉴定证明成功构建了lipL21真核表达重组体pcDNA3．1（＋）-lipL21，DNA测序显示重组质粒含有561bp的目的基因片段，读码框架正确，无碱基错配及移码突变。重组质粒pcDNA3．1（＋）-lipL21体外在HeLa细胞中能有效表达目的蛋白LipL21。结论成功构建了钩端螺旋体lipL21基因真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-lipL21，且能够在体外真核细胞中表达；为进一步筛选新的预防钩端螺旋体病的候选疫苗分子奠定了一定的实验基础。     

钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL32的克隆、表达及应用于致病性钩体免疫血清的检测

目的选取钩端螺旋体黄疸出血群(56601株)外膜脂蛋白LipL32进行克隆、表达和纯化,以获得能应用于致病性钩体检测的纯化重组蛋白。方法用PCR法扩增黄疸出血群(56601株)外膜脂蛋白LipL32基因,与表达载体pET-30a连接并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组蛋白,免疫印迹(WB)鉴定活性后用电洗脱法进行纯化。将纯化的重组蛋白用间接和夹心ELISA法应用于22株兔免疫血清的检测,检测结果与钩体显微镜凝集试验(MAT)进行比较。结果重组表达质粒在大肠杆菌中表达高产量的重组蛋白,WB结果显示重组蛋白具有免疫活性。纯化的重组蛋白对15株钩体标准致病株兔免疫血清全部检出,对7株腐生性钩体株兔免疫血清全部未检出,与MAT检测结果相符。结论黄疸出血群(56601株)外膜脂蛋白LipL32基因在大肠杆菌中成功表达,重组蛋白可应用于致病性钩体血清抗体的检测,为研制致病性钩体抗体检测试剂奠定了基础。     

Development of a duplex-polymerase chain reaction for rapid detection of pathogenic Leptospira

A duplex-polymerase chain reaction (PCR) for the rapid detection of pathogenic leptospires was developed by using two sets of newly designed primers which amplified in the same reaction two different DNA fragments simultaneously: 279-bp of LipL32 and 430-bp of 16S rRNA. For DNA extraction from bacterial cultures, the silica-based spin column method was found to be more suitable and was selected for the extraction of DNAs from all 92 bacterial strains including 56 strains of pathogenic Leptospira, 15 strains of non-pathogenic Leptospira and 21 other strains of bacteria. The PCR products were analyzed by agarose gel-electrophoresis with confirmation by Southern and dot hybridization using synthetic DNA probe prepared from LipL32 gene of a pathogenic reference strain, L. interrogans serovar pyrogenes. The duplex-PCR allowed detection of two products of 279 bp and 430 bp in all pathogenic Leptospira. Non-pathogenic Leptospira generated a single product of 430 bp. Other bacterial strains failed to reveal any amplification products. As little as 1 pg of pure DNA corresponding to 100 cells could be detected by agarose gel-electrophoresis, and 1-10 fg of pure DNA by hybridization.     

LA0202为钩端螺旋体中一孔形成溶血素蛋白(英文)

目的研究LA0202为孔形成溶血素。方法体外克隆表达LA0202蛋白。纯化的LA0202蛋白作用绵羊血细胞观察LA0202的溶血活性并用渗透压保护剂PEG6000添加到作用体系研究渗透压保护剂对LA0202溶血活性的影响。透射电镜及扫描电镜观察LA0202作用于体外培养的肝细胞后对细胞的毒性。结果渗透压保护剂PEG6000能够抑制LA0202的溶血活性。LA0202作用于肝细胞后引起肝细胞的毒性损伤。结论LA0202为一孔形成溶血素。     

广州市鼠类动物钩端螺旋体的感染调查

目的 调查广州市鼠类动物中钩端螺旋体病的流行情况和遗传特征。方法 笼捕法捕捉鼠类动物,采集脾组织提取总DNA,通过PCR技术检测钩端螺旋体16S rRNA和LipL32基因,测序后进行系统进化分析。结果 采集褐家鼠170只、板齿鼠4只、黄胸鼠3只、黄毛鼠1只和臭鼩鼱22只,共200只鼠类动物,在褐家鼠中检测到钩端螺旋体阳性样本3个,总阳性率1.5%,系统发育分析显示,3份阳性样本序列与致病性问号钩端螺旋体位于进化树上的同一个分支。结论 广州地区鼠类动物中存在致病性问号钩端螺旋体,本地人群存在一定的感染风险。     

环介导等温扩增技术检测钩端螺旋体的研究

目的 利用环介导等温扩增技术,建立检测钩端螺旋体的方法。方法 选取钩体LipL32基因,设计了LAMP引物。对27株钩体、25株非钩体样本予以检测,然后进行灵敏度和模拟样本的研究。结果 扩增27株钩体结果为阳性,扩增25株非钩体结果为阴性。灵敏度为200拷贝/μL,模拟样本检测下限为200条钩体/μL(煮沸法)和20条钩体/μL(试剂盒提取法)。结论 LAMP实验操作简单,对设备要求不高,可以作为钩体的快速检测方法。     

空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18的B细胞抗原表位分析及功能鉴定

目的 从生物信息学角度了解空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18的跨膜结构、B细胞抗原表位及其抗原性、基因序列保守性等特征,并鉴定空肠弯曲菌主要外膜蛋白优势B细胞抗原表位,为后续抗体检测和疫苗研究提供实验依据。方法 使用NCBI/Blast,TMHMM Server V2.0,DNA Star等生物信息学分析软件对空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18进行蛋白跨膜结构预测、线性B细胞抗原表位及其抗原性分析、并对不同空肠弯曲菌OMP18蛋白的氨基酸序列同源性进行比较。采用空肠弯曲菌全菌抗体IgG为一抗,基于ELISA技术对优势线性B细胞抗原表位进行筛选鉴定。结果 生物信息学预测结果表明外膜蛋白OMP18定位于空肠弯曲菌外膜且不存在跨膜结构。蛋白序列保守存在于各空肠弯曲菌株中,序列同源性达95%以上。同时,我们发现该外膜蛋白中存在3个明显的B细胞线性表位,且具有很强的抗原性。ELISA检测鉴定结果表明3个B细胞抗原表位都能有效识别空肠弯曲菌全菌抗体。结论 空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18保守存在于细菌表面,存在3个重要的B细胞线性抗原表位,可用于后续的抗体检测和疫苗开发研究。