神经营养素-3基因修饰骨髓间充质干细胞的明胶海绵圆柱体支架移植促进大鼠全横断脊髓损伤部分结构和功能修复的研究

目的:探讨神经营养素-3(NT-3)基因修饰骨髓间充质干细胞(MSCs)的明胶海绵圆柱体支架移植对大鼠全横断脊髓损伤部分结构和功能修复的影响。方法:选取15只SD大鼠,随机分成3组:①NT-3基因修饰MSCs联合明胶海绵圆柱体支架移植组(NT-3-MSCs组);②MSCs联合明胶海绵圆柱体支架移植组(MSCs组);③单纯明胶海绵圆柱体支架移植组(control组)。在脊髓全横断后施行上述支架移植,在一定时间点比较3组动物功能恢复情况及其脊髓损伤区的结构变化。结果:NT-3-MSCs组BBB功能评分、移植的MSCs存活数、神经丝蛋白-200(NF-200)阳性纤维计数和平均空洞面积均优于其余组别(P<0.05)。结论:NT-3基因修饰MSCs联合明胶海绵圆柱体支架移植能够促进大鼠脊髓损伤部分结构和功能的修复,为临床治疗脊髓损伤提供实验依据。     

神经干细胞与NT-3基因修饰雪旺细胞联合移植促进全横断脊髓损伤大鼠功能修复的实验研究

目的：探讨神经干细胞(NSCs)与神经营养素-3(NT-3)基因修饰雪旺细胞(SCs)联合移植对全横断脊髓损伤大鼠的后肢运动及神经传导功能修复的作用。方法：将：NSCs与NT-3基因修饰SCs或未基因修饰SCs联合移植，或NSCs单独移植到大鼠全横断性脊髓损伤处，60d后进行爬网格测验和BBB评分检测运动功能。第67d，进行皮质运动诱发电位(CMEP)和皮质感觉诱发电位(CSEP）检测脊髓的神经传导功能。结果：脊髓损伤大鼠后肢的运动功能及CMEP和CSEP的修复程度依次为NSCs与NT-3基因修饰SCs联合移植组，NSCs与未基因修饰SCs联合移植组，NSCs单独移植组和实验对照组。结论：NSCs与NT-3基因修饰SCs联合移植能够促进脊髓损伤后大鼠的后肢运动及神经传导功能的修复。     

督脉电针与NSCs移植联合应用对大鼠脊髓全横断损伤组织NT-3含量及受体表达的影响

目的：探讨督脉电针与神经干细胞（NSCs）联合应用对大鼠脊髓全横断损伤组织神经营养素-3（NT-3）含量及其受体表达的影响。方法：将30只成年大鼠分为对照14d组、督脉电针14d组（电针14d组）、神经干细胞移植14d组（NSCs 14d组）、督脉电针＋神经干细胞移植14d组（电针NSCs 14d组）、神经干细胞移植30d组（NSCs 30d组）和督脉电针＋神经干细胞移植30d组（电针NSCs 30d组）6组，所有动物均实施T10段脊髓全横断手术．其中电针组和电针NSCs组于术后5d进行电针治疗。结果：①电针NSCs 14d组受损伤的脊髓组织含有较高水平的NT-3，其次是电针14d组和NSCs 14d组，对照14d组受损伤的脊髓组织含有较低水平的NT-3。②NSCs30d组和电针NSCs30d组脊髓全横断处的移植神经干细胞均有TrkC表达。结论：督脉电针与神经干细胞移植联合应用能够明显增高大鼠脊髓全横断损伤处邻近组织的NT-3水平；在大鼠脊髓损伤处及邻近组织有些移植神经干细胞表达TrkC。     

心肌营养素-1基因转移对大鼠脊髓损伤后红核神经元的保护作用

目的：观察腺病毒介导心肌营养素-1基因转移对大鼠脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)后红核神经元的保护作用。方法：制备大鼠颈3脊髓外侧索横切(C3Hx)模型，损伤区植入明胶海绵饱和的不同成分治疗及对照溶液。分为AdCMV-CT1组、空白对照组、AdCMV-eGFP对照组及正常对照组。荧光金(FG)于C2注射，1，4，8周脑切片，荧光显微镜下红核神经元记数观察红核神经元的存活。结果：在损伤后1～4周，标记红核神经元数几乎无变化。损伤后8周，损伤组、Adv-eGFP组、Adv-CT1组标记神经元分别减少31％，32％，19％。Adv-CT1组与损伤组相比，差异有显著性意义(P&;lt;0．05)。表明脊髓损伤后，红核神经元存在迟发性损伤。Adv-CT1在脊髓中长期表达，明显支持红核神经元的存活。结论：腺病毒介导心肌营养素-1基因转移长时间支持红核神经元的存活。     

水中平板步行训练对脊髓损伤大鼠运动功能及脑源性神经营养因子、神经营养素-3表达的影响

目的探讨水中平板步行训练在脊髓损伤（SCI）大鼠康复中的作用及其与脊髓可塑性的关系。 方法将40只成年雄性Sprague-Dawley大鼠分为假模组、模型对照组、水疗训练组、减重平板训练组及水中平板训练组,每组8只。建立大鼠脊髓挫伤模型,各训练组于术后1周开始进行8周的康复训练。采用BBB评分、爬网格试验评定大鼠后肢功能的恢复,采用免疫组织化学方法检测大鼠脊髓中脑源性神经营养因子（BDNF）、神经营养素-3（NT-3）的表达。 结果水中平板训练组大鼠后肢运动功能较其他组明显改善（P<0.05）。3个训练组大鼠脊髓前角神经元BDNF及NT-3的表达与模型对照组相比均显著增加（P<0.05）。BDNF的表达在3个训练组之间两两比较,差异均无统计学意义（P&rt;0.05）。水中平板训练组NT-3的表达明显高于减重平板训练组（P<0.05）;而水中平板训练组与水疗训练组相比,差异无统计学意义（P&rt;0.05）。 结论水中平板训练可能通过影响BDNF及NT-3的表达增强脊髓损伤大鼠脊髓可塑性,促进后肢运动功能的恢复。     

神经营养因子3基因修饰神经干细胞移植脊髓损伤的相关蛋白表达

背景:研究表明神经干细胞和神经营养因子3基因修饰的神经细胞联合移植能够在移植后存活并有效促进脊髓横断后脊髓的功能恢复,但神经营养因子3基因修饰的神经干细胞能否在脊髓受损部位发挥功能并促进脊髓损伤大鼠的功能恢复?目的:观察神经营养因子3基因修饰胚胎脊髓神经干细胞移植后脊髓损伤大鼠的功能恢复情况及损伤局部的基因表达.方法:将30只SD大鼠存T9水平进行脊髓半切后,随机分为3组,分别在受损脊髓内植入细胞培养液、神经干细胞及神经营养因了3基因修饰神经干细胞.另取10只仅行椎扳切除设置为空白对照.移植后通过行为学测试评价脊髓功能的恢复,RT-PCR和Western blot检测脊髓损伤部位神经营养因子3和髓鞘碱性蛋白的表达.结果与结论:移植神经营养因子3基因修饰神经干细胞组行为学测试结果最好,移植细胞培养液组行为学测试最差.与移植细胞培养液组相比,移植神经干细胞及神经营养因子3基因修饰神经干细胞组大鼠脊髓组织中神经营养因子3基因和髓鞘碱性蛋白基因的mRNA水平明显上调,在蛋白水平也有类似的结果,且神经营养因子3基因修饰神经干细胞组效果更明显.提示移植神经营养因子3基因修饰神经干细胞能促进脊髓受损部位出现史多向少突胶质细胞分化的细胞,并能更强的表达神经营养因子3.     

心肌营养素-1基因转移对大鼠脊髓损伤后红核神经元的保护作用

目的观察腺病毒介导心肌营养素-1基因转移对大鼠脊髓损伤 (spinal cord injury,SCI)后红核神经元的保护作用. 方法制备大鼠颈 3脊髓外侧索横切 (C3Hx)模型,损伤区植入明胶海绵饱和的不同成分治疗及对照溶液.分为 AdCMV- CT1组、空白对照组、 AdCMV- eGFP对照组及正常对照组.荧光金( FG)于 C2注射, 1,4,8周脑切片,荧光显微镜下红核神经元记数观察红核神经元的存活. 结果在损伤后 1～ 4周,标记红核神经元数几乎无变化.损伤后 8周,损伤组、 Adv- eGFP组、 Adv- CT1组标记神经元分别减少 31% ,32% ,19%. Adv- CT1组与损伤组相比,差异有显著性意义 (P< 0.05).表明脊髓损伤后,红核神经元存在迟发性损伤. Adv- CT1在脊髓中长期表达,明显支持红核神经元的存活. 结论腺病毒介导心肌营养素-1基因转移长时间支持红核神经元的存活.     

电针治疗大鼠慢性脊髓损伤疗效观察及分子机制的实验研究

目的 探索电针治疗慢性脊髓损伤的作用机理.方法 采用大鼠后路渐进性脊髓压迫动物模型,然后手术减压,并进行电针治疗.通过体诱发电位和BBB评分观察后肢功能,采用免疫组化和蛋白印迹法观察神经营养因子-3 （NT-3）及其受体（TrkC）的变化.结果 脊髓损伤后NT-3和TrkC在神经元及胶质细胞表达增强,经过电针治疗后, NT-3和TrkC在神经元和胶质细胞的表达下降.诱发电位检测和BBB评分显示,电针组疗效优于减压组（P〈0.05）.结论 电针治疗可促进脊髓损伤大鼠的行为功能恢复,这可能是通过内源性神经营养因子及其受体介导的.     

神经营养素-3修复脊髓损伤的研究进展

脊髓损伤的修复是神经科学研究领域的一大难题,原因之一是损伤脊髓的再生能力极其有限。近年来大量实验证明神经营养素－3（NT－3）对脊髓损伤的再生修复具有至关重要的作用,其中又以其基因移植效果为佳。本文就NT－3对脊髓损伤的修复研究进展作一综述。     

神经营养素-3对大鼠脊髓损伤后caspase-3基因表达的影响

【目的】研究神经营养素-3(NT-3)对大鼠脊髓损伤后caspase-3基因表达的影响,探讨NT-3在脊髓损伤修复中的作用。【方法】SD大鼠80只,分为生理盐水对照组和NT-3组。用RT-PCR分析方法观察两组caspase-3基因的表达情况。【结果】①脊髓损伤后caspase-3基因mRNA转录水平升高;②NT-3组与生理盐水对照组相比caspase-3基因转录水平下降(P<0.05)。【结论】NT-3抑制caspase-3基因的表达,可能是促进神经纤维损伤后再生的一个重要因素。     

Natural killer cell-mediated lysis of autologous cells modified by gene therapy.

This study investigated the role of natural killer (NK) cells as effectors of an immune response against autologous cells modified by gene therapy. T lymphocytes were transduced with LXSN, a retroviral vector adopted for human gene therapy that carries the selectable marker gene neo, and the autologous NK response was evaluated. We found that (i) infection with LXSN makes cells susceptible to autologous NK cell-mediated lysis; (ii) expression of the neo gene is responsible for conferring susceptibility to lysis; (iii) lysis of neo-expressing cells is clonally distributed and mediated only by NK clones that exhibit human histocompatibility leukocyte antigen (HLA)-Bw4 specificity and bear KIR3DL1, a Bw4-specific NK inhibitory receptor; and (iv) the targets are cells from HLA-Bw4(+) individuals. Finally, neo peptides anchoring to the Bw4 allele HLA-B27 interfered with KIR3DL1-mediated recognition of HLA-B27, i.e., they triggered NK lysis. Moreover, neo gene mutations preventing translation of two of the four potentially nonprotective peptides reduced KIR3DL1(+) NK clone-mediated autologous lysis. Thus, individuals expressing Bw4 alleles possess an NK repertoire with the potential to eliminate autologous cells modified by gene therapy. By demonstrating that NK cells can selectively detect the expression of heterologous genes, these observations provide a general model of the NK cell-mediated control of viral infections.     

辐照后基因修饰自然杀伤细胞的特征及对卵巢癌细胞杀伤活性的研究

目的探讨800cGy辐照后人白细胞介素15基因修饰的自然杀伤细胞(NKG-IL15)表面分子特征及其对卵巢癌细胞的杀伤活性。方法收集NKG-IL15细胞,800cGy进行辐照,100cGy/分,流式法检测辐照前后NKG-IL15细胞表型;利用51cr释放法检测辐照前后NKG-IL15细胞对靶细胞的杀伤活性,同时3H掺入法检测照射后细胞的增殖能力。结果 800cGy辐照前后NKG-IL15细胞表型均为CD56强阳性,CD19和CD3为阴性;对卵巢癌HO-8910细胞杀伤结果显示,0、800cGy组杀伤率分别在70.0%～23.7%、69.4%～22.6%之间,杀伤无明显差别;800cGy照射后NKG-IL15细胞24h增殖能力为0。结论 800cGy辐照后的NKG-IL15细胞具有人自然杀伤细胞的特征,无增殖能力,对人卵巢癌细胞HO-8910有较高的杀伤活性,可成为卵巢癌过继性免疫治疗的方法 。     

Micro-dystrophin基因修饰的MSCs在mdx小鼠体内分化为肌卫星细胞的研究

目的：探讨携带抗肌萎缩蛋白小基因（Micro-dystrophin）的自体骨髓间质干细胞（MSCs）在Duchenne型肌营养不良症（DMD）模型鼠（mdx小鼠）体内分化为肌卫星细胞的潜能。方法：采用逆转录病毒介导micro—dystrophin基因转染mdx小鼠MSCs,通过尾静脉注射移植治疗mdx小鼠,移植后12周免疫荧光法检测受体鼠腓肠肌micro-dystrophin的表达,并分离培养肌卫星细胞进行鉴定。结果：受体鼠腓肠肌成功检测到micro-dystrophin表达;分离培养肌卫星细胞发现部分细胞可同时表达micro—dystropbin和c—met及micro—dystrophin和desmin。结论：自体mdx小鼠MSCs可携带外源性micro—dystrophin基因,并在体内分化为micro—dystrophin阳性肌细胞,少数细胞可作为肌卫星细胞长期存在。     

IL-4基因修饰HL-60细胞增强CTL杀伤活性机制初探

目的 进一步探讨IL－4基因修饰瘤苗增强细胞毒性T淋巴细胞（CTL）杀伤活性的机制。方法 通过逆转录病毒载体PL－IL－4－SN将人IL－4基因导入白血病细胞系HL－60细胞,以IL－4基因修饰瘤苗和野生型瘤细胞作刺激细胞诱导CTL反应,通过流式细胞仪检查肿瘤细胞表面MHC－Ⅰ、MHC－Ⅱ类抗原及B7－1、ZCAM－1等分子表达。结果 IL－4基因修饰诱导瘤细胞表达MHC－Ⅱ类抗原、B7－1及ICAM－1等细胞表面分子,对MHC－Ⅰ类抗原表达无影响,其瘤苗诱导的CTL杀伤活性为野生型瘤细胞的7倍（P＜0．01）,加入抗IL－4单抗可完全阻断IL－4诱声细胞表面MHC－Ⅱ类抗原及B7－1、ICAM－1分子的表达,IL－4基因修饰瘤苗诱导CTL反应时培养上清可测及IL－2产生。抗IL-4灌抗细胞MHC－Ⅱ类抗原等表面分子单抗可降低IL－2产生及抑制CTL反应。结论 诱导MHC－Ⅱ类抗原等表面分子表达,促进IL－2产生,可能是IL－4基因修饰增强CTL杀伤活性的作用机制之一。     

促血小板生成素基因转染小鼠骨髓基质细胞的实验研究

目的探讨促血小板生成素（TPO）基因修饰的小鼠骨髓基质细胞（BMSCs）对TPO基因的表达的影响。方法用脂质体lipofectamine^TM2000将TPO cDNA真核表达质粒转染至骨髓基质细胞（BMSCs），RT—PCR方法检测TPO mRNA的表达，免疫组化法测定TPO的表达。结果转染TPO基因的BMSCs TPO mRNA及TPO表达量明显高于空载体组（P〈0．01）及未转染组（P〈0．01）。结论阳离子脂质体能有效介导TPO cDNA真核表达质粒转染BMSCs，且转染后BMSCs中TPO mRNA及TPO的表达显著上调。     

Thymidine kinase gene modified bone marrow mesenchymal stem cells as vehicles for antitumor therapy

Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) represent an important source of cells for tissue repair. The tropism of these cells to the sites of injury and tumors has been well established. Their tumor-homing properties make BMSCs good candidates as antitumor agent delivery vehicles. In this study, we showed that BMSCs have the ability to migrate toward various cancer cells, including prostate cancer cells in vitro and in vivo and incorporating into the tumor mass. When infected with herpes simplex virus thymidine kinase (TK) gene by lentiviral transduction, TK-BMSCs maintained their tumor tropism capabilities and significantly inhibited the growth of subcutaneous PC3 prostate cancer xenografts in nude mice, in the presence of prodrug ganciclovir (GCV). Xenogenic TK-BMSCs also survived and exerted a significant antitumor effect in an animal model bearing metastastic RIF-1 (fibrosarcoma) tumor in the presence of prodrug GCV. The present study demonstrated that overexpression of TK in BMSCs did not affect their multidifferentiation potentials and their specific homing capacities toward the tumor mass, and the TK-BMSCs alone did not cause any harmful side effects in vivo. The use of TK-BMSCs as tumor-specific delivery vehicles together with controlled prodrug treatment may be a safe and novel anticancer therapy approach.     

慢病毒载体介导血管生长素1基因修饰骨髓间充质干细胞对颈动脉粥样硬化的影响

背景:骨髓间充质干细胞易于被外源基因转染,且具有向损伤组织趋化聚集的特性,便于将目的基因导入其中并发挥治疗性作用,可以通过分化为血管内皮细胞修复损伤的血管内膜.目的:探讨慢病毒载体介导的血管牛长素1基因修饰骨髓间充质干细胞移植后,对大鼠颈动脉粥样硬化的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-02/2008-05在福建省高血压研究所及福建医大附属第一医院中心实验室完成.材料:4周龄雄性SD大鼠32只,8只用于制备骨髓间充质干细胞,剩余24只随机分为3组;模型对照组、空载体组、血管生长素1转染组,8只/组.方法:以重组慢病毒为载体构建血管生长素1基因工程干细胞,以绿色荧光蛋白为报告基因,调整细胞密度为(1.0～2.0),1010 L-1.3组大鼠均采用球囊损伤法+高脂饮食构建颈动脉粥样硬化模型,造模后即刻,空载体组将未感染的0.1 mL骨髓间充质干细胞悬液注入颈总动脉外膜,分3点注射;血管生长素1转染组同法注入等量重组慢病毒感染的骨髓间充质干细胞悬液,饲养2个月后处死大鼠,取颈动脉组织.主要观察指标:Western blot法检测转基因干细胞中血管生长素1的表达,荧光免疫组织化学及苏木精-伊红染色检测动脉内膜/中膜面积比.结果:24只大鼠均进入结果分析.血管生长素1转染组表达血管生长素1蛋白,另2组无血管生长素1蛋白表达.移植后2个月,荧光显微镜下空载体组、血管生长素1转染组动脉壁内均可见绿色荧光蛋白阳性细胞;各组均可见动脉内膜增生,斑块形成;与模型对照组比较,空载体组内膜面积,中膜面积值无明显变化(P＞0.05),血管生长素1转染组内膜面积,中联面积值明显减小(P＜0.05).结论:经血管生长素1基因修饰的骨髓间充质干细胞移植可明显减轻动脉粥样硬化程度.     

GM—CSF基因修饰,抗原预激的树突状细胞体内诱导白血病细胞分化？…

目的：探讨树突状细胞在肿瘤治疗过程中的作用及机制。方法：以小鼠ＦＢＬ－３红白血病细胞皮下接种Ｃ５７ＢＬ／６小鼠建立荷瘤模型，采用流式细胞仪分析和透射电镜等技术，观察了粒－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）基因修饰的抗原预激的树突状细胞体内治疗作用。结果：采用ＧＭ－ＣＳＦ基因修饰的抗原预激的树突状细胞治疗，可以明显抑制白血病细胞生长；白血病细胞表达ＣＤ３４水平增加，同时ＭＨＣ－Ⅱ，Ｂ７－１，Ｂ７－     

小鼠GM-CSF基因修饰瘤苗腹腔免疫对抗原提呈细胞数量和功能的促进效应

目的 观察小鼠粒－巨噬细胞集落刺激因子（ｍＧＭ－ＣＳＦ）基因修饰的瘤苗体内免疫小鼠后的抗肿瘤效应以及对抗原提呈细胞数量和功能的影响。方法 应用腺病毒载体介导ｍＧＭ－ＣＳＦ基因修饰ＦＢＬ－３小鼠红白血病细胞,灭活后用作瘤苗腹腔免疫小鼠,检测免疫后体内诱导的细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）活性,观察小鼠存活期;计数免疫后腹腔中抗原提呈细胞（ＡＰＣｓ）的数量,流式细胞仪分析腹腔贴壁细胞中３３Ｄ１＾＋树突头细