LDL诱导RAW264.7细胞前后与神经节苷脂结合的蛋白质向脂质筏的转位

【立论依据】 氧化修饰的低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, Ox-LDL)在促进动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的发生和发展中起着关键性的作用。广泛存在于食品中的反式脂肪酸,能促进LDL的氧化修饰最终导致AS,有实验提示,反式脂肪酸是通过细胞膜上的脂质筏引起后续导致AS的各种反应,因此抗氧化治疗的维生素E等药物不能有效地阻止AS的发生。目前阻止体内LDL被氧化成为治疗AS的焦点,于是探究氧化LDL的分子机制变得至关重要。神经节苷脂(ganglioside,GM1)作为脂质筏的标志分子,已有研究显示其与LDL的氧化及分布密切相关,而其与LDL氧化的识别机制以及氧化环境的建立尚有待研究。 【设计思路】 本项目通过分析LDL诱导RAW264.7细胞前后,与神经节苷脂GM1特异结合的蛋白质向脂质筏的转位,从而找出介导LDL在微环境中进行氧化修饰的相关蛋白质因子。 【实验内容】 (1)细胞诱导和脂质筏分离:实验组,巨噬细胞RAW264.7与LDL共培养15 min;对照组,无LDL刺激;密度梯度离心分离脂质筏,非标记定量蛋白质组学鉴定产生的氧化应激相关蛋白。(2)细胞蛋白—GM1共沉淀:①收集巨噬细胞RAW264.7蛋白;②脂质体制备:实验组,制备原料加有GM1;对照组:原料不含GM1;③蛋白质-GM1结合:将收集的蛋白和制备的脂质体孵育结合,收集产物;④通过SDS-PAGE,质谱分析等找出与GM1特异结合的蛋白质分子。(3)蛋白质印迹法验证分析:分析步骤1和步骤2得到的共有蛋白,分别与LDL刺激细胞后分离的脂质筏成分以及与GM1特异结合的蛋白质进行蛋白质印迹法验证。 【材料】 RAW264.7细胞(武汉大学基础医学院);LDL( Pro Spec-Tany公司 );GM1(Sigma公司)。 【可行性】 预实验初步证实了LDL的氧化与脂质筏的形成有关;而且细胞膜“脂质筏”结构的主要组成成分糖鞘脂之一GM1参与了LDL的氧化,激光共聚焦显示GM1与LDL在RAW264.7细胞上的分布密切相关。 【创新性】 该项目首次证实了LDL与氧化微环境-脂质筏的形成有关,并寻找介导氧化的相关分子,从而进一步确认LDL氧化的具体机制。     

FABP4和FABP5在肿瘤免疫调控中的研究进展

肥胖是肿瘤发展的危险因素，与多种肿瘤的不良预后有关，脂代谢紊乱成为探索肥胖症和肿瘤疾病内在联系的关键。脂肪酸结合蛋白(FABPs)是一系列水溶性小蛋白质，主要负责长链脂肪酸的转运和代谢，同时也可以作为转录因子在细胞核内发挥作用。脂肪组织来源的脂肪酸结合蛋白主要包括FABP4和FABP5，它们被鉴定为多种恶性肿瘤的致癌基因。本文总结了FABP4和FABP5在肿瘤疾病发生发展中的作用，重点介绍了FABP4和FABP5对肿瘤免疫微环境的调控机制，阐述了以FABP4和FABP5为治疗靶点的最新研究进展。     

5-LO真核表达载体的构建及其在RAW264.7细胞中的表达的初步研究

目的构建5-LO真核表达载体并初步研究其在RAW264．7细胞中的表达,为建立5-LO高表达转基因小鼠模型提供表达载体。方法从人全血标本中提取细胞总RNA,以逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法扩增5-LO基因,分别构建5-LO目的基因的克隆载体与表达载体,提取质粒,进行酶切、PCR和DNA测序鉴定,将重组融合表达载体pEGFP-5-LO稳定转染RAW264．7细胞,RT-PCR、western blot方法检测pEGFP-5-LO的表达情况。结果构建了重组克隆载体pUCm-5-LO和真核表达载体pEGFP-5-LO,经酶切、PCR及测序鉴定正确;转染细胞后,在荧光显微镜下观察到pEGFP-5-LO融合蛋白的表达,RT—PCR和Westemblot结果表明转染pEGFP．5-LO的RAW264．7细胞中有5-LO的表达。结论成功克隆了5-LO基因,构建的表达载体pEGFP-5-LO在RAW264．7细胞中表达5-LO蛋白,为进一步5-LO高表达转基因鼠模型的建立和临床应用奠定了基础。     

IL-8对OX-LDL诱导的RAW264.7株作用的研究

目的探讨白细胞介素8(IL-8)对OX-LDL诱导的小鼠单核巨噬细胞264.7细胞株(RAW264.7)的作用。方法以IL-8作用于OX-LDL诱导RAW264.7细胞株,48 h后收集细胞和上清培养液,分别用流式细胞仪检测细胞表位CD14、CD34、CD86及其早、晚期凋亡率;用RT-PCR法检测细胞内IL-8 mRNA的表达水平;用Western bot检测IL-8 mRNA表达蛋白的量;用ELISA方法检测上清液IL-1β、IL-10的量。结果与对照组相比,实验组的CD14、CD34表位表达及晚期凋亡明显增多(P<0.05),而对CD86、早期凋亡影响不明显(P>0.05),IL-8 mRNA及其表达的蛋白量明显升高,上清培养液中IL-1β增多(P<0.05),IL-10减少(P<0.05)。结论 IL-8致动脉粥样硬化(AS)作用可能是部分通过上调单核巨噬细胞表面CD14、CD34表位表达,促进IL-8 mRNA及其表达蛋白的量,促进IL-1β、抑制IL-10的分泌,并促进其晚期凋亡,参与AS的炎症反应。     

脂联素对内皮祖细胞氧化损伤的保护作用及机制研究

目的　观察脂联素对氧化低密度脂蛋白(oxidative low density lipoprotein,Ox-LDL)诱导的人外周血内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)氧化损伤的保护作用,并探讨其可能的机制。方法 密度梯度离心法获取外周血单个核细胞,通过流式细胞仪鉴定内皮祖细胞。培养7 d后,收集贴壁细胞并随机分为正常对照组、Ox-LDL组(10 µg·mL^-1)及脂联素干预组(Ox-LDL 10 µg·mL^-1加脂联素,浓度分别为1.25,2.5,5 µg·mL^-1),干预 24 h后采用细胞活力噻唑蓝(MTT)法测定细胞活力。并取各组细胞上清液行超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量检测。结果 脂联素可以改善Ox-LDL诱导氧化损伤的EPCs的活力,增加SOD活性,降低MDA含量。结论 脂联素对氧化损伤的EPCs具有保护作用,其机制可能与提高抗氧化酶活性有关。     

脂氧素对巨噬细胞RAW264.7的抗炎实验研究

目的 研究脂氧素(LX) A4和叔丁氧羟基-苯丙氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸(BOC-2)对LPS作用巨噬细胞RAW264.7存活的影响.方法 取对数生长期的巨噬细胞RAW264.7为研究载体,实验用不同浓度的脂多糖(LPS)在不同时间点处理细胞,观察LX A4和BOC-2对LPS作用巨噬细胞RAW264.7后的存活率.CCK-8法观察LPS对各组巨噬细胞RAW264.7的不良反应,Western blot法检测LX A4和BOC-2对LPS处理后巨噬细胞RAW264.7的Toll样受体4(TLR4)和pNF-κB p65蛋白水平,酶联免疫吸附(ELISA)法检测LX A4和BOC-2对LPS处理后巨噬细胞RAW264.7培养上清液中白细胞介素6(IL-6)水平.结果 在1 000 ng/mL浓度LPS组,作用时间6h,巨噬细胞RAW264.7内TLR4蛋白水平和pNF-κB p65蛋白水平显著高于其余各组(P＜0.05).在LPS作用下,LX A4组细胞存活率显著高于对照组(P＜0.05);BOC-2组在LPS作用后巨噬细胞RAW264.7的存活率显著低于无LPS作用(P＜0.05).在LPS作用下,LX A4组pNF-κB p65蛋白水平低于对照组及BOC-2组(P＜0.05),BOC-2组pNF-κB p65蛋白水平高于其余各组(P＜0.05).在LPS作用下,LX A4组IL-6的水平低于对照组及BOC-2组(P＜0.05).结论 LX A4能够抑制LPS对巨噬细胞RAW264.7的作用及TLR4/NF-κB信号通路的激活,有助减轻炎性反应.     

巨噬细胞ABCA1对Ox—LDL诱导的炎症因子的调节及其意义

【目的】研究在氧化低密度脂蛋白（Ox—LDL）诱导作用下，ATP结合盒转运子A1（ABCA1）对巨噬细胞中细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、单核细胞化学趋向蛋白-1（MCP-1）mRNA和蛋白质及白介素-1β（IL-1β）蛋白质表达的影响，在细胞水平证实ABCA1对动脉粥样硬化的影响。【方法】用氟波酯（PMA）刺激THP-1细胞使之转变为巨噬细胞，Ox—LDL（30μg／mL）刺激3、6、12、24h后，以荧光定量RT—PCR和Western蛋白印迹法及酶联免疫吸附法（ELISA）检测ABCA1、ICAM-1、MCP-1及IL-1β mRNA和蛋白质表达量；用反义寡核苷酸（100nmol／L）抑制ABCAl的表达，观察Ox-LDL刺激下上述指标的改变。【结果】给予0x—LDL刺激后，巨噬细胞ABCA1、ICAM-1、MCP-1的mRNA和蛋白及IL-1β蛋白质表达均增高；给予反义寡核苷酸转染后Ox-LDL刺激3、6h，上述指标的mRNA表达降低（P〈0．01），12、24h蛋白质表达降低（P〈0．01）。【结论】在巨噬细胞，ABCA1可增加Ox—LDL诱导的炎症因子表达，参与动脉粥样硬化的发生。     

整合素β1基因对RAW264.7细胞摄脂功能的影响

目的初步探讨整合素β1基因在RAW264.7细胞摄脂过程中的作用。方法针对整合素β1基因的不同靶点设计并化学合成3条具有阳性转染率的siRNA,用脂质体法转染RAW264.7细胞,并根据转染的方式将实验分为空白对照组、转染siRNA阴性对照组、脂质体对照组和转染筛选出的阳性转染率最高的siRNA组。用Cy3标记siRNA荧光显微镜下检测转染效率,Real-time PCR筛选沉默效率最高的siRNA,细胞黏附性实验检测细胞黏附性的改变,脂质油红O化学染色法检测细胞的脂质摄取量的变化,上述检测均重复测定3次。结果成功将siRNA转染入RAW264.7细胞,并成功筛选出沉默效率最高(65%)的siRNA为siRNA1,转染后实验组整合素β1mRNA表达明显低于其他组,细胞的黏附性从其他组的70%以上降低到53%,泡沫细胞转化率由其他组的90%以上显著降低到17%,摄脂能力显著降低,与其他组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论整合素β1基因明显影响RAW264.7细胞的摄脂功能,进而影响RAW264.7细胞向泡沫细胞的转化。     

FABP2及其基因多态性与2型糖尿病相关性研究

2型糖尿病(T2DM)是以胰岛素抵抗和糖脂代谢紊乱为特征的一种内分泌及代谢疾病,其危害在于其对血管的损害进而导致器官和组织的器质性病变。小肠脂肪酸结合蛋白(FABP2)是由小肠单层柱状上皮细胞分泌的一种蛋白质,具有将长链脂肪酸从细胞膜转运至内质网的功能。多项研究提示,FABP2基因多态性与胰岛素抵抗、血脂代谢紊乱相关,参与T2DM的发生、发展。     

中青年急性脑梗死患者Lp-PLA2和LDL—C与颈动脉粥样硬化斑块的相关性

探讨中青年急性脑梗死患者颈动脉硬化斑块与血清脂蛋白相关磷脂酶A2（Lp-PLA2）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）含量的关系。方法抽取广东医学院附属医院2012年1月～2013年3月收治的142例中青年急性脑梗死患者作为研究对象,并对其血清Lp-PLA2、LDL-C水平等进行测定,同时选择40例同期来本院进行健康体检者进行对照。给予急性脑梗死患者彩色多普勒超声检查,并按照两侧颈动脉粥样硬化的具体状况,分为颈动脉IMT正常组34例,颈动脉IMT增厚组30例,颈动脉斑块组78例,其中稳定斑块42例,易损斑块36例,测定并比较各组血清Lp-PLA 2、LDL-C水平。结果中青年急性脑梗死组Lp-PLA2为（328.72±76.62）μg/L、LDL-C为（3.58±0.85）mmol/L;正常对照组Lp-PLA2为（61.31±14.81）μg/L、LDL-C为（2.21±0.72）mmol/L（P〈0.01）;在急性脑梗死患者的血清Lp-PLA 2、LDL-C水平比较中,颈动脉粥样硬化组Lp-PLA2为（289.08±69.16）μg/L、LDL-C为（3.42±1.06）mmol/L明显要高于颈动脉IMT正常组Lp-PLA 2：（218.16±48.62）μg/L、LDL-C：（2.63±0.86）mmol/L（P〈0.05）,颈动脉IMT斑块形成组Lp-PLA 2：（386.72±84.25）μg/L、LDL-C：（3.86±1.14）mmol/L则显著高于颈动脉IMT增厚组（P〈0.05）,颈动脉粥样硬化不稳定斑块组血清Lp-PLA 2、LDL-C水平Lp-PLA 2（406.38±96.11）μg/L、LDL-C：（4.12±1.24）mmol/L较稳定斑块组Lp-PLA 2（317.06±80.23）μg/L、LDL-C：（3.51±1.08）mmol/L明显升高（P〈0.05）;线性相关分析表明Lp-PLA2水平和LDL-C水平无明显相关（r=0.23814,P〉0.05）;logistic回归分析结果显示：Lp-PLA 2、LDL-C是发生颈动脉粥样硬化的危险因素（OR=1.017,95%CI：1.018～1.025;OR=1.039,95%CI：1.013～1.068）。结论中青年急性脑梗死颈动脉硬化斑块与Lp-PLA2、LDL-C水平有一定的相关性,临床可通过检测两者的含量来对其炎症程度和斑块易损度进行有效判断?     

小檗碱对小鼠RAW264．7巨噬细胞极化的影响

目的观察小檗碱对脂多糖（LPS）、白细胞介素－4（IL－4）诱导的小鼠RAW264．7细胞极化的影响。方法体外培养小鼠巨噬细胞RAW264．7,模型组和给药组分别加入LPS （终浓度100 ng／mL）或IL－4（终浓度10 ng／mL）,给药组用终浓度20μmol／L的小檗碱分别进行干预,同时空白对照组给予等体积磷酸盐缓冲液（PBS）。采用荧光定量聚合酶链反应检测精氨酸酶－1（ Arg－1）、一氧化氮合酶（ iNOS）、细胞因子信号传导抑制蛋白2（ SOCS2）、细胞因子信号传导抑制蛋白3（SOCS3）的mRNA表达水平,采用酶联免疫吸附（ELISA）法检测肿瘤坏死因子－α（TNF－α）及IL－10的分泌量。结果小檗碱对LPS刺激的巨噬细胞TNF－α分泌量的增加以及iNOS、 SOCS3 mRNA表达水平的上升均有显著的下调作用（P＜0．05或P＜0．01）;对IL－4刺激的巨噬细胞IL－10分泌量的增加和Arg－1 mRNA表达水平的上升均有显著下调作用（P＜0．05）,而对SOCS2 mRNA的表达无显著影响（P＞0．05）。结论小檗碱能抑制巨噬细胞向M1型极化,亦能抑制巨噬细胞向M2型极化,提示其可能在维持M1／M2动态平衡中发挥调节作用。     

多壁碳纳米管抑制RAW264.7巨噬细胞的吞噬功能

目的 观察多壁碳纳米管（MWCNT）对巨噬细胞吞噬功能的影响.方法 采用常规细胞培养技术培养RAW264.7巨噬细胞;用流式细胞术定量检测RAW264.7巨噬细胞吞噬异硫氰酸荧光素标记的大肠杆菌（FITC-tagged E.coli k-12）的情况.结果 MWCNT剂量依赖性地抑制RAW264.7细胞吞噬大肠杆菌,随着MWCNT浓度的增加,RAW264.7细胞吞噬大肠杆菌的量（用平均荧光强度表示）降低.此外,MWCNT抑制RAW264.7细胞吞噬大肠杆菌亦呈时间依赖性：用MWCNT（75 μg/ml）孵育RAW264.7细胞12h后,RAW264.7细胞吞噬大肠杆菌的量与对照组相比降低了约70.4％ （P ＜0.01）,同时参与吞噬活动的RAW264.7细胞的百分比也从对照组的98.6％降低到了92.4％ （P＜0.05）.即使用低剂量的MWCNT（25 μg/ml）孵育RAW264.7细胞较长时间（24h）后,RAW264.7细胞吞噬大肠杆菌的量与对照组相比仍降低了约77.1％ （P ＜0.01）,同时参与吞噬活动的RAW264.7细胞的百分比也从71.2％降低到了43.4％ （P ＜0.01）.用脂多糖（LPS,10μg/ml）激活RAW264.7细胞后,其吞噬能力明显增强,而MWCNT仍可剂量依赖性地抑制LPS激活的RAW264.7细胞的吞噬能力,与LPS组相比,MWCNT（75 μg/ml）和LPS共孵育组吞噬大肠杆菌的量降低了70.9％ （P ＜0.01）.结论 MWCNT可明显抑制RAW264.7巨噬细胞的吞噬功能.     

Ketamine Promotes Inflammation through Increasing TLR4 Expression in RAW264.7 Cells

Summery: Ketamine(KTM), a N-methyl-D-aspartate(NMDA) receptor antagonist, was found to has an anti-inflammatory effect, but some patients suffered from exacerbated pro-inflammatory reactions after anesthesia with KTM. The present study was aimed to examine the underlying mechanism of pro-inflammatory effects of KTM. In this study, RAW264.7 cells were exposed to KTM and NMDA alone or combined for 30 min before lipopolysaccharide(LPS) stimulation. The expression levels of IL-6 and TNF-α were detected by RT-PCR and ELISA, and those of NMDA receptors by RT-PCR in RAW264.7 cells. Additionally, the TLR4 expression was determined by RT-PCR and flow cytometry, respectively. The results showed that in RAW264.7 cells, KTM alone promoted the TLR4 expression, but did not increase the expression of IL-6 or TNF-α. In the presence of LPS, KTM caused a significantly higher expression of IL-6 and TNF-α than LPS alone. NMDA could neither alter the IL-6 and TNF-α m RNA expression, nor reverse the enhanced expression of IL-6 and TNF-α m RNA by KTM in LPS-challenged cells. After TLR4-si RNA transfection, RAW264.7 cells pretreated with KTM no longer promoted the IL-6 and TNF-α expression in the presence of LPS. In conclusion, KTM accelerated LPS-induced inflammation in RAW264.7 cells by promoting TLR4 expression, independent of NMDA receptor.     

冠心平含药血清对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞极化的影响

目的?探讨冠心平（GXP）含药血清对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞极化的调控作用。方法?RAW264.7巨噬细胞分为对照组、模型组、GXP低、中、高剂量组,100?ng/mL LPS刺激12?h诱导M1型极化模型,不同浓度GXP含药血清进行干预。ELISA法检测巨噬细胞上清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、转化生长因子-β1（TGF-β1）含量;流式细胞术检测M1、M2型巨噬细胞特征性表面标记分子CD86、CD206表达水平;qPCR法检测巨噬细胞CD86、CD206 mRNA表达情况。结果?冠心平高剂量显著减少巨噬细胞TNF-α分泌（P<0.01）,各剂量减少TGF-β1分泌（P<0.01）;冠心平低、高剂量显著降低M1型巨噬细胞特征性分子CD86表达（P<0.05）,显著升高M2型巨噬细胞特征性分子CD206表达（P<0.01）;同时冠心平CD206 mRNA表达显著增加（P<0.05）。结论?冠心平含药血清能够抑制LPS诱导的巨噬细胞M1型极化而促进M2型极化,这或许是冠心平治疗动脉粥样硬化的潜在机制之一。      

Atorvastatin Attenuates TNF-alpha Production via Heme Oxygenase-1 Pathway in LPS-stimulated RAW264.7 Macrophages

Objective To assess the effect of atorvastatin on lipopolysaccharide(LPS)-induced TNF-α production in RAW264.7 macrophages. Methods RAW264.7 macrophages were treated in different LPS concentrations or at different time points with or without atorvastatin. TNF-α level in supernatant was measured. Expressions of TNF-α mRNA and protein and heme oxygenase-1(HO-1) were detected by ELISA, PCR, and Western blot, respectively. HO activity was assayed. Results LPS significantly increased the TNF-α expression and secretion in a dose- and time-dependent manner. The HO-1 activity and HO-1 expression level were significantly higher after atorvastatin treatment than before atorvastatin treatment and attenuated by SB203580 and PD98059 but not by SP600125, suggesting that the ERK and p38 mitogen-activated protein kinase(MAPK) pathways participate in regulating the above-mentioned effects of atorvastatin. Moreover, the HO-1 activity suppressed by SnPP or the HO-1 expression inhibited by siRNA significantly attenuated the effect of atorvastatin on TNF-α expression and production in LPS-stimulated macrophages. Conclusion Atorvastatin can attenuate LPS-induced TNF-α expression and production by activating HO-1 via the ERK and p38 MAPK pathways, suggesting that atorvastatin can be used in treatment of inflammatory diseases such as sepsis, especially in those with atherosclerotic diseases.     

芍药苷对LPS诱导的RAW264.7细胞HMGB1表达的影响

目的:观察芍药苷对脂多糖(LPS)诱导的小鼠单核/巨噬细胞株(RAW264.7)高迁移率族蛋白B1(HMGB1)释放和表达的影响.方法:体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞培养三代后,转种于放置了无菌处理盖玻片的6孔培养板中,将细胞分为对照组、LPS刺激组(100 ng/mL)、芍药苷组(LPS 100 ng/mL+芍药苷0.625 mg/mL);LPS刺激20 h后,免疫细胞化学法检测各组培养细胞HMGB1的表达水平.结果:LPS刺激RAW 264.7细胞20 h后,LPS组细胞核HMGB1特异性染色变淡,胞浆染色加深,表明HMGB1从胞核转移到胞浆; 芍药苷组大部分细胞核HMGB1特异性染色深,而胞浆染色浅,表明芍药苷抑制HMGB1从胞核转移到胞浆.对HMGB1免疫组化数字图像的累积光密度值分析显示,HMGB1含量在三个实验组间差异有统计学意义(F=918.67,P<0.01),LPS刺激组和芍药苷组间差异有统计学意义(q=22.66,P<0.01).结论:芍药苷可能通过抑制HMGB1的核转位和释放,对LPS诱导的肝损伤起保护作用.     

苯并噁唑类化合物K310对LPS刺激RAW264.7巨噬细胞的抗炎作用

目的 探索K310对脂多糖(LPS)诱导RAW264.7巨噬细胞的抗炎作用及机制.方法 在LPS诱导RAW264.7巨噬细胞的模型基础上,采用CCK-8方法检测不同浓度K310对RAW264.7巨噬细胞活性的影响;Griess试剂检测K310对一氧化氮(NO)的影响;酶联免疫吸附法(ELISA)检测K310对IL-6炎性因子的影响;荧光定量PCR方法检测K310对诱导型一氧化氮(iNOS)和IL-6基因表达的影响;荧光免疫印迹法(Western bolt)检测K310对磷酸化的NF-kB和ERK1/2蛋白的影响.结果 K310(5、10和20 μM)不影响LPS刺激RAW264.7巨噬细胞的活性;与LPS刺激组比较,K310不仅能显著抑制NO和IL-6的炎性因子及炎性基因;还能抑制磷酸化的NF-kB和ERK1/2蛋白的表达.结论 K310对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞的炎症具有抗炎作用,其作用机制可能是K310通过抑制NF-kB和MAPK信号通路,从而抑制NO和IL-6炎性因子的产生.     

冠心平含药血清对氧化低密度脂蛋白诱导的RAW264.7巨噬细胞泡沫化的影响

目的 观察冠心平含药血清对氧化低密度脂蛋白（ oxidized low-density lipoprotein, ox-LDL）诱导的RAW264.7巨噬细胞泡沫化的调控作用。方法 将RAW264.7巨噬细胞分为对照组,模型组,冠心平含药血清低、中、高剂量组,以80 μg/mL ox-LDL刺激24 h,诱导巨噬细胞泡沫化模型,采用不同浓度冠心平含药血清进行干预。油红O染色观察巨噬细胞内脂滴形成;ELISA法检测巨噬细胞内游离胆固醇（free cholesterol,FC）与胆固醇酯（cholesterol esterase,CE）的表达水平;实时荧光定量PCR法检测巨噬细胞清道夫受体A（scavenger receptor-A,SR-A）和CD36 mRNA表达水平。结果 冠心平中、高剂量能够显著减少巨噬细胞泡沫化;低剂量显著增加巨噬细胞FC水平（P<0.05）,高剂量显著降低巨噬细胞CE水平（P<0.05）;冠心平高剂量显著增加SR-A mRNA表达水平（P<0.05）,低、中、高剂量均显著增加CD36 mRNA表达水平（P<0.05）。结论 冠心平能够抑制巨噬细胞的泡沫化,这或许是冠心平治疗动脉粥样硬化的潜在机制之一。     

IRF5基因慢病毒表达载体的构建及其在巨噬细胞RAW264.7中的表达

目的: 构建干扰素凋节因子5(IRF5)慢病毒表达载体LV11-cmv-neo-IRF5并转染巨噬细胞RAW264.7,观察IRF5巨噬细胞RAW264.7中的表达。方法: 采用基因重组技术,将PCR技术钓取的目的基因IRF5片段克隆至线性化慢病毒表达载体LV11中,重组载体经PCR、双酶切和测序鉴定构建成功后,采用脂质体转染技术将表达质粒和包装质粒共转染293FT细胞,获得携带IRF5基因的重组慢病毒;收集病毒上清液感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,用G418将非浸染的细胞致死,获得纯净的浸染细胞,即RAW264.7-IRF5细胞(实验组),并将RAW264.7-NC细胞作为对照(对照组)。分别采用RT-qPCR和Western blotting法检测2组细胞中IRF5mRNA和蛋白的表达水平。结果: 重组慢病毒质粒LV11-cmv-neo-IRF5经PCR和酶切法鉴定构建成功;病毒上清液感染RAW264.7细胞并经G418筛选获得阳性细胞;RT-qPCR法检测,与对照组比较,实验组细胞中IRF5mRNA表达水平升高(P<0.001);Western blotting法检测,实验组细胞中IRF5蛋白的表达水平明显高于对照组。结论: 成功构建携带IRF5基因的慢病毒表达载体LV11-cmv-neo-IRF5,IRF5基因在巨噬细胞RAW264.7中稳定表达。     

淫羊藿苷联合齐墩果酸对RAW264.7小鼠巨噬细胞迁移和M1极化的影响

【目的】探讨淫羊藿苷与齐墩果酸联合使用对RAW264.7巨噬细胞迁移及极化的影响,并探究雌激素受体在此过程中的作用。【方法】培养RAW264.7巨噬细胞,随机分为空白组[不加脂多糖(LPS)及药物]、LPS组(加入终浓度为20μg/L的LPS)、1.5μmol/L淫羊藿苷+1.5μmol/L齐墩果酸组、3.0μmol/L淫羊藿苷+3.0μmol/L齐墩果酸组、雌激素受体拮抗剂ICI182780(终浓度1×10-3 mmol/L)+1.5μmol/L淫羊藿苷+1.5μmol/L齐墩果酸组、ICI182780(终浓度1×10-3 mmol/L)+3.0μmol/L淫羊藿苷+3.0μmol/L齐墩果酸组。应用Transwell小室迁移实验观察淫羊藿苷与齐墩果酸联合使用对LPS诱导的巨噬细胞迁移效应的影响;应用流式细胞术观察淫羊藿苷与齐墩果酸联合使用对LPS诱导的巨噬细胞M1极化的抑制作用,并用雌激素受体阻断剂ICI183780观察雌激素受体在这个过程中的作用。【结果】Transwell小室迁移实验结果表明:与空白组比较,LPS组可显著促进RAW264.7巨噬细胞的迁移(P0.05);与LPS组比较,ICI182780+1.5μmol/L淫羊藿苷+1.5μmol/L齐墩果酸组、ICI182780+3.0μmol/L淫羊藿苷+3.0μmol/L齐墩果酸组均可显著抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞的迁移(P0.05),且ICI182780+3.0μmol/L淫羊藿苷+3.0μmol/L齐墩果酸组作用优于ICI182780+1.5μmol/L淫羊藿苷+1.5μmol/L齐墩果酸组(P0.05)。流式细胞术检测结果显示:与空白组比较,LPS组CD11c+表达显著升高(P0.05),说明20μg/L的LPS可以刺激RAW264.7巨噬细胞,使其向M1极化;与LPS组比较,1.5μmol/L淫羊藿苷+1.5μmol/L齐墩果酸组、3.0μmol/L淫羊藿苷+3.0μmol/L齐墩果酸组可协同LPS作用于RAW264.7巨噬细胞,使其向M1极化(P0.05);与LPS组比较,ICI182780+1.5μmol/L淫羊藿苷+1.5μmol/L齐墩果酸组、ICI182780+3.0μmol/L淫羊藿苷+3.0μmol/L齐墩果酸组均可显著抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞向M1极化(P0.05),且ICI182780+3.0μmol/L淫羊藿苷+3.0μmol/L齐墩果酸组作用优于ICI182780+1.5μmol/L淫羊藿苷+1.5μmol/L齐墩果酸组(P0.05)。【结论】淫羊藿苷与齐墩果酸联合使用可能通过雌激素受体产生促进RAW264.7巨噬细胞的迁移和M1极化的作用,并在雌激素受体受到抑制后产生相反的作用。