体外转录法制备地高辛标记HCV核心区RNA探针及其初步应用

目的制备地高辛标记的HCV核心区RNA探针,用于筛选与丙型肝炎病毒(HCV)RNA核心区结合的细胞蛋白质分子。方法采用RT-PCR方法,从HCV感染者血清中扩增HCV C区cDNA序列,将所得序列克隆入载体PinpointT-MT Vector和pGEM-7EF( )Vector,进行PCR、酶切和测序鉴定。以HCV-pGEM-7EF( )中的HCV核心区cDNA序列作为体外转录RNA的模板,经T7 RNA聚合酶转录得到地高辛标记的HCV核心区RNA探针。将地高辛标记的探针用于紫外交联实验,筛选HepG2细胞中可与HCV RNA结合的蛋白质分子。结果所得HCV核心区cDNA序列为503 bp。地高辛标记的HCV核心区探针初步筛选到两个与HCV RNA结合的蛋白。结论地高辛标记的HCV核心区RNA探针具有较高的特异性和敏感性,可用于筛选与HCV RNA结合的细胞蛋白质分子。     

稳定转染CDK2干扰RNA的人肝癌HepG2细胞系的建立

目的建立稳定转染CDK2干扰RNA的人肝癌HepG2细胞系。方法用Lipofectamine^TM 2000法将已构建好的特异性的携带绿色荧光蛋白的CDK2干扰RNA的重组质粒P^Genesil-1-CDK2转染入HepG2细胞，经G418筛选后获得稳定转染细胞株，并用倒置荧光显微镜观察转染细胞的绿色荧光蛋白，利用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测转染后的HepG2细胞CDK2 mRNA的表达。结果倒置荧光显微镜观察与KT-PCR检测，结果显示获得重组质粒P^Genesil-1-CDK2稳定转染的细胞克隆。结论建立了可稳定转染CDK2干扰RNA的人肝癌HepG2细胞系，为进一步研究细胞周期调控蛋白激酶对肝细胞癌的治疗与开发新的特异性药物提供了实验依据。     

FAT10过表达对肝癌细胞HepG2侵袭及迁移能力的影响

目的 探讨FAT10过表达对肝癌细胞HepG2侵袭及迁移的影响.方法 采用脂质体转染法建立FAT10基因过表达的HepG2细胞株;采用蛋白质印迹法检测转染重组表达载体pcDNA3-FAT10后,HepG2细胞中FAT10蛋白的表达水平.体外侵袭实验及划痕实验检测FAT10基因过表达对HepG2细胞迁移及侵袭能力的改变,并采用芯片检测FAT10下游与细胞侵袭转移相关基因的差异表达.结果 蛋白质印迹法检测结果显示,转染重组表达载体pcDNA3.1-FAT10的HepG2细胞中FAT10蛋白均过表达;FAT10过表达能明显提高HepG2细胞的侵袭及迁移能力.结论 FAT10基因在HepG2细胞中过表达能提高肝癌的侵袭及迁移能力,并促进肝癌的发生及发展.     

PCR技术在丙肝诊断中的应用进展

目前用于HCV感染的特异实验诊断方法主要有两类,即检测抗—HCV和HCV RNA。在感染过程中,抗体出现较晚,且抗—HCV阳性只表明有过HCV感染,而不能说明血清是否有传染性。然而,基因诊断技术能够检测HCV基因组,阳性结果即表明HCV的存在,说明该受检者具有传染性,这在献血员筛选及HCV早期诊断和预防中具有十分重要的意义。HCV感染者血清HCV数量极低,常规分子杂交技术难以检出HCV—RNA,而且检测过程繁琐,难以推     

丙型肝炎病毒F蛋白上调肝癌细胞HepG2中Bcl-2和Bax表达

目的研究丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)基因1b型F蛋白对HepG2细胞中Bcl-2、Bax表达的影响。方法应用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术扩增HCV 1b型的F基因,构建pEGFP-C3-F、pEGFP-C3-C真核表达载体,分别将pEGFP-C3-F、pEGFP-C3-C、pEGFP-C3(阴性对照)瞬时转染HepG2细胞,48h后抽细胞总蛋白质,蛋白质印迹法(Western blot)检测Bcl-2、Bax表达的变化。结果转染F基因的HepG2中Bcl-2表达水平略高于未转染的细胞,但Bax表达水平显著高于未转染的细胞。结论 HCV F蛋白具有调节原癌基因Bcl-2和抑癌基因Bax的特性,可能与肝癌的形成有关。     

丙型肝炎病毒F蛋白上调肝癌细胞HepG2中Bcl-2和Bax表达

目的 研究丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)基因1b型F蛋白对HepG2细胞中Bcl-2、Bax表达的影响.方法 应用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术扩增HCV 1b型的F基因,构建pEGFP-C3-F、pEGFP-C3-C真核表达载体,分别将pEGFP-C3-F、pEGFP-C3-C、pEGFP-C3(阴性对照)瞬时转染HepG2细胞,48h后抽细胞总蛋白质,蛋白质印迹法(Western blot)检测Bcl-2、Bax表达的变化.结果 转染F基因的HepG2中Bcl-2表达水平略高于未转染的细胞,但Bax表达水平显著高于未转染的细胞.结论 HCV F蛋白具有调节原癌基因Bcl-2和抑癌基因Bax的特性,可能与肝癌的形成有关.     

赛莱西布对肝癌HepG2细胞增殖与凋亡影响

目的探讨选择性环氧合酶-2（cox-2）抑制剂赛莱西布（celecoxib）对人肝癌细胞株HepG2细胞增殖、凋亡的影响及其可能的作用机制。方法用不同浓度的赛来西布处理HepG2细胞，分别应用四甲基偶氮噻唑蓝试验、DNA梯度电泳法、放射免疫法检测赛亚西布对HepG2细胞增殖和凋亡及其COX-2活性的影响；应用免疫印迹法和比色法检测赛莱西布对HepG2细胞胱氨酸蛋白酶3（clasepase-3）蛋白质的表达及活性的影响。结果12．5，25，50μmol／L的赛莱西布作用于HepG2细胞后，HepG2细胞增殖受抑制，与对照组比较，差异有统计学意义（P〈0．01）；赛莱西布干预组HepG2细胞DNA明显降解，可见细胞凋亡特征性梯状DNA条带；干预组HepG2细胞caspase3蛋白表达及活性均明显升高。与对照组比较，差异均有统计学意义（P〈0．01）；赛莱西布明显抑制HepG2细胞cox-2活性。与对照组比较，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论赛莱西布可通过cox-2通路和easpase3通路抑制HepG2细胞增殖并诱导其凋亡。     

染料木黄酮对油酸诱导脂肪变HepG2细胞PPARα表达和糖脂水平的影响北大核心CSCD

目的研究染料木黄酮（genistein,Gen）对油酸（oleic acid,OA）诱导脂肪变HepG2细胞的过氧化物酶体增殖物激活受体α（peroxisome proliferators—activatedreceptor α,PPARα）蛋白表达和糖、脂代谢水平的影响。方法将HepG2细胞在合有0～50gmol／L的Gen,0．5mmol／L的OA的培养基内,且设置对照组,培养24h后收集细胞,分别采用蛋白质印迹法（Western blotting）、酶法、选择性沉淀法测定PPARα、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL—C）的含量;收集培养基上清液,采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法测定葡萄糖消耗量。结果浓度为10～50μmol／L的Gen可以减轻HepG2细胞脂肪变的程度,总体上呈现剂量效应关系。Gen各组与模型组比较,高浓度的Gen（50,mol？L）可有效提高OA诱导脂肪变HepG2细胞内PPARα和HDL—C含量,降低TC和葡萄糖消耗量,但低浓度的Gen（10-30μmol／L）对细胞内TC和HDL—C作用不明显。结论高浓度Gen能改善OA诱导的脂肪变HepG2细胞内的糖脂代谢情况,并可能与PPARα表达有关。     

化学合成多肽体外抗HBV复制的研究

目的 观察人工设计并化学合成的多肽在体外乙型肝炎病毒（HBV）复制模型中对HBV-DNA复制、病毒标志物表达的影响，及其细胞毒性强弱，筛选高HBV抑制且低细胞毒性的多肽，探索多肽作为新型HBV抗病毒药物分子的潜力。方法 采用传统的甲基丙烯酸聚合物平台设计并合成的7种多肽（KBDT-1、2、3……7，以疏水性及阳离子电亲和力大小为依据），将7种化学合成多肽（10 mg/mL）、拉米夫定（1 mg/mL，阳性对照）、空白溶剂（阴性对照）作用于HepG 2.2.15细胞系，检测化学合成多肽对HBV的抑制作用，采用结晶紫染色法检测细胞存活率，比较各组药物对细胞毒性的强弱。选取HBV抑制作用最强的多肽，设置10、1、0.1 mg/mL浓度梯度，分别处理HepG 2.2.15细胞3、6、9 d后，收集细胞上清液，采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测病毒DNA拷贝量，化学发光微粒子免疫分析法检测HBsAg及HBeAg的变化。结果 从7种化学合成多肽中筛选出多肽KBDT-2，RT-PCR结果显示，KBDT-2具有体外抗HBV复制作用，且药物浓度越高，抑制效果越好；化学发光微粒子免疫分析法检测显示，KBDT-2对HBV生物学标志物HBsAg及HBeAg有抑制作用；结晶紫染色检测结果显示，KBDT-2对HepG 2.2.15无明显毒性作用。结论 KBDT-2具有抑制HBV复制作用，且无明显细胞毒性，可以有效降低HBsAg、HBeAg表达，为探索抗HBV新型药物提供了实验数据支持。     

DC-SIGNR基因多态性与肝功能和HCV病毒载量的相关性

目的研究丙型肝炎患者DC—SIGNR基因颈区重复序列的遗传多态性分布，探讨DC-SIGNR基因多态性与肝功能及丙型肝炎病毒（HCV）载量的关系。方法采用聚合酶链反应（PCR）技术结合DNA测序对238例丙型肝炎患者DC—SIGNR重复序列多态性进行基因分型和测序分析；同时检测患者的HCV—RNA载量和肝功能。结果DC—SIGNR基因型或等位基因与肝功能的相关性不显著。携带7等位基因的患者，其HCV—RNA载量水平低于携带9等位基因的患者（P〈0．05）。此外7/7组基因型的患者其HCV—RNA载量水平低于9/7组基因型的患者，两组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。提示HCV更易与携带较长DC—SIGNR等位基因的患者结合。结论DC—SIGNR遗传多态性可能与HCV在个体内的复制有关。但与肝功能不相关。     

出入境人员丙型肝炎传染性及危险因子研究

目的:为了解出入境人员丙型肝炎(HCV)感染水平,研究HCV感染者的传染性及影响感染的危险因子,提出控制出入境人员丙型肝炎病情发展和降低传染风险的具体措施,保护出入境人员身体健康。方法:用酶联免疫吸附(ELISA)法筛查出入境人员丙型肝炎病毒抗体(抗-HCV),用实时荧光定量PCR法测定150例抗-HCV阳性血清中RNA病毒载量,以性别、年龄((±3)、抗-HCV阴性、HCVRNA阴性、1:4比例为匹配条件,选择600例为阴性对照组,采用SPSS Statistics17.0统计软件中Logistic二元回归模型对抗-HCV阳性组和阴性对照组检测结果进行统计分析。结果:23781名出入境人员传染病监测体检中发现抗-HCV阳性150例,检出率为0.63%,远低于我国普通人群感染水平(3.2%);男女间感染HCV的机率均等(X2=0.506,P>0.05);抗-HCV阳性率随年龄增长而升高,各年龄组间差异显著(X2=86.065,P<0.001);外国籍人群抗-HCV阳性率显著低于中国及港澳台地区人群(X2=12.376,P<0.05);抗-HCV阳性者中78.67%HCVRNA病毒处于复制状态,其中抗-HCV滴度≤1:16人群HCVRNA病毒载量均≤500copy/ml,抗-HCV滴度≥1:64人群HCVRNA病毒载量均≥1.02X104copy/ml,各抗体滴度间HCVRNA病毒载量有显著性差异(X2=136.593,P<0.001);从30个检查检测指标中筛选出性别、年龄、国籍、心率、ALT、GGT、CREA、LDL、HBsAg、HBeAb等10个HCV危险因子,其回归方程为:Y=1.056X4+0.285X5-0.44X6-0.021X11+0.102X13-0.005X15+0.02X21-0.758X27+4.87X28-1.294X31-2.934,经回归模型检验证明二元回归方程拟合程度非常好(回归模型系数的综合检验卡方值为259.795,P<0.001,模型-2对数似然值为490.808c,Cox﹠SnellR方值为0.293,NagelkerkeR方值为0.463)。结论:出入境人员HCV感染者中78.67%具有传染性,抗-HCV滴度≥1:64指标可作为HCV传染性的判断指标;HCV感染的危险因子有性别、年龄、国籍、心率、ALT、GGT、CREA、LDL、HBsAg、HBeAb。     

Sexual and non-sexual intrafamilial spread of hepatitis C virus: Intrafamilial transmission of HCV

The rate of intrafamilial transmission of the hepatitis C virus (HCV) was investigated in 90 family members of 41 index patients with type C chronic liver disease. Antibody to HCV (anti-HCV) was detected by the EIA method (Abbott-Axsym Sys) and Hepatitis C virus RNA, by the polymerase chain reaction (Nested PCR). We also investigated the presence of anti-HCV in 350 healthy persons (control group). The subjects in the study included 38 spouses, 45 children and others (1 relative and 6 parents). Four family members including 3/38 (7.8%) spouses and 1 sister were found to be positive for anti HCV antibodies but none had HCV RNA. Anti-HCV was not detected in the children of index patients. The prevalence of anti-HCV in the families of index patients was significantly higher than in the controls (4.3% versus 0.85%) (p = 0.0355). We concluded that the intrafamilial transmission of HCV is possible but occurs at a low rate.     

Hepatitis C virus RNA in the skin eruption from patients with prurigo and chronic hepatitis C

Hepatitis C virus RNA in the skin eruption from patients with prurigo and chronic hepatitis C. Since the discovery of hepatitis C virus (HCV) in 1989, many cutaneous disorders have been observed in patients suffering from chronic HCV infection. The relationship between HCV infection and cryoglobulinemia and porphyria cutanea tarda is clearly established, however, the link between HCV and other skin diseases is still controversial. AIM: Two patients with intense pruritus and secondary prurigo in chronic C hepatitis have been presented. METHODS: The chronic hepatitis C of the patients were proved by elevated ALT and AST level, anti HCV (ELISA), HCV-PCR serological examination and liver biopsy. The skin lesions were accompanied by severe itching. According to clinical symptoms the patients suffered from prurigo simplex. RESULTS: HCV RNA in the skin specimen from the biopsy of the skin lesion was detected by RT PCR method, but the non affected skin specimen from the patients was HCV RNA negative. CONCLUSIONS: This report is a case of prurigo simplex with chronic C hepatitis proving a direct relation between the HCV infection and prurigo.     

HCV基因型和HCVRNA检测在丙型肝炎病毒母婴传播中的意义

从流行病学角度来探讨丙肝病毒母婴垂直传播的可能性 ,并探讨此传播途径在丙肝流行中的作用。利用 RT- nested PCR方法检测感染率和基因分型 ,采用双脱氧链终止法测定 HCV- PCR产物序列。抗 - HCV阳性 45例母血中 HCV- RNA阳性 38例 (84.44% )。抗 - HCV阳性 30例脐血中 HCV- RNA阳性 1 4例 (46.67% ) ,这 1 4例抗 - HCV阳性的母婴 HCV- RNA均阳性 ,1 4对母婴的基因分型完全一致。以上结果可以表明母婴垂直传播是 HCV感染的一个途径     

Potential cellular receptors involved in hepatitis C virus entry into cells

Hepatitis C virus (HCV) infects hepatocytes and leads to permanent, severe liver damage. Since the genomic sequence of HCV was determined, progress has been made towards understanding the functions of the HCV-encoded proteins and identifying the cellular receptor(s) responsible for adsorption and penetration of the virus particle into the target cells. Several cellular receptors for HCV have been proposed, all of which are associated with lipid and lipoprotein metabolism. This article reviews the cellular receptors for HCV and suggests a general model for HCV entry into cells, in which lipoproteins play a crucial role.     

丙型肝炎病毒体外感染人外周血单个核细胞的初步研究

目的 探讨丙型肝炎病毒(HCV)在体外能否感染人外周血单个核细胞，并观察其复制情况。方法 HCVRNA阳性血清与原代培养的外周血单个核细胞共同孵育6～8h，收集不同时相点标本，以逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)、免疫组化、原位杂交分别检测细胞内或上清中正负链RNA，细胞内HCV NS3、NS5、CP10 3种抗原的表达情况，以及原位检测HCV负链RNA。结果 接种感染血清后5d，可在细胞内或培养上清中间断检出HCV正负链RNA；HCV NS3、NS5、CP10可在感染细胞内表达，阳性物质位于胞浆中；原位杂交法证实细胞胞浆内存在负链RNA。结论 HCV在体外能感染原代培养的人外周血单核细胞，并在其中复制。     

Detection of hepatitis C virus antibody and RNA in hemostatic gauze used for dentistry.

We investigated whether the presence of hepatitis C virus (HCV) infection can be detected in hemostatic gauze used during oral treatments. We were able to detect both antibody to HCV and HCV RNA in samples from patients serologically proven to have HCV and also in gauze used for these patients that was left at room temperature even for as long as 24 hours. Thus, this method is useful for the screening of HCV infection in situations in which blood sampling is not feasible.     

HCV单克隆抗体的制备及其应用的初步研究

目的:丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)感染已成为全球公认的健康难题,目前并没有很好的疫苗和特效药,尽早检出HCV感染者是实现丙型肝炎早期诊断、阻断传播的重要途径。方法:研究通过免疫Core-NS4B融合重组蛋白,制备抗HCV单克隆抗体,并获得5H5和4E7-HRP最优的抗体配对组合,检测120例血清,同时与HCV-RNA检测做比较。结果:阴性血清均未测出阳性,HCV阳性标测出23例阳性,检出率77%,HCV-RNA测出26例,检出率87%;HCV可疑标本测出15例阳性,HCV-RNA测出17例;单项ALT增高的标本测出2例阳性,HCV-RNA测出1例。结论:研究所获得的抗体能够用于HCV抗原检测,具有巨大的潜力,为建立HCV抗原检测试剂盒奠定了基础,为临床检测提供了实验依据。