输注自体骨髓间充质干细胞延长犬活体肝移植存活的实验研究

目的 探讨输注自体骨髓间充质干细胞延长犬活体肝移植存活的机制.方法 14只受体犬建立活体肝移植模型后,随机分为对照组和处理组,对照组仅做活体肝移植,处理组在活体肝移植的基础上,术中输注自体骨髓间充质干细胞,术后观察两组犬的生存时间、肝功能(AST、ALT)、组织病理变化及移植细胞的分化状况.结果 ①处理组比对照组的中位生存时间明显延长(P<0.01).②肝功能变化:术后两组AST、ALT总体相比较,处理组AST、ALT水平降低,有显著性差异(P<0.01).⑨组织病理变化:术后两组均出现不同程度的免疫排斥反应,且排斥程度相似.④移植细胞分化情况:输注的骨髓间充质干细胞向有功能的肝样细胞分化.结论 输注自体骨髓间充质干细胞可以延长活体肝移植受体犬的存活时间;经门静脉输注的自体骨髓间充质干细胞可向肝样细胞分化.     

免疫抑制剂联合供体骨髓输注诱导肝移植受体长期存活的研究

目的研究他莫克司(FK506)、霉酚酸酯(MMF)、抗CD28单克隆抗体(anti-CD28mAb)为主要免疫抑制方案联合供体骨髓输注,对大鼠肝移植受体存活时间的影响。方法建立大鼠原位肝移植模型:①A组(n=6):同品系移植,供、受体同为W istar大鼠或SD大鼠;②B组(n=14):W istar大鼠为供体,SD大鼠为受体(W istar→SD),术后不采取任何治疗措施;③C组(n=7):W istar→SD,术后FK506、MMF联合应用2 d;④D组(n=6):W istar→SD,术后FK506、MMF联合应用2 d,然后单独应用FK506共4 d;⑤E组(n=6):W istar→SD,术后供体骨髓输注,其余处理同D组;⑥F组(n=3):W istar→SD,术后供体骨髓输注,术后第1天应用1次anti-CD28mAb,FK506、MMF术后联合应用2 d,然后单独应用FK506共2 d。观察各组移植物的存活和排斥发生情况及其组织病理学改变。结果A组大鼠均存活100 d以上;B组大鼠死于急性排斥反应,中位存活时间为15.5 d;C、D组大鼠中位存活时间分别为46 d和68 d;E、F组大鼠均存活100 d以上,组织病理学检查门静脉周围和肝组织内未见明显炎症细胞浸润。结论W istar大鼠与SD大鼠间肝移植,属于高免疫排斥型动物组合,可作为大鼠肝移植免疫排斥和免疫耐受研究的有效品系组合;移植同时供者骨髓细胞的输注可获得移植肝的长期存活;anti-CD28mAb和短时间FK605、MMF联合应用具有协同作用。     

免疫抑制剂联合供体骨髓输注诱导肝移植受体长期存活的研究

目的研究他莫克司(FK506)、霉酚酸酯(MMF)、抗CD28单克隆抗体(anti-CD28mAb)为主要免疫抑制方案联合供体骨髓输注,对大鼠肝移植受体存活时间的影响.方法建立大鼠原位肝移植模型:①A组(n=6):同品系移植, 供、受体同为Wistar大鼠或SD大鼠;②B组(n=14):Wistar大鼠为供体,SD大鼠为受体(Wistar→SD),术后不采取任何治疗措施;③C组(n=7):Wistar→SD, 术后FK506、MMF联合应用2 d;④D组(n=6):Wistar→SD,术后FK506、MMF联合应用2 d,然后单独应用FK506共4 d;⑤E组(n=6):Wistar→SD,术后供体骨髓输注,其余处理同D组;⑥F组(n=3):Wistar→SD,术后供体骨髓输注,术后第1天应用1次anti-CD28mAb,FK506、MMF术后联合应用2 d,然后单独应用FK506共2 d.观察各组移植物的存活和排斥发生情况及其组织病理学改变.结果 A组大鼠均存活100 d以上;B组大鼠死于急性排斥反应,中位存活时间为15.5 d;C、D组大鼠中位存活时间分别为46 d和68 d;E、F组大鼠均存活100 d以上,组织病理学检查门静脉周围和肝组织内未见明显炎症细胞浸润.结论 Wistar大鼠与SD大鼠间肝移植,属于高免疫排斥型动物组合,可作为大鼠肝移植免疫排斥和免疫耐受研究的有效品系组合;移植同时供者骨髓细胞的输注可获得移植肝的长期存活;anti-CD28mAb和短时间FK605、MMF联合应用具有协同作用.     

骨髓干细胞在大鼠移植肝中的诱导分化

目的 研究骨髓干细胞在大鼠移植肝中的诱导分化情况及对大鼠长期存活的影响.方法 雌性受体大鼠随机分3组:空白对照组(A组)、D-hanks液组(B组)、骨髓干细胞组(C组).观察大鼠的中位生存时间、肝组织病理变化,基因Sry原位杂交和甲胎蛋白免疫组化双检测观察骨髓干细胞的分化情况.结果 C组中位生存时间大于180 d(P＜0.05);C组无明显的急性排斥反应.基因Sry原位杂交阳性,并且表达甲胎蛋白.结论 骨髓干细胞门静脉输注能减轻急性排斥反应,诱导大鼠肝移植术后长期存活;并能在移植肝的环境中诱导分化为肝细胞,表达甲胎蛋白,并逐渐替代移植肝本身的细胞.     

大鼠肝移植术后受体骨髓间充质干细胞输注肝内示踪与标记方法比较

目的 采用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(carboxyfluorescin diacetate succinimidyl ester, CFSE)与溴化脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,Brdu)两种细胞标记物观测肝移植术后受体骨髓间充质干细胞(MSCs)肝内分布情况.并对两种方法进行比较.方法 在已构建的DA-Lewis大鼠原位肝移植模型及提取培养Lewis大鼠MSCs的基础上分别用CFSE和Brdu对Lewis来源的MSCs进行标记,术中经门静脉输注,通过荧光显微镜和免疫组织化学法观测术后2mo内各时间点受体肝组织内MSCs的分布情况.结果 CFSE细胞标记率约为(94.1±1.4)%.受体肝组织第1、7、14天内有CFSE标记的MSCs聚集.对照组第5天肝组织内发布的CFSE标记MSCs消失.BrdU细胞标记率约为(90.3±3.5)%.受体肝组织第14天、1个月、2个月可见Brdu阳性的MSCs分布,对照组相应时间点肝组织内未发现Brdu阳性的MSCs.结论 CFSE和Brdu均为MSCs的良好标记物.CFSE标记细胞后荧光迅速减弱,适用于短期示踪.Brdu标记细胞后可维持较长时间,适用于长期示踪.两种标记方法均是MSCs较为简单有效的方法,实验显示受体MSCs大部分分布于移植肝脏.     

Delta阿片受体激活对大鼠骨髓间充质干细胞存活的影响

目的探讨Delta-阿片受体激活对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)存活的影响。方法体外分离培养骨髓间充质干细胞,实验分为4组,Ⅰ组(正常对照组),Ⅱ组(模型组):MSCs中加入放线菌素D;Ⅲ组(放线菌素D+SNC80组):MSCs细胞中加入放线菌素D和SNC80;Ⅳ组:MSCs细胞中加入放线菌素D、SNC80和Naltrindole。继续培养24 h后MTT法测定细胞活力;Annexin V-FITC/PI双标记法测定细胞凋亡;免疫印迹分析Caspase-3表达水平。结果 Delta-阿片受体激动剂SNC80可抑制骨髓间充质干细胞凋亡,但可被Delta阿片受体阻断剂Naltrindole抑制。结论 Delta-阿片受体激活可促进骨髓间充质干细胞存活,为提高骨髓间充质干细胞移植存活提供理论依据。     

同期输注供者骨髓间充质干细胞对肝移植大鼠免疫的影响

目的 探讨肝移植同时输注供者骨髓间充质干细胞对受体肝移植免疫的影响.方法 实验分为空白对照组(A组)、移植组(B组)和输注供者骨髓间充质干细胞组(C组).A组SD大鼠5只,只行剖腹探查,B,C组Wistar和SD大鼠各10只.行Wistar-SD大鼠肝移植同时,C组提取供体骨髓间质干细胞同期输注给受者,B组给予输注生理盐水.观察术后第7天肝功能的变化、病理改变和受体生存期.结果 肝移植同时输注供者骨髓间充质干细胞,ALT,AST,TBIL,ALB较B组显著降低,生存期明显延长,病理改变仅呈急性轻度排斥反应,而单纯移植组呈急性重度排斥反应.结论 肝移植同时输注骨髓间充质干细胞促进受体对移植肝的免疫耐受.     

大鼠骨髓间充质干细胞向成肌细胞诱导分化的研究

目的研究5-氮杂胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成肌细胞方向分化的最佳诱导浓度及诱导后细胞的活性,以得到稳定分化的成肌细胞.方法应用不同浓度的5-氮杂胞苷进行定向诱导分化,3H-TdR掺入试验检测诱导后细胞的活性状况,筛选出最佳的时相-浓度结合点,通过免疫组化鉴定分化结果.结果在10μmol/L5-氮杂胞苷诱导培养后15d细胞活性较好,免疫组化技术鉴定其已向成肌细胞方向分化.结论10μmol/L5-氮杂胞苷可成功诱导其向成肌细胞分化.为临床上以细胞注射治疗女性压力性尿失禁提供实验依据.     

大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞诱导分化的研究

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离纯化和定向成脂诱导。方法采用密度梯度离心法分离纯化骨髓间充质干细胞,免疫组织细胞化学法检测BMSCs表面抗原。脂肪诱导剂诱导BMSCs分化为脂肪细胞,利用油红O染色进行检测。结果免疫组织细胞化学检测结果显示,BMSCs表达CD29、CD44、CD90、CD106,不表达CD34、CD45。BMSCs经脂肪诱导剂诱导后,油红O染色阳性。随着诱导时间的延长,油红O阳性细胞比例增加。结论体外培养的BMSCs在一定诱导条件下能够向脂肪细胞分化,并且随着诱导时间的延长,脂肪细胞比例不断增加。     

大鼠骨髓基质干细胞体外培养

目的：建立分离纯化、快速扩增大鼠骨髓基质干细胞（Bone mesenchymal stem cells,BMSCs）的方法。方法：用全骨髓接种贴壁法,培养分离纯化大鼠BMSCs,传代扩增、测定生长曲线和贴壁率,形态学观察、免疫细胞化学法鉴定细胞膜抗原。结果：全骨髓贴壁法能有效分离纯化大鼠BMSCs,细胞在10%胎牛血清BMSCs培养基中生长状态稳定,第2代细胞生长曲线呈S型、第2、4、6代贴壁率基本相同,贴壁速度无显著性差别,p〉0.05。CD29、CD44和CD90免疫组化鉴定细胞均呈阳性。结论：全骨髓接种贴壁培养法能有效分离纯化大鼠BMSCs,在含10%胎牛血清的BMSCs培养液中,细胞稳定扩增,可能与细胞培养微环境良好有关。     

miR-122在骨髓间充质干细胞治疗大鼠急性肝损伤中的作用

目的:探讨miR-122在骨髓间充质干细胞(BMSCs)治疗大鼠急性肝损伤中的作用,阐明相关作用机制。方法:密度梯度离心法分离收集雄性大鼠的BMSCs,分为转染组和对照组,其中转染组BMSCs采用脂质体介导转染miR-122 mimics,对照组BMSCs未接受转染。将60只四氯化碳(CCl₄) 诱导的急性肝损伤大鼠随机分为肝损伤对照组(静脉注射生理盐水)、普通治疗组(静脉移植普通BMSCs)和实验治疗组(静脉移植转染miR-122的BMSCs)(n=20)。移植细胞后1、7和14 d检测大鼠肝功能,肝组织行HE染色观察其病理学改变。结果:转染miR-122 mimics后7 d,BMSCs中白蛋白(ALB)表达水平明显上调,而甲胎蛋白(AFP)的表达水平则明显下调。移植细胞后1d,与普通治疗组比较,实验治疗组血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)活性差异无统计学意义(P>0.05);移植细胞后7和14 d时,实验治疗组大鼠血清ALT和AST活性均低于普通治疗组(P<0.05);HE染色,实验治疗组大鼠肝脏充血、细胞质内空泡变性及肝细胞坏死情况明显好于普通治疗组。结论:上调BMSCs中miR-122表达水平能够促进其分化为肝样细胞,并可明显改善CCl₄所致大鼠肝脏损伤。     

菲立磁标记的大鼠骨髓基质干细胞在同种异体移植鼠肝脏中的追踪观察

目的:研究菲立磁标记的大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)在同种异体移植鼠肝脏中的追踪方法. 方法:采用菲立磁(Feridex)对分离培养的BMSCs进行标记,Prussian blue染色和电镜观察对标记后的BMSCs进行鉴定;取鉴定后的BMSCs 2 mL(1×109/L)分别注射到SD异体大鼠的门静脉、肝局部实质、尾静脉内;采用磁共振成像(MRI)技术(SE-T2WI,FSE-T2WI,GRE-T2WI序列)分别对移植前6 h,移植后6 h,1,3和5 wk时的大鼠肝脏进行扫描. 结果:Prussian blue染色证实Feridex标记BMSCs阳性率＞90%,透射电镜见铁颗粒位于BMSCs胞质中;MRI扫描 SE-T2WI序列成像显示:各移植组在移植前肝脏均未见异常低信号区;门静脉组大鼠移植后6 h在肝门部可见异常的低信号改变,1,3 wk低信号改变范围逐渐扩大,第5周时低信号改变消失;肝内注射组大鼠移植后6 h在肝脏局部注入区域可见异常的低信号改变,1,3,5 wk低信号改变区域逐渐扩大. 尾静脉组在移植后各时间点均未见到异常低信号改变. 结论:Feridex标记的大鼠BMSCs在同种异体移植鼠肝脏中可用MRI进行有效的追踪.     

自体骨髓干细胞移植辅助肝三叶切除术治疗肝癌的临床研究

目的探讨术前自体骨髓干细胞移植在辅助肝癌肝三叶切除术中的应用。方法选取2005年4月～2010年12月我院肝癌患者行肝三叶切除的19例患者,其中8例在切除肿瘤后术中经肝固有动脉对残肝进行干细胞移植,另外11例行常规肝三叶切除,切除肿瘤后经肝固有动脉仅输入等量生理盐水。分析比较两组肝癌肝三叶切除术后切除率,术后并发症的发生率以及分别在术后第1、2、4周复查肝脏功能,观察肝功能实验室指标、住院时间等。结果干细胞移植辅助肝三叶切除术治疗组术后并发症明显低于对照组,住院时间治疗组为(13±5)d,而对照组为(16±3)d,实验组短于对照组。术后实验组和对照组均有一过性肝功能不全,主要表现为转氨酶升高、清蛋白降低及腹水形成。术后丙氨酸转氨酶、总胆红素、白蛋白和凝血酶原时间实验组优于对照组(P<0.01)。结论自体骨髓干细胞移植辅助肝三叶切除术治疗肝癌有利于患者术后恢复及减少肝功能衰竭等严重并发症。     

骨髓干细胞移植后mdx鼠抗肌萎缩蛋白的表达

目的研究骨髓干细胞移植治疗Duchenne型肌营养不良鼠(mdx鼠)后抗肌萎缩蛋白表达的动态变化。方法取6~8周龄C57BL/6鼠骨髓干细胞,以2×107个/只干细胞尾静脉移植到经7Gyγ射线预处理后的7~9周龄mdx鼠体内,分别于移植后5、8、12、16周应用免疫荧光、逆转录-聚合酶链反应、Western blot检测腓肠肌抗肌萎缩蛋白的表达情况。结果经γ射线放疗预处理的mdx鼠,在尾静脉移植骨髓干细胞5周后可见抗肌萎缩蛋白少量表达,随移植时间延长表达逐渐增多,16周时肌纤维抗肌萎缩蛋白的表达为12%,并可见肌细胞核中移现象较同龄mdx鼠对照组减少,边居增多。结论同种异体骨髓干细胞移植治疗mdx鼠后,骨髓干细胞通过血液循环趋向病变肌组织,并分化为肌细胞表达抗肌萎缩蛋白。随移植时间延长表达增多,提示骨髓干细胞移植可长久持续参与受损骨骼肌的修复与再生。     

骨髓和脂肪源多潜能间充质干细胞的比较研究

①目的比较骨髓源间充质干细胞和脂肪源间充质干细胞的生物学特性。②方法分离人的骨髓源间充质干细胞和脂肪源间充质干细胞进行体外培养，通过绘制生长曲线，比较细胞的增殖能力；利用流式细胞仪分析细胞表型，并与诱导培养比较细胞的分化潜能进行比较。③结果脂肪源间充质干细胞与骨髓源间充质干细胞具有相当的生物学特性，且在增殖能力方面优于骨髓源间充质干细胞。④结论人脂肪组织可能成为一种新的间充质干细胞来源。     

体外成骨诱导增加人骨髓间充质干细胞刺激PBMCs增殖

目的初步观察人骨髓间充质干细胞(human bonemarrow derivedmesenchymal stem cell,hMSCs)及其成骨分化后代的免疫原性,为异基因hMSCs作为骨组织工程种子细胞研究提供理论基础.方法应用Percoll密度梯度离心法从人骨髓中分离、培养细胞hMSCs;将第3代hMSCs及其体外诱导成骨3周的分化后代分别与人外周血单个核细胞(human peripheral blood mononuclear cell,PBMC)混合培养,观察上述细胞对PBMC的刺激指数.结果Percoll(1.073g/ml)分离培养的原代hMSCs为均匀一致的梭形,呈漩涡样排列.其在体外成骨诱导3周时Von-Kossa染色见细胞间质有大量的钙盐沉积,免疫细胞化学检测见到大多数细胞骨钙素表达阳性.混合细胞培养结果显示:不同细胞数量的hMSCs对PBMCs的刺激指数(stimulation index,SI)均小于2;而1×104、5×103、103的hMSCs-Osteo对PBMCs的刺激指数大于2.结论hMSCs的免疫原性较低,在体外不能刺激PBMCs增殖.但hMSCs的成骨分化后代的免疫原性增加,一定数量细胞在体外能够刺激PBMCs增殖,其在异基因宿主体内可能引起免疫排斥反应.本实验结果提示:异基因骨髓间充质干细胞要作为骨组织工程种子细胞,必须克服免疫方面的障碍.     

自体骨髓源性肝干细胞移植治疗肝炎后肝硬化的临床研究

目的探索自体骨髓源性肝干细胞在体外诱导与扩增后肝内移植治疗肝炎后肝硬化的效果。方法选取2008年6月至2009年4月入住我科的肝炎后肝硬化、门脉高压症,并在我科接受了脾切除、门奇静脉断流术治疗的患者12例。治疗组6例,采集并分离自体骨髓源性肝干细胞,在体外培养诱导与扩增7天后,收集细胞在接受脾切除、门奇静脉断流术中经肝固有动脉注入法将其移植至肝内;对照组6例,以同样方法注入等体积生理盐水。通过术前术后患者肝功能及肝纤维化的指标来评估治疗的效果。结果两组病人的术后均未发现手术并发症,术前的各项检验均无统计学差异,术后治疗组肝功能指标谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆红素、血浆白蛋白、凝血酶原时间;肝纤维化指标:透明质酸、人III型前胶原,均好转:对照组未见明显变化,治疗组优于对照组(P<0.05)。结论自体骨髓肝干细胞体外培养诱导与扩增后肝内移植是一种安全有效的肝病治疗方法,可以显著改善肝炎后肝硬化患者肝功能及肝纤维化的指标。     

Electrophysiological characteristics of cardiomyocyte-like cells from rat bone marrow derived mesenchymal stem cells by four inductors

Background Bone marrow derived mesenchymal stem cel induced by different inductors individually or collectively. In s （BMdMSCs） can differentiate into cardiomyocyte-like cells this study, by inducing BMdMSCs with p53 inhibitor （p-fifty three inhibitor-alpha, PFT-a）, 5-azacytidine （5-AZA）, angiotensin-II （Ang-II） and bone morphogenic protein-2 （BMP-2） we compared the influences of four inductors on the differentiation of rat BMdMSCs into caridomyocyte like-cells. Methods BMdMSCs were collected from the bone marrow of Sprague Dawley rats and after the fourth generation, the purified cells were divided into five groups： 5-AZA （10 μmol/L）, Ang-II （0.1 μmol/L）, PFT-α （20 μmol/L）, BMP-2 （10μg/L） and control. The purity of the BMdMSCs and the cardiac differentiation rates were obtained by flow cytometry. The expressions of cTnT in the BMdMSCs after four weeks of induction were detected by immunofluorescence and the expressions of cTnl and Cx43 detected by Western blotting. The green fluorescent levels reflecting intracellular calcium transient function were determined by laser scanning confocal microscopy. The total potassium current levels of cells were measured on patch clamp. Results All inductors affected to a different degree the differentiation of BMdMSCs into cardiomyocyte-like cells and the expressions of cTnT, cTnl and Cx43 suggesting that the combination of inductors could be an improved method for cardiac regenerative medicine. In addition, the total potassium current level and calcium transient in PFT-a cardiomyocyte-like cells were higher than other groups. Conclusions The cardiac differentiation of BMdMSCs induced by PFT-α, 5-AZA, Ang-II and BMP-2 has been improved at different levels. PFT-a has an advantage of differentiation rate and electrophysiological function over other inductors.     

In vivo transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells accelerates repair of injured gastric mucosa in rats

Background  Adult stem cells provide a promising alternative for the treatment of injured tissues. We aimed to investigate the effect of in vivo transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSCs) on injured gastric mucosa in rats.

Methods  The gastric ulcer in rats was induced by indomethacin. BMMSCs from male rats, labeled with the fluorescent cell linker 5,6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFDA SE), were transplanted into the female rats via tail vein injection. The healing process of gastric ulcers was monitored by HE staining. The protein levels of vascular endothelial growth factor (VEGF) and the epidermal growth factor receptor (EGFR) in the injured gastric mucosa were determined by immunohistochemistry. 

Results  At 48 and 72 hours after BMMSCs transplantation, the CFDA SE labeled cells were found scattered in the injured gastric mucosa, but not in the gastric mucosa of control rats. At 72 hours after BMMSCs transplantation, the mean ulcer index was 12.67±2.16 in the BMMSCs transplanted group and 17.33±1.97 in vehicle-treated controls (P <0.01). Both VEGF and EGFR protein expression levels were significantly higher in the gastric section from the rats that received BMMSCs transplantation as compared to rats without BMMSCs transplantation.

Conclusion  Autologous BMMSCs transplantation can accelerate gastric ulcer healing in injured gastric mucosa in a rodent model.