豚鼠糖尿病性膀胱病逼尿肌中c-kit mRNA和蛋白的表达变化及意义

目的: 检测豚鼠糖尿病性膀胱病(DCP)逼尿肌中酪氨酸蛋白激酶生长因子受体(c-kit)mRNA和蛋白的表达水平,探讨c-kit表达与DCP的关系及其发病机制。方法: 60只豚鼠随机分成对照组20只,实验组40只,实验组采用链脲佐菌素(STZ)建立糖尿病豚鼠模型,2组豚鼠饲养10周后运用尿动力学检测并将实验组筛选出DCP组和糖尿病性非膀胱病(NDCP)组,应用RT-PCR、激光共聚焦显微镜技术分别检测各组膀胱组织c-kit mRNA和蛋白的表达。结果: DCP组c-kit mRNA表达显著低于对照组(P<0.01)及NDCP组(P<0.05),相对平均吸光度值分别为4.65±0.47、5.66±0.54、5.54±1.28。糖尿病性膀胱病组c-kit蛋白表达明显低于对照组(P<0.01)与NDCP组(P<0.01),c-kit蛋白荧光值分别为548.69±48.51、844.67±59.24、856.52±53.03。结论: 豚鼠DCP逼尿肌中c-kit mRNA、c-kit蛋白表达减少,导致c-kit信号通路异常,从而使Cajal样细胞在膀胱中的功能减弱而导致逼尿肌功能障碍发生DCP,因此c-kit表达异常可能是DCP的发病机制之一。     

糖尿病大鼠膀胱肾上腺素能α_1受体表达改变

目的研究糖尿病大鼠膀胱结构功能的改变及其肾上腺素能α1受体及其亚型的表达改变,并探讨其意义。方法采用1%链脲佐菌素(STZ)建立糖尿病大鼠的模型,实验分为正常对照组和糖尿病组。分别于2周、4周、6周进行在体充盈性膀胱测压评估膀胱功能,处死动物后取膀胱组织标本常规HE染色观察膀胱逼尿肌病理组织学变化,并采用Western blot与免疫荧光检测α1受体亚型(α1A受体与α1D受体)的表达改变。结果糖尿病大鼠体重减轻,尿量和膀胱湿重增加;充盈性膀胱测压检查结果显示糖尿病大鼠膀胱容量、顺应性、逼尿肌压力上升,残余尿量明显增加,排尿效率明显降低;常规HE染色光镜下观察可见糖尿病大鼠膀胱逼尿肌肌束进行性结构松散、紊乱,甚至出现肌束断裂。Western blott结果显示α1A受体及α1D受体的表达在逼尿肌中表达量随病程进行性下降,糖尿病组与正常对照组间对比差异有统计学意义。免疫荧光结果显示糖尿病膀胱实验组α1A受体和α1D受体灰度值均较相应对照组减少,且随病程进行性减少。结论糖尿病大鼠早期即可出现膀胱逼尿肌形态学和功能的改变,糖尿病膀胱中的α1-AR表达存在负相关关系,提示糖尿病可引起膀胱部位α1-AR表达减少。α1-AR表达减少可能是引起糖尿病膀胱顺应性增加,残余尿量增加的影响因素之一。     

干细胞因子对高糖环境下豚鼠膀胱Cajal样间质细胞c-kit mRNA及蛋白表达的影响

目的 观察干细胞因子(stem cell factor,SCF)对高糖环境下豚鼠膀胱Cajal样间质细胞c-kit mRNA及蛋白的表达影响.方法 胶原酶消化法原代分离培养豚鼠膀胱Cajal样间质细胞,培养24 h后分别加入葡萄糖浓度为5 mmol/L(正常对照组)、15 mmol/L(高糖组)培养基培养72 h后,高糖组分为高糖对照组、SCF干预组(50 ng/ml、100 ng/ml),分别继续培养24 h、72 h,应用RT-PCR、激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)分别检测膀胱Cajal样间质细胞c-kit mRNA和蛋白表达变化.结果 高糖对照组较正常对照组c-kit mRNA及蛋白表达均明显下降.24 h组中,SCF50 ng/ml较高糖对照组c-kit mRNA(P>0.05)和蛋白表达(P>0.05)差异不大,SCF100 ng/ml较高糖对照组c-kit mRNA(P<0.05)和蛋白表达(P<0.05)升高;72 h组中,SCF50 ng/ml组、SCF100 ng/ml组较高糖对照组c-kit mRNA(P<0.01)和蛋白表达均明显升高(P<0.01).结论 高浓度SCF可促进已发生形态、机能变化的离体膀胱Cajal样间质细胞c-kit表达上调.     

SCF对高糖环境下豚鼠膀胱Cajal样间质细胞超微结构的影响

目的 探讨干细胞因子(SCF)对高糖环境下豚鼠膀胱Cajal样间质细胞(ICCs-like)超微结构的影响.方法 胶原酶消化法原代分离培养豚鼠膀胱ICCs样细胞.实验分组:正常对照组(葡萄糖浓度为5 mmol/L)、高糖组(葡萄糖浓度为15 mmol/L),培养基培养72 h后高糖组分为高糖对照组、SCF 50 ng/ml组、SCF 100 ng/ml组,继续培养24 h及72 h.透射电镜观察各组不同时间段ICCs样细胞超微结构.结果 随着培养时间延长,正常对照组ICCs样细胞内超微结构无明显变化;高糖对照组ICCs样细胞内细胞器明显减少,线粒体肿胀、大小不等、空泡样变甚至溶解;内质网扩张,胞质广泛溶解,胞周突起变短乃至消失;而SCF组ICCs样细胞超微结构得到逐步改善,细胞器增多、形态趋于正常对照组,胞周突起增多.结论 外源性SCF干预后对高糖环境造成的ICCs样细胞超微结构破坏有一定的修复或逆转作用.     

糖尿病大鼠膀胱病理变化及胰岛素治疗的影响

目的观察糖尿病大鼠膀胱逼尿肌形态学表现和生理变化以探讨糖尿病大鼠膀胱收缩功能减退的病理基础以及胰岛素治疗对其的影响。方法6周和10周正常组鼠、糖尿病观察组鼠、糖尿病胰岛素治疗组鼠各7只,观察测量其膀胱残余尿量、压力-容量曲线并留取逼尿肌标本,进行光镜和电镜病理检查。结果与对照组比较,糖尿病观察组膀胱残余尿明显增多,压力峰值明显降低,而胰岛素治疗组曲线基本与对照组相同;光镜下可见逼尿肌肌束排列紊乱松散,胶原纤维减少;电镜下可见逼尿肌细胞间胶原纤维和中间连接减少,线粒体空泡变性。而胰岛素治疗组与对照组比较,光镜及电镜下表现均无差异。结论糖尿病大鼠早期即可出现逼尿肌形态学改变以致收缩功能下降,早期给予胰岛素治疗可以预防或减轻上述变化。     

AdMax系统构建腺病毒载体介导SCL基因转染Cajal样间质细胞及其表达

目的 构建含有人干细胞白血病(stem cell leukemia,SCL)基因的重组腺病毒载体,并观察其对豚鼠膀胱Cajal样间质细胞的转染及其介导SCL基因的表达.方法 采用PCR方法从含人SCL基因质粒中扩增SCL基因,连接到腺病毒穿梭质粒的多克隆位点上,构建重组穿梭质粒pDC315-EGFP/SCL,在脂质体介导下与腺病毒辅助大质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染293细胞,包装产生复制缺陷型重组腺病毒pDC315-SCL经HEK293细胞扩增,纯化后测定病毒滴度.通过观察绿色荧光蛋白的表达评估重组腺病毒对Cajal样间质细胞的转染率,RT-PCR法分析转染Cajal样间质细胞后SCL mRNA的表达.结果 PCR结果和Western blot法检测证实pDC315-SCL重组腺病毒载体构建成功,滴度达到1×1010 PFU/ml,对膀胱Cajal样间质细胞的转染率高达98%,RT-PCR法检测转染Cajal样间质细胞后SCL mRNA有表达.结论 成功构建pDC315-SCL重组腺病毒载体对Cajal样间质细胞有很强的转染能力,可介导SCL基因在Cajal样间质细胞的表达.     

豚鼠膀胱中二聚体Cajal间质细胞的分布特点及意义

目的　观察二聚体Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICC)在豚鼠膀胱不同组织及部位的分布特点,并探讨其意义。 方法　电子显微镜下观察豚鼠膀胱壁组织切片黏膜层,黏膜下层,肌层内二聚体ICC分布情况;对膀胱组织切片进行免疫荧光染色,用c-Kit抗体标记ICC,激光共聚焦显微镜下观察二聚体ICC在膀胱顶部、体部、颈部的分布特点。 结果　在电子显微镜下见二聚体ICC主要分布于黏膜下层,而肌层主要以单体ICC为主。免疫荧光染色发现每高倍镜视野下膀胱顶部二聚体ICC平均数量为（3.47±0.53）个,体部和颈部为（1.57±0.45）个和(0.49±0.19)个。膀胱顶部二聚体ICC数量明显高于体部和颈部（P<0.01）。 结论　二聚体ICC主要分布于豚鼠膀胱顶部的黏膜下层,可能是感受黏膜张力刺激,引发顶部膀胱自发兴奋的起搏细胞。     

豚鼠前列腺Cajal间质细胞的超微结构特点及功能

目的:观察豚鼠前列腺Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICCs)的超微结构特点以及ICCs和前列腺神经及平滑肌细胞之间的超微结构联系。方法:制作豚鼠前列腺组织切片并进行免疫荧光染色,使用酪氨酸激酶受体(c-Kit)抗体标记ICCs。制作豚鼠前列腺超薄组织切片,在透射电镜下寻找ICCs并观察其超微结构特点以及与周围神经、平滑肌细胞之间的超微结构联系。结果:免疫荧光标记发现豚鼠前列腺间质内有较多的c-Kit阳性ICCs。电镜下发现豚鼠前列腺组织内存在和c-Kit阳性ICCs形态、分布一致,符合典型胃肠道ICCs超微结构特点的间质细胞,这些前列腺ICCs分布于平滑肌细胞之间,与相邻的神经末梢形成典型的突触样连接,和周围的平滑肌细胞之间紧密相连。结论:豚鼠前列腺ICCs具有介导前列腺神经信号,调控平滑肌活动的超微形态学基础。     

2.108 糖尿病大鼠模型胃Cajal间质细胞、平滑肌细胞、神经和血管的超微结构研究

目的观察糖尿病大鼠模型胃Cajal间质细胞、平滑肌细胞、神经和血管的超微结构改变,为糖尿病性胃轻瘫的发生提供理论依据.方法健康成年雄性SD大鼠50只,体重250～300g,随机分为2组.糖尿病组 30只;正常对照组20只.糖尿病组实验大鼠先稳定3天,然后给予禁食12h(晚8时至早 8时),自由饮水,晨8时大鼠乙醚麻醉后,糖尿病组给予四氧嘧啶45mg/kg经舌下静脉1次注射,饲养4个月,定期测定血糖浓度≥200mg/mL,同时尿糖在以上确定为糖尿病模型.正常对照组对照组给予等量生理盐水注射.大鼠颈椎脱位后,剖腹迅速剪取胃,沿胃小弯侧剖开胃,在装有Kreb's液的烧杯内仔细去除胃肠内容物,Kreb's液的组成为120.3NaCl,5 .9KCl,2.5CaCl2,1.2MgCl2,20.2NaHCO3,1.2NaH2PO4,11.5glucose.取胃底、胃体、胃窦组织各1块,并将组织平铺于滤纸上,2.5%戊二醛固定后,0.1mol/L的磷酸缓冲液冲洗,1%的四氧化饿后固定,0.1mol/L的磷酸缓冲液冲洗,乙醇梯度脱水,Epo n 812浸透包埋,半超薄切片1～2μm,染色后光镜下定位,确认粘膜层、粘膜下层、环形肌层和纵行肌层的位置.用瑞典LKB超薄切片机行超薄切片50nm,超薄切片用酒精醋酸双氧铀、再用柠檬酸铅染色,用HITACHI H-600透射电镜观察照相.结果糖尿病大鼠模型胃Cajal间质细胞数量减少.Cajal间质细胞超微结构的变化为Cajal间质细胞与其它的Cajal间质细胞之间、与平滑肌细胞之间、与神经末梢之间的连接显著减少,尚存的细胞间连接的结构也有破坏、结构不清,连接松散,线粒体肿胀、空泡样变、甚至溶解,细胞内的胞质广泛溶解,有大量的胞质内空泡形成,Cajal间质细胞内的细胞器数量较正常减少,核糖体减少,粗面内质网脱颗粒,核内异染色质明显.糖尿病大鼠模型胃平滑肌细胞排列紊乱,肌细胞内有很多较大的胞质溶解性空泡,线粒体肿胀、空泡样变、溶解.糖尿病大鼠模型胃神经末梢部分肿胀、溶解,肌间丛神经元的细胞核溶解坏死,胞质部分溶解,线粒体肿胀,嵴溶解,粗面内质网扩张,质部分溶解.糖尿病大鼠模型胃毛细血管管壁显著不平,管壁增厚、淤曲,连续性中断,胞质内有小空泡.结论糖尿病大鼠模型胃Cajal间质细胞、平滑肌细胞、神经和血管的超微结构改变,可能是胃肠功能紊乱--胃轻瘫的发生的病理基础.     

构建糖尿病膀胱病豚鼠模型及其尿动力学评价

背景：糖尿病性膀胱病是糖尿病患者最常见的慢性并发症之一,建立糖尿病膀胱病动物模型为相关研究提供实验动物平台。 目的：建立糖尿病膀胱病豚鼠模型并进行尿动力学评价。 方法：50只英国种短毛雌性豚鼠,实验组(n=42)以单次腹腔注射链脲佐菌素法诱导糖尿病豚鼠,对照组(n=8)注射相应剂量空白枸橼酸缓冲液,分别在9周和12周时行尿动力学检查,确定膀胱功能失代偿豚鼠即糖尿病性膀胱病组和代偿豚鼠即代偿组豚鼠尿动力学特点。 结果与结论：42只豚鼠有20只成功诱导出糖尿病。糖尿病豚鼠中,9周时9只糖尿病组豚鼠,6只膀胱功能代偿,3只失代偿;12周时,另外9只糖尿病组豚鼠,1只膀胱功能代偿,8只失代偿(89%)。糖尿病性膀胱病组豚鼠残余尿量增加(0.72±0.08) mL、最大逼尿肌压下降(0.63±0.05) kPa、膀胱容量增加(2.01±0.05) mL及膀胱顺应性增加(3.47±0.41) mL/kPa,与对照组及代偿组比较,差异均存在显著性意义(P < 0.001)。豚鼠一般可在诱导糖尿病成功后12周发生糖尿病性膀胱病,表现出膀胱残余尿量增加等相应的尿动力学改变。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

加味八正散治疗湿热下注型糖尿病神经性膀胱的效果

目的 观察加味八正散治疗湿热下注型糖尿病神经性膀胱排尿功能的效果。方法 选择2012年6月~2018年12月我院收治的湿热下注型糖尿病神经性膀胱患者73例。按照随机数字表法分为实验组（39例）和对照组（34例）。对照组给予常规治疗,实验组在对照组基础上给予加味八正散治疗。比较两组临床治疗总有效率,治疗前后尿动力学指标水平。结果 实验组临床治疗总有效率为74.36%,高于对照组的50.00%（P＜0.05）。两组治疗后残余尿量、最大膀胱测压容积下降,平均尿流速和逼尿肌肌力增加,膀胱顺应性改善,且实验组各项指标改善均优于对照组（P＜0.05）。结论 加味八正散可改善湿热下注型糖尿病神经性膀胱的尿流动力学指标,减轻患者的排尿功能异常。     

中枢BDNF对咳嗽变异性哮喘豚鼠模型的调控作用

目的:研究脑源性神经营养因子(BDNF)在豚鼠咳嗽变异性哮喘(CVA)发生发展中的调控机制和对生长相关蛋白43(GAP-43)表达的影响。方法:选择Hartley雄性豚鼠为研究对象,制备并鉴定CVA豚鼠模型,确定CVA发作时脑内BDNF含量和(GAP-43)表达的变化。人为改变CVA豚鼠中枢BDNF含量,观察外周气道炎症和中枢GAP-43表达的相应改变。结果:制备的CVA豚鼠模型通过鉴定符合要求。(1)模型组豚鼠中枢BDNF和GAP-43表达量明显高于生理盐水对照组(P0.05)。(2)与中枢注射人工脑脊液的CVA豚鼠相比,注射外源性BDNF可以增加肺组织气道周围的物质P免疫阳性反应物并加剧外周气道炎症,同时中枢GAP-43免疫阳性反应物分布增多(154.3±25.7 vs 78.2±22.8,P0.01)。结论:中枢BDNF在豚鼠CVA发生发展中具有调控作用,这种作用可能通过调节GAP-43表达产生。     

Effects of long-term estradiol treatment on the contractile response to muscarine and muscarinic receptor subtypes in the bladder of aged female rats

In this study, we tried to elucidate the effect of estrogen treatment on the detrusor contractile response to muscarine and muscarine receptor subtypes of the bladder in 13-month-old female Wistar rats. The rats were divided into two groups, controls and rats treated with estradiol for 12 weeks. After the treatment phase, we monitored micturition behavior in addition to performing cystometrograms after the administration of muscarine, and real-time polymerase chain reaction for mRNA expression of the muscarinic receptor subtypes in the detrusor muscle. Our data indicated that there was a significant increase in the maximum micturition volume in the estradioltreated rats. The urodynamic results indicated significant changes in the maximum detrusor pressure following the administration of muscarine in the estradiol-treated rats, in contrast to the controls for which no significant changes were observed. Furthermore, M(3) receptor mRNAs in the detrusor muscle were significantly decreased in the estradiol-treated rats as compared to the control rats, while there were no differences noted for the M2 receptor mRNAs. Our data demonstrates that long-term estradiol treatment might be capable of increasing the potential detrusor contractility, and thus, estradiol might be a therapeutic agent that can be used to target the M3 receptors during the treatment of detrusor instability.     

膀胱二聚体Cajal间质细胞的超微结构及其对ATP的电反应

目的:为证明膀胱二聚体Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICC)发挥起搏作用提供超微结构和功能学证据。方法:电子显微镜下鉴定组织和培养的豚鼠膀胱二聚体ICC并观察ICC之间的超微联系;体外分离、培养豚鼠膀胱ICC,运用细胞膜片钳技术观察ATP(100μmol/L)刺激下二聚体ICC和单体ICC的兴奋性差别。结果:二聚体ICC中两个ICC细胞胞体紧密相连,细胞之间的间隙小于20 nm,存在大量缝隙连接,局部细胞膜融合,形成联胞体。在ATP(100μmol/L)的刺激下体外培养的二聚体ICC的内向电流幅度为286.9±26.4 pA,显著大于单体ICC的内向电流幅度163.8±18.6 pA(P<0.01)。结论:二聚体ICC具有形成高兴奋起搏电流的超微结构基础,高兴奋性的二聚体ICC可能才是逼尿肌的起搏细胞。     

Cytolysis of Junin infected target cells by immune guinea pig spleen cells

Spleen cells from guinea pigs infected with an attenuated strain of Junin virus (the causative agent of Argentine hemorrhagic fever) specifically lysed virus-infected syngeneic target cells in vitro. This activity was detected as early as 6 days after infection, reached a maximum on days 10-13, and persisted at lower levels, at least through day 30. Monoclonal antibody to guinea pig T cells had no effect on the activity. After B or T cell enrichment techniques, the cytolysis was found with the B cell fraction. Aggregated IgG blocked the cytolysis. These characteristics suggested lytic activity was mediated at least in part by an antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) mechanism. Although some cytolysis could be detected by using exogenously added antiserum and normal spleen effector cells, such reconstruction showed less efficient killing than when spleen cells from Junin-infected guinea pigs were used. This apparent discrepancy was resolved when spleen cells from these infected animals exhibited enhanced activity in non-viral ADCC systems as well. The cytotoxic activity by spleen cells against Junin-infected targets was detected only with non-fatal Junin infections. Cytolysis could not be measured in spleen cell suspensions from guinea pigs lethally infected with Junin virus; i.e. adults infected with a virulent strain of Junin and baby guinea pigs or immunosuppressed adult animals infected with an attenuated strain. However, spleen cells from both the immunosuppressed, infected adults and the adult guinea pigs infected with a virulent strain of Junin were able to mediate cytotoxicity in a nonviral system (antibody-sensitized Vero cells). The development of spleen cell cytotoxicity by Junin-infected guinea pigs against Junin-infected target cells correlated with whether the infection was resolved or was lethal.     

豚鼠胆囊胆固醇结石形成过程中肠道传输功能下降的细胞及分子机制探讨

目的探讨豚鼠胆囊胆固醇结石形成过程中肠道传输功能下降的细胞和分子机制及其与胆石形成的关系。方法健康雄性豚鼠40只,4周龄,体质量120～125g。将其随机分为实验组与对照组,每组20只。实验组给予致石饲料（胆固醇含量2%）,对照组给予正常颗粒饲料。8周造模结束后,用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测小肠组织中c-kit及scf的mRNA的表达情况,利用末端回肠全层铺片免疫荧光化学染色及激光共聚焦显微镜观察各组Cajal样间质细胞（ICCs）数量的变化。结果 RT-PCR结果显示,与对照组相比,实验组豚鼠小肠c-kit（0.316±0.056vs0.912±0.103;t=6.582,P〈0.01）和scf（0.499±0.012 vs 0.899±0.124;t=6.163,P〈0.01）的mRNA水平的表达量下降;对照组豚鼠回肠ICCs平均阳性面积为（56.24±2.68）%,实验组为（22.26±1.14）%,较对照组明显降低（t=15.256,P〈0.01）。结论饮食诱导的豚鼠胆囊胆固醇结石形成过程中,小肠c-kit和scf基因mRNA表达水平下降,ICCs数量明显减少。c-kit/scf通路抑制可能参与胆囊胆固醇结石的形成过程中肠道传输功能下降的发生。     

豚鼠哮喘模型核因子-κB的表达特点及灯盏花素对其作用的研究

目的:探讨核因子-κB(NF-κB)在豚鼠哮喘模型中的表达特点以及蛋白激酶C(PKC)抑制剂灯盏花素对其表达的影响。方法:将48只豚鼠随机分为正常对照组、哮喘即刻激发组、哮喘发作1周组、哮喘发作2周组、灯盏花素治疗1周组和治疗2周组等6组,每组8只,测定肺功能并观察气道壁嗜酸性粒细胞(EOS)浸润情况;用免疫组织化学染色方法观察NF-κB在豚鼠肺组织中的表达变化。结果:NF-κB主要表达于气道上皮细胞,哮喘各组NF-κB的表达水平均显著高于正常对照组(P＜0101),治疗2周组NF-κB的表达水平显著低于哮喘各组(P＜0.01)。NF-κB的表达水平与气道阻力及气道壁EOS计数均呈显著正相关(P＜0101)。结论:哮喘豚鼠气道上皮细胞NF-κB的表达水平显著高于正常豚鼠,提示NF-κB可能参与哮喘的发病过程;PKC抑制剂灯盏花素能显著降低哮喘豚鼠气道上皮细胞NF-κB的表达水平,提示PKC可能通过NF-κB的作用参与哮喘的发病机制。     

Demonstration of epidermis-specific heteroantigens in thymic epithelial cells.

Heterologous anti-epidermal cell serum was obtained by immunizing rabbits with enzymatically dispersed, viable epidermal cells of guinea pigs, followed by absorption of the antiserum with red blood cells (sheep and guinea pig), lymphoid cells and liver powder (guinea pig). Immunofluorescence demonstrated that the antiserum reacted specifically with stratified squamous epithelial cells and thymus epithelial cells including Hassall's bodies of the guinea pig, monkey and man. It is suggested that the epithelial cells of the skin and thymus have common heteroantigens.