天花粉蛋白在不同小鼠品系中区分性下调树突状细胞IL-12分泌和CD80表达

目的：阐明天花粉蛋白(Tk)诱导免疫抑制和基因调控的机制。方法：同时在高易感品系(HS)和低易感品系(LS)小鼠中，应用淋巴细胞体外增殖试验测定Tk对DC细胞递呈抗原和激活T细胞的影响、ELISA方法测定TK对DC细胞分泌IL-12p40的影响、流式细胞术测定TK对DC细胞表面MHCⅡ类分子及共刺激分子(CD80、CD86、CD40)和CD11c表达的影响。结果：(1)Tk抑制高易感品系C57BL／6(H-2^k)DC细胞的抗原递呈和激活T细胞的能力，对低易感品系C3H／He(H-2^k)影响甚小；(2)Tk抑制C57BL/6 DC细胞成熟过程中IL-12p40的分泌，对C3H／He的抑制减弱；(3)Tk选择性下调C57BL/6 DC细胞CD80的表达，对C3H／He无明显影响；(4)DE细胞表面CD40、CD86及CD11C分子的表达在两种小鼠品系中均不受Tk的影响。结论：Tk选择性地在HS小鼠品系中下调DC细胞IL-12和CD80的表达，通过调变APC活性诱导T细胞免疫抑制受控于MHC基因。     

NZB和NZW小鼠脾淋巴细胞CD48和CD244分子表达及其基因多态性研究

目的：了解NZB小鼠中是否存在与其CD8^＋T细胞增殖相关的CD48和CD244分子表达异常及其机制。方法：利用流式细胞分析技术检测NZB和NZW小鼠脾淋巴细胞表面CD48和CD244分子的表达。利用DNA序列测定进行CD48和CD244基因多态性分析。结果：NZB小鼠活化的CD8^＋T细胞表面CD48和CD244分子表达水平均高于NZW小鼠。DNA序列分析显示CD48和CD244 eDNA序列在NZB和NZW小鼠问不存在多态性，但是NZB小鼠的CD48基因转录起始点上游-119bp处存在5个碱基缺失。结论：NZB小鼠活化的脾淋巴细胞高水平表达CD48和CD244分子可能是其CD8^＋T细胞增生的原因之一。NZB CD48基因转录调控区域异常可能与其高水平表达CD48分子有关。     

TLR4 基因敲除对小鼠内脏脂肪组织免疫细胞及脂肪因子的影响

目的:探讨TLR4 基因敲除对小鼠免疫细胞及脂肪因子的影响。方法:取20 周龄的雄性野生型C57BL/6 小鼠和TLR4-/ -小鼠的脾脏和附睾脂肪组织,分离细胞,用流式检测F4/80、CD11b、CD11c、CD3、CD4、CD8 分子的表达;qPCR 检测附睾脂肪组织内IL-6、HMGB1、TNF-α、脂联素和抵抗素的表达。结果:与野生型C57BL/6 小鼠相比,TLR4-/ - 小鼠脾脏和附睾脂肪组织中M1 型(F4/80+ CD11b+ CD11c+ )巨噬细胞比例上升(P<0.05),M2 型(F4/80+ CD11b+ CD11c- )巨噬细胞比例下降(P<0.05),这种趋势在附睾脂肪组织中表现更为显著。同时发现附睾脂肪组织中CD4+ T 细胞比例下降(P<0.05),CD8+ T细胞比例上升(P<0.05);IL-6、HMGB1、抵抗素表达升高(P<0.05);TNF-α和脂联素表达降低(P<0.05)。结论:TLR4 基因敲除可导致内脏脂肪组织脂肪因子和免疫细胞的紊乱。     

NOD小鼠人源化后CD4~+T和CD8~+T细胞及其分泌IFN-γ与IL-17的频率变化及意义

目的 观察分析NOD小鼠和NOD.β2mnullHHD小鼠Ⅰ型糖尿病(Type1 diabetes,T1D)发病情况以及脾T细胞亚群的频率及功能差异,揭示CD4+T和CD8+T细胞亚群在HLA-A*0201转基因NOD小鼠和NOD小鼠的T1D发病中作用的异同。方法采用测量血糖的方法观察2种小鼠的发病情况,采用流式细胞术分析小鼠脾淋巴细胞CD3+CD4+T、CD3+CD8+T细胞亚群频率以及这2群细胞分泌IL-17和IFN-γ频率的差异。结果 NOD.β2mnullHHD小鼠较NOD小鼠发病早且严重;NOD.β2mnullHHD小鼠脾淋巴细胞的CD3+CD4+T细胞亚群显著高于NOD小鼠,NOD.β2mnullHHD小鼠脾淋巴细胞的CD3+CD8+T细胞亚群显著低于NOD小鼠;2种小鼠的脾淋巴细胞中CD3+CD4+IL-17+T细胞亚群与CD3+CD8+IL17+T细胞频率无差异;NOD.β2mnullHHD小鼠脾淋巴细胞的CD3+CD4+IFN-γ+T和CD3+CD8+IFN-γ+T细胞亚群频率显著高于NOD小鼠。结论 HLA-2.1分子转入NOD小鼠后HLA-2.1分子加速了HLA-A*0201转基因NOD小鼠T1D的发病进程;NOD.β2mnullHHD小鼠相对NOD小鼠的T1D发病更早、病情更重,这与CD3+CD4+T和CD3+CD8+T细胞分泌的IFN-γ显著相关,而与IL-17无关,为T1D防治的临床转化基础研究提供实验数据。     

CD11b在小鼠脾脏和淋巴结细胞中的差异表达及其功能

目的研究CD11b在小鼠脾脏和淋巴结细胞的差异表达及其生物学特性。方法流式细胞术分析CD11b在C57BL/6小鼠脾脏和淋巴结细胞、不同T细胞亚群的表达及其与T细胞活化的关系。结果 CD11b在脾脏细胞的表达(19.9±2.5)%略高于淋巴结的细胞(16.0±4.2)%(P=0.026)。脾脏中CD11b主要表达于CD3-细胞(14.93±0.94)%,淋巴结中CD11b主要表达于CD3+细胞(12.52±1.32)%;在脾脏和淋巴结T细胞亚群中,CD11b均主要表达于CD4+T细胞。进一步分析发现,CD4+CD11b+细胞高表达CD44和CD62L,且Freund完全佐剂(CFA)激活后的CD4+T细胞高表达CD11b。结论 CD11b主要表达于脾脏的非T细胞和淋巴结的T细胞。T细胞中CD11b主要表达于CD4+T亚群,且CD11b表达与T细胞活化有关。     

转染小鼠可诱导共刺激分子配体基因细胞株的构建及其对T细胞体外活化与增殖的促进作用

目的 构建转染小鼠可诱导共刺激分子配体(ICOSL)基因的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞株(CHO/ICOSL),探讨其对T细胞体外增殖与活化的促进作用.方法 从小鼠脾脏细胞中抽提总RNA,采用RT-PCR的方法获得小鼠ICOSL基因,经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切后装入EGFP-pIRES2真核表达载体中并测序鉴定,用脂质体转染技术将重组载体EGFP-pIRES2/ICOSL转染CHO细胞,经G418加压筛选,流式细胞术和RT-PCR分析其在CHO细胞中的表达.以转染空载体CHO细胞(CHO/Mock)作为对照,将CHO/ICOSL细胞与T细胞体外共培养,通过检测活化T细胞上CD25、CD69的表达及T细胞增殖实验对小鼠ICOSL转基因细胞的生物学功能进行初步研究.结果 CHO/ICOSL基因转染细胞能稳定地高表达小鼠ICOSL分子.与CHO/Mock相比,CHO/ICOSL基因转染细胞能够显著促进T细胞的体外活化与增殖(P＜O.05).结论 成功构建稳定表达小鼠ICOSL的基因转染细胞株,该细胞株能显著促进T细胞的体外活化与增殖,为进一步深入研究该分子生物学功能奠定了基础.     

黄芪对小鼠淋巴细胞及其表面分子的调节作用

目的探讨黄芪灌胃给药C57BL/6小鼠后脾脏中淋巴细胞及其相关表面分子的变化。方法将黄芪通过灌胃给药小鼠,6 d后将对照组和黄芪组小鼠的脾细胞进行分离,制备单细胞悬液,然后通过流式细胞术检测小鼠B细胞、T细胞、CD8+T细胞和NK细胞及其相关表面分子CXCR3、CD69和CD62L的百分比含量。结果黄芪组小鼠脾脏中B细胞和NK细胞的百分比显著升高(P0.05),而T细胞和CD8+T细胞的百分比显著降低(P0.05和P0.01)。黄芪组CXCR3分子在NK细胞中的表达明显高于对照组(P0.05);黄芪组CD69分子在CD8+T细胞和NK细胞中的表达均明显高于对照组(P0.05);黄芪组CD62L分子在B细胞、T细胞、CD8+T细胞和NK细胞中的表达均显著低于对照组(均P0.01)。结论 C57BL/6小鼠在给药黄芪后,其脾脏中上述淋巴细胞及其相关表面分子可发生不同程度的变化,提示黄芪对小鼠的免疫功能可以产生多种调节作用。     

大剂量过敏原对致敏小鼠DC表面共刺激分子表达及调节性T细胞极化的作用

目的观察和比较致敏小鼠及正常小鼠DC表面共刺激分子表达及CD4+CD25+Foxp3+T数量的差异及大剂量过敏原在体外的作用。方法流式细胞仪检测致敏及正常对照小鼠脾脏DC表面分子CD11c、MHCⅡ、CD80、CD86表达。分离致敏及正常对照小鼠CD4+T细胞,流式细胞仪检测CD4+CD25+Foxp3+T细胞的数量。致敏小鼠脾脏DC、CD4+T细胞与10 mg/ml OVA或生理盐水共培养后,流式细胞仪检测并比较CD80、CD86等共刺激分子的表达及CD4+CD25+Foxp3+T细胞的数量。结果致敏小鼠脾脏DC表面共刺激分子CD80、CD86、MHCⅡ表达显著高于正常对照小鼠。10 mg/ml的OVA作用后,致敏小鼠脾脏DC表面共刺激分子CD80、CD86的表达明显降低。致敏小鼠脾脏细胞中CD4+CD25+Foxp3+T细胞数量显著低于正常对照小鼠。10 mg/ml的OVA作用后,致敏小鼠CD4+CD25+Foxp3+T细胞数量显著上升。结论大剂量过敏原在体外诱导致敏小鼠T细胞的不反应性,其机制与降低致敏小鼠DC共刺激分子表达,诱导调节性T细胞极化等有关。     

微小RNA-126基因敲减对CD4~+T细胞体外功能的影响

目的研究微小RNA-126(microRNA-126,miR-126)基因敲减(knock down,KD)后对CD4~+T细胞体外功能的影响并探讨其意义。方法 MACS分选miR-126 KD小鼠脾脏CD4~+CD62L~+T细胞,ConA刺激48h后,Real-time PCR技术检测细胞内miR-126成熟体表达水平;FACS分别检测CD4~+T细胞表面活化分子CD69、CD62L、CD44和增殖相关分子Ki-67,以及细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17表达变化;Annexin V/PI双染色法检测CD4~+T细胞的凋亡情况。结果与野生型(wide-type,WT)小鼠相比,miR-126KD小鼠的CD4~+T细胞中miR-126成熟体表达显著下调(P0.001);miR-126 KD小鼠CD4~+T细胞活化后CD62L的表达比例显著减少(P0.01),而CD69、CD44的比例显著增加(P0.05);同时Ki-67~+的比例也明显增加(P0.05);此外,miR-126 KD小鼠CD4~+T细胞的INF-γ表达比例显著上调(P0.001),IL-4的比例显著下调(P0.01),而IL-17的比例没有明显变化(P0.05);最后,CD4~+T细胞的凋亡比例显著减少(P0.05)。结论 miR-126基因敲减后CD4~+T细胞的活化、增殖和相关细胞因子分泌均明显增强,为后续深入探讨miR-126在免疫应答中的作用及机制提供前期实验基础。     

TNF-α缺失减少抗李斯特菌CD8~+T细胞应答并增加效应记忆细胞形成

目的探讨TNF-α在李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)感染模型中对CD8~+T细胞应答的影响。方法采用尾静脉注射重组OVA的李斯特菌株感染TNF-α基因敲除(TNF-αKO)小鼠和野生型(WT)对照小鼠建立系统性感染模型。运用流式细胞术检测不同时相点TNF-αKO小鼠和WT小鼠中内源性和外源性特异性CD8+T细胞应答反应情况。采用体内细胞杀伤实验和检测细菌滴度的方法评估TNF-αKO小鼠和WT小鼠感染后记忆期CD8~+T细胞的效应功能。接着分析记忆期和增殖期CD8~+T细胞的KLRG-1和CD127等分子的表达变化。结果与WT对照小鼠相比,TNF-αKO小鼠中CD8~+T细胞应答减少,记忆细胞增多;TNF-αKO小鼠中记忆CD8~+T细胞的效应功能正常;TNF-αKO小鼠记忆CD8~+T细胞中含有更多比例的KLRG-1+CD127-CD62L-效应记忆细胞,而第7天TNF-αKO小鼠特异性CD8~+T细胞的KLRG-1和CD127的表达与对照组无明显差别。结论TNF-αKO小鼠初次应答降低,形成更多记忆细胞,且效应记忆细胞增多。其机制与早期效应CD8~+T细胞分化无关,可能是TNF-αKO小鼠更多的KLRG-1+CD127-细胞在应答收缩期存活所致。     

Graves病患者外周血T细胞亚群和共刺激分子的表达及其意义

为研究Graves病患者外周血T细胞亚群及共刺激分子的表达 ,并探讨其在Graves免疫病理机制中的作用 ,本文采用免疫荧光标记和流式细胞仪术检测了 19例Graves病患者和 11例正常人外周血T细胞亚群及共刺激分子 (CD2 8、B7、CD40、CD40L、 4 1BB、OX40 )的表达。结果表明 ,19例初诊Graves病患者外周血T细胞亚群呈现异常改变 ,表现为CD3+ 和CD4+T细胞显著下降 (P <0 0 5 ,P <0 0 1) ,CD4+ /CD8+ T细胞比值倒置 (P <0 0 1) ,共刺激分子CD2 8在T细胞中的表达水平明显下降 (P <0 0 1) ,T细胞亚群CD4+ CD2 8+ 、CD8+ CD2 8+ 细胞数量均减少 (P <0 0 5 ,P <0 0 1) ,而 4 1BB分子表达显著地升高 (P <0 0 5 )。随防 10例治疗后缓解患者 ,T细胞亚群失衡明显改善 ,共刺激分子CD2 8的表达水平上调 (P <0 0 1) ,而4 1BB分子的表达明显下降 (P <0 0 1) ,T细胞亚群CD4+ CD2 8+ 、CD8+ CD2 8+ 细胞数量均增加 (P <0 0 1) ,甲状腺自身抗体甲状腺球蛋白抗体 (TGAb )和甲状腺微粒体抗体 (TMAb )的表达水平均下降 (P <0 0 1,P <0 0 1)。从而表明 ,T细胞亚群的异常及共刺激分子CD2 8、 4 1BB的表达改变与Graves病的免疫病理机制相关。     

茴香霉素对小鼠T细胞反应性及其杀伤作用的影响

目的 茴香霉素对小鼠T细胞活化、反应性、杀伤作用及其同种异基因皮肤移植的影响.方法 利用荧光标记的单克隆抗体双染技术结合流式细胞仪检测茴香霉素对小鼠CD3 T细胞早期及中期活化标志分子CD69和CD25表达的影响; 用MTT法检测茴香霉素刺激下T细胞在单向或双向混合淋巴细胞反应中T细胞的反应性及其对大鼠肝癌(7919)细胞的杀伤效应;建立小鼠同种异基因皮肤移植动物模型,观察茴香霉素对移植皮肤存活时间的影响.结果 在最佳剂量10.0 ng/mL时,茴香霉素能够明显抑制T细胞表面分子CD69和CD25的表达,且能抑制单向或双向混合淋巴细胞反应中T细胞的反应性(P＜0.01);10.0 ng/mL茴香霉素亦能明显抑制T细胞对大鼠肝癌细胞的杀伤效应(P＜0.01);5.0和15.0 mg/kg茴香霉素能够明显延长小鼠移植皮肤的存活时间 (P＜0.01).结论 茴香霉素对T 细胞的活化、反应性、杀伤效应及同种异基因皮肤移植排斥反应均有明显抑制作用,可能为治疗免疫反应性疾病提供新的策略 .     

可调控表达IL-2基因骨髓基质细胞促进异基因骨髓移植小鼠免疫功能重建

目的　探讨可调控表达IL 2基因的骨髓基质细胞系对异基因骨髓移植小鼠免疫功能重建的促进作用。方法　构建四环素诱导的表达小鼠IL 2基因的逆转录病毒载体 ,转染包装细胞PT6 7,感染骨髓基质细胞系QXMSC1(H 2 d) ,构建可诱导表达IL 2基因的工程化骨髓基质细胞系QXM SC1tet on IL 2。受体小鼠C5 7BL 6 (H 2 b)经γ射线致死剂量照射后 ,输入供体BALB c(H 2 d)骨髓细胞1× 10 7 只 (去除T细胞 ) ,同时输注骨髓基质细胞QXMSC1tet on IL 2 5× 10 5 只。灌服多西环素 (Dox)诱导IL 2表达。于骨髓移植 (BMT)后 30d、6 0d检测小鼠脾细胞对ConA的反应强度 ,空斑形成细胞(PFC)数和迟发型超敏反应 (DTH) ,脾细胞中T辅助细胞前体频数 (HTLp)及移植后小鼠脾脏T细胞亚群CD4 + CD8+ 的比值 ,评价BMT后免疫功能的恢复情况。结果　成功建立四环素诱导IL 2基因表达的基因工程化骨髓基质细胞系QXMSC1tet on IL 2。异基因BMT、联合输注QXMSC1tet on IL 2能显著提高BMT小鼠脾细胞对ConA的反应 ,增加脾脏淋巴细胞HTLp及PFC数目 ,并使DTH反应增强 ,改善小鼠脾脏T细胞亚群CD4 + CD8+ 的比值。结论　共输注可调控表达IL 2基因的骨髓基质细胞可促进异基因移植小鼠免疫功能重建。     

microRNA-7对小鼠肠系膜淋巴结αβT淋巴细胞组成的影响

目的:研究miR-7(MicroRNA-7,miRNA-7)对小鼠肠系膜淋巴结αβT淋巴细胞比例的影响并初步探讨其意义。方法:利用miR-7基因敲减(Knockdown,KD)小鼠模型,观察其肠系膜淋巴结大小、重量和淋巴结细胞总数,以及HE染色的病理学变化;流式细胞术(FACS)检测淋巴结中αβT淋巴细胞亚群(CD3+T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞)以及CD4+T细胞和CD8+T细胞的活化相关分子CD69、CD62L和功能相关因子IFN-γ表达的情况。结果:与野生型(Wild type,WT)小鼠相比,miR-7KD小鼠肠系膜淋巴结大小、重量指数和淋巴结细胞总数均显著增高(P0.05),且HE染色显示MLNs有病理性改变;肠系膜淋巴结中αβCD3+T细胞比例增加显著,其中以CD4+T细胞比例变化最为明显(P0.05),而CD19+B淋巴细胞比例明显下调(P0.05),但各亚群细胞总数均明显增加(P0.05);最后,CD4+T细胞和CD8+T细胞中的CD62L+细胞的比例均显著下调(P0.05),而CD69+细胞和IFN-γ+细胞比例均显著上调(P0.05)。结论:miR-7敲减后可显著影响肠系膜淋巴结中αβT淋巴细胞的组成比例,提示其对肠系膜淋巴结中淋巴细胞的组成和功能具有重要的调控作用。     

人CD8基因转染的造血干细胞重建的小鼠表达有功能的人CD8分子

人CD8分子是T细胞表面特异的受体,与T细胞活化、分化及MHCI类抗原限制性有关.文章用逆转录病毒载体将人CD8分子基因导入小鼠造血干细胞,并用这些干细胞重建致死性照射小鼠.在骨髓移植后第21天,97%的小鼠表达了人CD8分子且持续8个月以上,T,B细胞及骨髓细胞都有     

亚急性衰老小鼠脾脏T细胞CD137表达的研究

目的：探讨CD137分子在衰老小鼠脾脏T细胞表面表达的规律。方法：通过注射D－半乳糖建立亚急性衰老小鼠模型。分离衰老模型组小鼠及正常对照组小鼠的脾脏T细胞，经Con A刺激后进行培养，采用流式细胞术检查Con A刺激后不同培养时间的T细胞上CD137的表达，并进行比较。结果：小鼠脾脏T细胞经过Con A刺激后，正常对照组小鼠T细胞上CD137分子的表达高峰出现于刺激后第6天，平均表达率为48．5％，之后迅速下降。1个月和2个月衰老模型组小鼠T细胞上CD137分子在表达高峰的表达率平均分别为39．1％和32．8％，均显著低于正常对照组小鼠（P＜0．01），其中1个月模型组小鼠T细胞上CD137分子表达高峰的出现时间及下降规律与正常对照组小鼠相同；而2个月衰老模型组小鼠T细胞上CD137分子的表达高峰出现于刺激后第4天，第9天缓慢下降至与正常对照组相同时间的水平。结论：亚急性衰老小鼠T细胞上CD137分子的表达低于正常水平。至衰老过程的后期，T细胞上CD137分子的表达高峰提前出现，表达水平达到峰值后下降速度较正常小鼠缓慢，提示CD137分子在机体抗衰老过程中，具有调节T细胞功能的作用。     

小鼠可溶性CD83对树突状细胞表达共刺激分子和共刺激活性的影响

目的：研究可溶性小鼠CD83（mCD83）对树突状细胞（DC）表达共刺激分子及共刺激活性的影响。方法：克隆mCD83基因，构建mCD83胞外功能区与人IgG1αFc段融合基因的真核表达载体pmCD83-hIg，并在COS-7细胞中表达可溶性mCD83-hIg融合蛋白。采用ELISA、Western blot和RT-PCR技术检测mCD83-hIg融合基因在COS-7细胞中的表达。用mCD83-hIg处理小鼠DC细胞系（DC2．4）采用流式细胞术检测DC细胞周期、细胞凋亡和共刺激分子CD80、CD86的表达影响；采用混合白细胞培养试验，检测mCD83-hIg对DC2．4刺激同种异基因T细胞增殖及产生IL-2和IFN-γ的影响。结果：酶切和序列测定鉴定显示构建的真核表达载体完全正确；mCD83-hIg对DC2．4细胞周期和细胞凋亡无影响，但可下调DC2．4表面共刺激分子CD80和CD86的表达；mCD83-hIg处理过的DC2．4刺激同种异基因T细胞增殖及产生IL-2和IFN-γ的能力显著下降。结论：mCD83-hIg可抑制DC表达共刺激分子并下调DC共刺激活性，从而抑制同种异基因T细胞增殖和产生细胞因子。     

LPS持续刺激对小鼠骨髓树突状细胞成熟的影响

目的　研究LPS持续刺激对小鼠骨髓树突状细胞 (DC)成熟的影响。方法　小鼠骨髓细胞用GM CSF培养 7d ,持续刺激组全程加入LPS ,短期刺激组在最后 48h加入LPS ,对照组不加LPS。流式细胞仪检测细胞表型和细胞摄取抗原的能力 ,ELISA检测细胞产生的细胞因子 ,混合淋巴细胞培养检测细胞提呈抗原的能力。结果　用LPS持续刺激的小鼠骨髓DC表达MHCⅡ、CD86、CD80和CD11c等分子和分泌TNF α和IL 12 (p70 )的能力并未增加 ,吞噬FITC OVA的能力显著升高 ,刺激同种异基因T细胞和刺激同种同基因T细胞增殖的能力亦显著低于LPS短期刺激组。结论　LPS持续刺激可抑制DC的发育成熟 ,可能是持续严重感染时免疫功能低下的原因     

肺炎链球菌自溶酶(LytA)蛋白T细胞表位的预测、筛选及确定

目的确定肺炎链球菌自溶酶(LytA)蛋白CD4 T细胞及CD8 T细胞的表位。方法通过生物信息学方法预测肺炎链球菌LytA蛋白分子小鼠的MHC-Ⅰ结合肽(CD8 T细胞表位)和MHC-Ⅱ结合肽(CD4 T细胞表位)序列并人工合成相应肽段;经诱导表达、纯化、透析、去内毒素、定量等步骤得到纯化的rLytA蛋白用以免疫小鼠;分离每只免疫组小鼠和对照组小鼠的脾及淋巴结细胞并分别与每条人工合成的候选表位肽段体外共培养,取培养上清进行双夹心ELISA检测每组细胞IFN-γ的产生情况;用初步筛选到的表位多肽刺激小鼠的脾及淋巴结细胞并进行细胞内染色及细胞流式技术检测,筛选出LytA蛋白分子T细胞表位。结果利用多种方法分析了LytA蛋白分子的MHC-Ⅰ结合肽及MHC-Ⅱ结合肽,经整理得到候选MHC-Ⅰ结合肽26条,候选MHC-Ⅱ结合肽7条,并进行了人工合成。利用分子生物学技术获得了rLytA蛋白并成功免疫了小鼠;双夹心ELISA结果初步提示:肽段LⅠ4、LⅠ5、LⅠ6、LⅠ7、LⅠ11、LⅠ12、LⅠ13、LⅠ14、LⅠ25以及肽段LⅡ3、LⅡ4、LⅡ5刺激免疫小鼠细胞产生的IFN-γ量比相应的对照小鼠显著升高;细胞流式技术进一步确定:经肽段LⅠ4、LⅠ6、LⅠ7、LⅠ11、LⅠ12、LⅠ13、LⅠ14及LⅠ25刺激后,免疫小鼠细胞中IFN-γ和CD8双阳性的细胞百分比较对照小鼠细胞的百分比显著升高;经肽段LⅡ4和LⅡ5刺激后,免疫小鼠细胞中IFN-γ和CD4双阳性的细胞百分比较对照小鼠细胞的百分比显著升高。结论确定了肺炎链球菌LytA蛋白分子2个CD4 T细胞及8个CD8 T细胞的表位。     

转录因子IRF8抑制Th17细胞分化并减轻T细胞免疫介导的小鼠结肠炎

 目的：转录因子干扰素调节因子（interferon regulatory factor, IRF）家族与Th17的发育密切相关,近年来发现Th17细胞在炎症性肠病的发病中发挥重要作用,本研究探讨IRF8对Th17发育及T细胞转染免疫介导的小鼠实验性肠炎的影响。方法：(1)采用流式细胞术分选野生型（WT）或IRF8全基因敲除(IRF8 -/-)小鼠脾脏和淋巴结的naive CD4 +T细胞(CD4 + CD62L +CD44 low),在Th1、Th2或Th17极化的条件下培养,采用流式细胞术检测Th1、Th2和Th17的比例。(2)建立实验性肠炎模型：采用免疫磁珠法分选WT或IRF8 -/-小鼠中的脾脏和淋巴结中CD4 +CD25 +Treg,WT小鼠的CD4 + CD45RB hi T细胞单独或者分别联合WT或IRF8 -/-小鼠的CD4 +CD25 +Treg腹腔注射给RAG1 -/-小鼠;WT或IRF8 -/-小鼠的naive CD4 + CD45RB hi T细胞腹腔注射给RAG1 -/-小鼠;观察上述小鼠每周体重的变化,第5周时处死小鼠,进行结肠炎病理评分和肠系膜淋巴结T淋巴细胞亚群检测。结果：(1)IRF8 -/-较WT的naive CD4 +T细胞在极化条件下向Th17细胞分化更明显(P<001),而对Th1和Th2细胞的分化无影响(P>0.05)。(2)CD4 + CD45RB hi T细胞转染给RAG1 -/-小鼠,IRF8 -/-较WT供体鼠引起的RAG1 -/-小鼠体重显著降低(P<0.05),结肠炎评分显著增高（P<0.05）,且肠系膜淋巴结中IL-17 +CD4 +细胞比例明显增高(P<0.01),而 IFN-γ +CD4 + 和 Foxp3 +CD4 +细胞比例无影响(P>0.05);IRF8 -/-小鼠的CD4 +CD25 +Treg对WT小鼠CD4 + CD45RB hi T细胞转染给RAG1 -/-小鼠诱发的免疫介导的结肠炎显示出正常的免疫抑制作用。结论：转录因子IRF8基因敲除促进CD4 +T细胞向Th17细胞分化,促进转染naive CD4 +T细胞诱导的实验性结肠炎的发生,IRF8基因敲除小鼠Treg细胞免疫抑制功能正常。