胰岛素对新生大鼠缺氧/复氧心肌细胞凋亡的影响

目的:探讨胰岛素在新生大鼠缺氧/复氧心肌细胞损伤中对细胞凋亡的影响。方法:通过给原代培养乳鼠心室肌细胞行缺氧2 h/复氧4 h,建立缺氧/复氧(Anoxia/Reoxygenation)心肌细胞损伤模型。将培养心肌细胞随机分为:正常对照组(CON)、缺氧/复氧组(A/R)、缺氧/复氧+胰岛素组(I/R+INS)。于复氧4 h后,利用2,4二硝基苯肼显色法检测乳酸脱氢酶(LDH)活性,硫代巴比妥酸显色法检测丙二醛(MDA)含量,原位末端标记法(TINEL)和DNA梯带法(DNA Ladder)检测细胞凋亡,并比较各组间差异。结果:与A/R组相比,A/R+INS可明显降低MDA、LDH值(P<0.01),抑制心肌细胞凋亡(P<0.01)。结论:胰岛素具有减少新生大鼠缺氧/复氧心肌细胞损伤作用,其作用机制与抑制细胞凋亡作用有关。     

缩醛基毛冬青提取化合物R4对缺氧/复氧大鼠心肌细胞的保护作用

目的: 探讨缩醛基毛冬青提取化合物R4对缺氧/复氧损伤心肌细胞的保护作用及其机制。方法: 采用原代培养的新生大鼠心肌细胞建立缺氧/复氧损伤模型,实验分为正常细胞培养组和缺氧/复氧损伤模型组、缺氧/复氧损伤+缩醛基毛冬青提取化合物R4(5、10、20 μmol/L)组和缺氧/复氧损伤+ verapamil(5 μmol/L)组。用黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)的活性,硫代巴比妥酸显色法测定丙二醛(MDA)含量,MTT染色法测定线粒体脱氢酶活性改变,化学比色法测定乳酸脱氢酶(LDH)活性变化, Griess法测定一氧化氮(NO)的含量。结果: 缩醛基毛冬青提取化合物R4可显著提高缺氧/复氧损伤心肌细胞内SOD的活性及细胞内线粒体脱氢酶活性,能显著抑制LDH的活性、MDA的生成以及提高NO的含量,并能明显抑制心肌细胞凋亡。结论: 缩醛基毛冬青提取化合物R4具有明显抗缺氧/复氧损伤、保护心肌细胞的作用。     

3,6-[二甲氨基]-二苯骈碘杂六环葡萄糖酸盐对缺氧/复氧心肌细胞的抗损伤作用

目的：观察3,6-[二甲氨基]-二苯骈碘杂六环葡萄糖酸盐（IHC-93）对培养心肌细胞缺氧/复氧的抗损伤作用。方法：用培养的心肌细胞建立缺氧/复氧损伤模型，观察在缺氧/复氧状态下心肌细胞活力、乳酸脱氢酶（LDH）活性、肌酸激酶（CK）活性和丙二醛（MDA）含量的变化以研究IHC-93对培养心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响。结果：IHC-93呈剂量依赖地提高缺氧/复氧时心肌细胞存活率，减少LDH和CK的释放，降低MDA含量。结论：IHC-93对缺氧/复氧的心肌细胞具有直接保护作用。     

右美托咪定减轻氧化应激改善H9C2细胞缺氧/复氧损伤

目的 探讨右美托咪定减轻氧化应激改善H9C2细胞缺氧/复氧损伤的作用。方法 H9C2心肌细胞随机分为三组,正常对照组（Control）、缺氧/复氧组（H/R）、Dex（5 μmol/L）干预H/R组。Dex干预H/R组先用Dex预处理6 h后,再经缺氧/复氧处理。检测各组细胞培养基中LDH的含量,CCK-8法检测各组H9C2心肌细胞的存活率,试剂盒检测caspase-3活性,试剂盒检测MDA的含量和SOD活性。结果 与Control组相比,H/R组细胞活力降低,培养基中LDH含量增加,caspase-3活性增加,MDA含量升高而SOD活性降低,统计学意义显著（P＜0.01）;Dex预处理提高H/R处理后的细胞活力,减少LDH含量和caspase-3活性,降低MDA含量,增加SOD活性,统计学意义显著（P＜0.01）。结论 Dex可通过减轻氧化应激改善H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤。     

钙敏感受体表达增加诱发内质网应激在缺氧复氧性心肌损伤中的作用

目的：观察钙敏感受体表达增加诱发内质网应激在缺氧复氧性心肌损伤中的作用。方法:乳鼠原代心肌细胞培养4-5 d后，随机分为5组:正常对照组（N组）、缺氧/复氧组（H/Re组）、阻断剂（NiCl2,CdCl2）组、激动剂（GdCl3,NiCl2,CdCl2）组和caffeine组。采用饱和氮气pH6.8的D-Hands液培养细胞3 h，再用含20%新生牛血清的DMEM液培养细胞9 h，复制心肌缺氧/复氧模型。检测血清LDH活力，MTT检测细胞存活率，心肌细胞caspase-12和CaSR 蛋白表达水平Western blotting检测, 激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）测定心肌细胞内游离钙的变化。结果:缺氧/复氧组和激动剂组LDH活力、细胞内游离钙浓度均高于对照组;同时，caspase-12和CaSR的表达也明显高于对照组。反之，细胞存活率低于对照组。结论:心肌缺氧/复氧过程中，钙敏感受体表达增多,从而破坏了细胞内钙稳态诱发过度的内质网应激,通过caspase-12等凋亡蛋白表达的增多等途径引起心肌细胞凋亡。     

NO介导TNF-α诱导的培养大鼠缺氧/复氧心肌细胞的保护作用

目的:研究一氧化氮(NO)在肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的缺氧/复氧心肌细胞的保护作用。方法:在培养的大鼠乳鼠心肌细胞上,建立缺氧/复氧模型,测定复氧后培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的释放量和细胞内锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)活性。结果:(1)用TNF-α(10⁵U/L)预处理,缺氧/复氧后心肌细胞内Mn-SOD活性增高、LDH释放量减少;(2)NO供体硝普钠(SNP)(5μmol/L)和前体L-精氨酸(L-Arg)(5mmol/L)预处理心肌细胞3h,缺氧/复氧后细胞内Mn-SOD活性增高、LDH释放量减少,用Nω-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)(100μmol/L)预处理减弱了TNF-α的抑制缺氧/复氧心肌细胞LDH释放和诱导Mn-SOD活性增高的作用;(3)可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)抑制剂ODQ(10μmol/L)和CPK抑制剂chelerythrine(5μmol/L)可分别减弱SNP、L-Arg和TNF-α对缺氧/复氧心肌细胞的保护作用;(4)TNF-α对缺氧/复氧心肌细胞的保护作用可被抗氧化剂2-巯基丙酰氨基乙酸(2-MPG,400μmol/L)削弱,但是酪氨酸蛋白激酶(TK)抑制剂4,5,7-三羟基异黄酮(genistein,50μmol/L)预处理对TNF-α诱导的心肌缺氧/复氧保护无影响。结论:NO参与TNF-α对缺氧/复氧损伤心肌细胞的保护作用,PKC和SGC可能为其下游信号途径成分。     

PTEN对缺氧复氧心肌H9c2细胞凋亡、氧化损伤及免疫炎症因子水平的影响

目的:研究第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物(PTEN)对缺氧复氧条件下心肌H9c2细胞凋亡、氧化损伤及免疫炎症因子水平的影响。方法:用H9c2细胞构建缺氧复氧模型。细胞转染PTEN小干扰RNA(siRNA)和阴性对照siRNA,缺氧复氧处理后,RT-PCR和Western blot分别测定细胞中PTEN的mRNA和蛋白水平。MTT法测定细胞活力,流式细胞术测定细胞凋亡,用黄嘌呤氧化法测定细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性,用硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)含量,用二硝基苯肼法测定培养液上清中乳酸脱氢酶(LDH)活性,ELISA测定培养液上清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)和白细胞介素6(IL-6)水平,Western blot法测定细胞中cleaved caspase-3、Bax和Fas L的蛋白水平。结果:缺氧复氧处理后H9c2细胞中PTEN的mRNA和蛋白水平均明显升高(P 0. 05)。转染PTEN siRNA后的细胞中PTEN的mRNA和蛋白水平明显下降(P 0. 05)。缺氧复氧处理后H9c2细胞活力下降,凋亡率升高,细胞中cleaved caspase-3、Bax和Fas L的蛋白水平升高,MDA水平也升高,SOD活性下降,培养液上清中LDH、TNF-α、IL-1β和IL-6的水平升高(P 0. 05),而下调PTEN可以部分拮抗缺氧复氧对H9c2细胞活力、凋亡率、MDA水平、SOD水平及培养液上清中LDH、TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影响。结论:下调PTEN可以减轻缺氧复氧诱导的心肌H9c2细胞氧化损伤,减少H9c2细胞凋亡,降低TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。     

大鼠心肌多巴胺受体在缺氧-复氧时的表达变化及其意义

目的： 观察大鼠心肌多巴胺受体在缺氧-复氧时的表达，初步探讨其与心肌缺氧-复氧损伤的关系。方法: 采用Langendorff离体灌流装置复制大鼠心肌缺氧-复氧模型。用RT-PCR和Western blotting结合图像分析系统，分别检测缺氧-复氧心肌多巴胺受体DR1、DR2 mRNA和蛋白质的表达变化；用紫外分光光度计测定大鼠冠脉流出液中LDH活性；透射电镜观察心肌超微结构的变化。结果: 大鼠心肌组织在缺氧40 min时的DR1、DR2 mRNA和蛋白表达高于正常对照组(P<0.05)，缺氧40 min后复氧1h显著高于正常对照组(P<0.01)，2 h达高峰，3 h、4 h后降低，但仍高于正常组(P<0.01)；同时随复氧时间延长，冠脉流出液中LDH活性增加，心肌超微结构损伤加重。结论: 大鼠心肌多巴胺受体DR1、DR2表达在缺氧-复氧过程中呈先升高后降低的特点，可能参与心肌缺氧-复氧损伤的发生。     

siRNA 技术沉默SOCS3 对缺氧复氧心肌细胞增殖、凋亡的影响以及作用机制

目的：研究小干扰RNA（siRNA）靶向沉默细胞因子信号转导抑制因子3（SOCS3）基因对心肌细胞增殖、凋亡的影响以及可能作用机制。方法：采用脂质体Lipofectamine 2000转染大鼠H9C2心肌细胞,分为对照组、缺氧/复氧组、缺氧/复氧+siRNA NC组、缺氧/复氧+siRNA SOCS3组;免疫印迹试验（Western blot）检测细胞的转染效果;噻唑蓝（MTT）观察细胞的增殖活性,观察细胞中乳酸脱氢酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）水平的变化;膜联蛋白 V-FITC（Annexin V-FITC）/碘化丙啶(PI)染色法检测细胞凋亡率,Western blot检测核因子-κB（NF-κB）、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、c-Myc蛋白水平。结果：与对照组相比,缺氧/复氧组心肌细胞SOCS3蛋白水平显著增加（P<0.05）,细胞的增殖活性、SOD显著下降（P<0.05）,LDH、MDA、凋亡率显著升高（P<0.05）;靶向沉默缺氧复氧心肌细胞SOCS3基因表达较缺氧/复氧组细胞的增殖活性和SOD显著增加（P<0.05）,LDH、MDA、凋亡率显著降低（P<0.05）;缺氧/复氧干预心肌细胞显著抑制NF-κB、Cyclin D1、c-Myc蛋白表达（P<0.05）,下调SOCS3基因表达显著增加NF-κB、Cyclin D1、c-Myc蛋白表达（P<0.05）。结论：沉默SOCS3表达促进缺氧复氧心肌细胞增殖,抑制其凋亡,增强机体氧自由基的清除能力,其作用机制与NF-κB信号通路的激活有关。     

甘氨酸脂质体的制备及其对心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响

目的： 将甘氨酸(Gly)包封于脂质体内，制备甘氨酸脂质体(glycine liposomes)微粒；观察甘氨酸脂质体对培养心肌细胞缺氧/复氧损伤的拮抗作用。 方法： （1）采用逆相蒸发法制备Gly脂质体微粒，观察乙醚、氯仿、乙醚＋氯仿3种不同有机溶媒对包封率的影响；透射电镜观察Gly脂质体形态、粒径。（2）建立培养乳鼠心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤模型，实验结束前测定各组培养液中乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）含量。 结果： （1）用乙醚＋氯仿混合溶媒制备的Gly脂质体包封率最高，达到64.8％（P<0.01）；（2）Gly、Gly脂质体与空白脂质体均能抑制缺氧/复氧诱导的心肌细胞LDH、CK、CK-MB释放。其中，Gly脂质体组抑制作用最为明显（P<0.05，P<0.01）。 结论： 用乙醚＋氯仿混合溶媒制备Gly脂质体能获得较高的包封率；Gly脂质体能对培养乳鼠缺氧/复氧心肌细胞发挥保护作用，其作用机制可能与脂质体携载Gly进入细胞作用于胞内细胞器有关。     

NRG-1 对缺氧复氧心肌细胞凋亡及氧化损伤的影响

目的:探讨神经调节蛋白1(NRG-1)对缺氧复氧环境下的心肌细胞凋亡及氧化损伤影响及机制。方法:以心肌细胞(HCM)为研究对象,构建缺氧复氧心肌细胞模型,在缺氧前加入0.8 mg/ L 的NRG-1。噻唑蓝(MTT)法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,二硝基苯肼显色法检测上清中乳酸脱氢酶(LDH)含量,二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)法检测活性氧簇(ROS)水平,硫代巴比妥酸法检测丙二醛(MDA)水平,黄嘌呤氧化酶法检测超氧化物歧化酶(SOD)水平,Western blot 检测蛋白激酶B(Akt)、磷酸化的Akt(p-AktThr308 )、cleaved caspase-3 的蛋白水平。结果:心肌细胞缺氧复氧后细胞吸光度(A)从0.66±0.03 降低至0.36±0.04,细胞凋亡率从(4.62±0.97)% 升高至(29.07±3.43)%,ROS 水平从69.29±7.96升高至280.84±20.52,LDH、MDA 水平也升高,SOD、p-Akt/ Akt 水平均下降。而NRG-1 处理后的细胞吸光度(A)从0.36±0.04升高至0.47依0.05,细胞凋亡率从(29.07±3.43)%下降至(19.76±3.41)%,ROS 水平从280.84±20.52 下降至128.23±12.32,LDH、MDA 水平也下降,SOD、p-AktThr308 / Akt 水平均升高。结论:NRG-1 能够部分抑制缺氧复氧诱导的心肌细胞凋亡和氧化损伤,影响心肌细胞中p-Akt/ Akt 的水平。     

HO-1在造影剂所致肾小管上皮细胞损伤中的作用

目的:探讨血红素加氧酶-1(Heme oxygenase-1,HO-1)在造影剂所致肾小管上皮细胞损伤中的作用.方法:体外培养的HK-2细胞,分为正常对照组、甘露醇对照组、造影剂损伤组、钴原卟啉(CoPP)处理组、锌原卟啉(ZnPP)处理组.比色法测定细胞培养上清液乳酸脱氢酶(LDH)水平,四甲基偶氮唑(methyl ...     

植物雌激素α-玉米赤霉醇对HUVEC低氧/复氧损伤的保护作用

目的:探讨植物雌激素α-玉米赤霉醇（ZAL）对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）低氧/复氧损伤的保护作用及其机制。 方法:低氧(93%N₂-5%CO₂-2%O₂)环境中培养HUVECs 3 h后再恢复正常氧供应1 h。用MTT法检测细胞存活率, 分光光度法测定细胞培养上清液中LDH、SOD活性及MDA含量。 结果:HUVECs经低氧/复氧处理后,细胞存活率及SOD活性显著低于对照(P<0.01), LDH活性及MDA含量显著高于对照(P<0.01)；经不同浓度(10-9-10-6 mol/L)的ZAL或雌二醇（E₂）预处理后, 均可显著缓解上述改变，此作用为剂量依赖性，同浓度ZAL与E2的作用无显著差异。 结论:ZAL对低氧/复氧损伤的HUVECs可产生与E2类似的保护作用, 机制可能与促进自由基清除而减轻细胞氧化应激损伤有关。     

左旋卡尼汀对缺氧/复氧诱导的心肌细胞氧化、凋亡影响的体外研究

目的：探讨左旋卡尼汀（L-carnitine）对缺氧/复氧（A/R）诱导的乳鼠心肌细胞抗氧化、抗凋亡效应及其可能的作用机制。方法： 采用原代培养乳鼠心肌细胞作为模拟缺血再灌注损伤实验模型，实验分3组：①正常对照组（control）；②A/R组:缺氧120 min,复氧240 min;③L-carnitine组：A/R前2 h加用L-carnitine设4个浓度梯度，1组20 mg/L，2组50 mg/L，3组100 mg/L，4组200 mg/L。观察各组细胞经A/R损伤后，细胞内超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量、琥珀酸脱氢酶（SDH）活性的变化情况，并用流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡率，透射电镜观察细胞超微结构的改变。结果： A/R组SOD活性、SDH活性明显低于对照组，MDA含量、细胞凋亡率均高于对照组(P＜0.05）；在L-carnitine用药组，随给药浓度的增加，MDA含量逐渐恢复正常，SOD活性、SDH活性逐渐回升，而且细胞凋亡率下降，各药物治疗组与A/R组比较各实验指标均显著差异(P＜0.05)；A/R组心肌细胞超微结构损伤明显重于药物治疗组。结论:左旋卡尼汀对心肌细胞具有保护作用，其作用在一定范围内呈剂量依赖关系。     

抗衰老Klotho蛋白减轻大鼠乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤

目的:观察抗衰老Klotho蛋白对大鼠乳鼠原代心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤的作用并探讨其作用机制。方法:建立大鼠乳鼠心肌细胞H/R模型,并将心肌细胞分为正常对照组、H/R模型组和不同浓度(0.1μmol/L、1μmol/L和10μmol/L)Klotho作用H/R组。观察各组心肌细胞H/R前后搏动频率变化,利用MTT方法检测细胞存活率;测定各组心肌细胞H/R后LDH、CK、AST的漏出量及MDA含量、SOD活性;流式细胞术检测各组心肌细胞的凋亡率;real-time PCR检测各组心肌细胞中内质网应激标记及凋亡相关分子GRP78、CRT和CHOP和caspase-12 mRNA的表达情况;Western blot法检测心肌细胞内内质网应激凋亡蛋白CHOP和caspase-12蛋白表达及Akt磷酸化水平。结果:与正常对照组相比,H/R模型组中心肌细胞搏动频率和细胞存活率显著下降,细胞凋亡率显著升高(P0.05);LDH、CK、AST和MDA含量升高而SOD活性显著降低(P0.05);GRP78、CRT、CHOP和caspase-12 mRNA表达显著增高(P0.05);CHOP和caspase-12蛋白表达随之增高而Akt的磷酸化水平显著降低(P0.05)。与H/R模型组相比,抗衰老Klotho蛋白作用H/R心肌细胞后,心肌细胞搏动频率和细胞存活率显著升高,细胞凋亡率逐渐降低(P0.05),LDH、CK、AST和MDA含量下降而SOD活性显著增高(P0.05),GRP78、CRT、CHOP和caspase-12 mRNA的表达逐渐降低(P0.05),CHOP和caspase-12蛋白表达也随之降低,而Akt磷酸化水平显著增加(P0.05)。结论:抗衰老Klotho蛋白能够提升H/R损伤后心肌细胞的存活率,抑制细胞凋亡,通过抵抗氧化应激和过度内质网应激反应发挥作用,并与激活Akt磷酸化有关。     

硫化氢对肢体缺血再灌注所致大鼠急性肺损伤的作用及机制

目的: 探讨内、外源性硫化氢(H₂S)在肢体缺血再灌注(IR)所致大鼠急性肺损伤(ALI)中的作用并初探其机制。方法: 应用双大腿根部止血带复制大鼠双后肢缺血及再灌注后肺损伤模型。将120只SD大鼠随机分为对照组(control)、IR组、NaHS+IR组和抑制H₂S生成的炔丙基甘氨酸(PPG)+IR组。肢体缺血再灌注后4 h处死动物, 测定肺系数;光镜下观察肺组织形态学改变;化学法检测血浆H₂S、NO、CO含量,肺组织丙二醛(MDA)含量、胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和血红素加氧酶(HO)活性以及支气管肺泡灌洗液(BALF)中中性粒细胞(PMN)数目和蛋白含量变化,并对血浆H₂S含量与上述指标进行相关性分析。结果: 大鼠肢体IR可引起肺组织明显的形态学改变、肺系数和肺组织MDA含量增加、BALF中PMN数目和蛋白含量增加、血浆H₂S含量和肺组织CSE活性下降、肺组织iNOS活性和HO活性及血浆中NO含量和CO含量增加。预先给予NaHS可显著减轻IR所致上述指标的改变; 而预先给予PPG可加重IR所致肺损伤, 使BALF中PMN数目和蛋白含量、血浆NO含量和肺组织iNOS活性进一步增加, 但对血浆CO含量和肺组织HO活性无明显影响。H₂S含量与CSE活性、血浆CO含量、肺组织HO活性呈正相关(均P<0.01);与其它指标呈负相关(均P<0.01)。结论: H₂S/CSE体系的下调参与介导了大鼠肢体IR所致大鼠ALI的发生, 内、外源性H₂S具有抗肢体IR所致ALI的作用, 该作用可能与其抗氧化效应、减轻PMN所致肺部过度炎症反应以及下调NO/iNOS体系、上调CO/HO体系有一定关系。     

右美托咪定对H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的 观察右美托咪定对H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用。方法 H9C2心肌细胞随机分为三组:正常对照组（Control）、缺氧/复氧组（H/R）、Dex（5 μmol/L）干预H/R组。Dex干预H/R组先用Dex预处理6 h后,再经缺氧/复氧处理。采用倒置显微镜观察各组H9C2心肌细胞形态的变化,检测各组细胞培养基中LDH的含量,CCK-8法检测各组H9C2心肌细胞的存活率,试剂盒检测caspase-3活性,TUNEL法检测细胞凋亡并计算凋亡指数。结果 与Control组相比,H/R组细胞皱缩,大量死亡,细胞活力降低,培养基中LDH含量增加,caspase-3活性增加,细胞凋亡指数增加,统计学意义显著（P＜0.01）;Dex预处理可明显改善H/R处理后细胞形态,提高细胞活力,减少LDH含量和caspase-3活性,降低细胞凋亡指数,统计学意义显著（P＜0.01）。结论 Dex可通过减少H9C2心肌细胞缺氧/复氧引起的细胞凋亡减轻损伤。