乙酰肝素酶基因siRNA表达载体的构建及其沉寂作用

目的:构建针对人乙酰肝素酶(HPSE)基因的小干扰RNA(siRNA)及其表达载体,转染细胞后观察其对HPSE基因的干扰作用。方法:设计HPSE靶向的发夹状siRNA,合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入pRNATU6.1载体,转化扩增后进行序列测定。用脂质体包裹转染人恶性黑素瘤细胞A375,采用半定量PCR测定HPSE基因RNA水平变化,Western blot检测HPSE蛋白表达的变化。结果:将针对HPSE基因的siRNA的双链寡核苷酸片段克隆到pRNATU6.1载体,经过阳性菌落PCR鉴定与测序,结果正确;转染A375细胞后,半定量PCR和Western blot检测显示,HPSE基因和蛋白的表达水平明显降低(P<0.05)。结论:成功构建了针对HPSE基因的siRNA载体,转染细胞后可抑制HPSE的表达。     

TSG101 siRNA表达载体的构建及其作用研究

目的构建TSG101（tumor susceptibility gene 101，TSG101）小于扰RNA（TSG101 siRNA）的真核表达载体并鉴定，初步研究其与胃癌多药耐药的相关性。方法根据小于扰RNA的设计原则由计算机软件辅助设计TSG101的靶序列，应用DNA重组技术将目的序列克隆入小干扰RNA的表达载体；将TSG101 siRNA的真核表达载体转染胃癌长春新碱（VCR）耐药细胞SGC7901／VCR，通过Western blot鉴定TSG101 siRNA的抑制效率；以MTT实验检测细胞生长曲线和对VCR、阿霉素（ADM）的药物敏感性。结果所构建的载体经酶切后释放出预期大小的片断并经测序证实；TSG101 siRNA真核表达载体瞬时转染胃癌耐药细胞SGC7901／VCR后，发现TSG101的表达被显著抑制；细胞生长减慢，且对VCR、ADR的敏感性增加。结论成功构建了TSG101 siRNA的真核表达载体，并初步提示其参与了胃癌的多药耐药，为下一步工作奠定了基础。     

靶向EGFR基因的siRNA表达载体构建及其生物学效应的研究

目的构建靶向表皮生长因子受体(EGFR)基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体(pSi-EGFR),并观察其抑制人肺腺癌细胞株A549中EGFR基因表达的效果及生物学效应.方法利用Lipofectamine2000将构建的pSi-EGFR载体转入A549细胞中,应用实时定量荧光PCR、免疫荧光和流式细胞仪检测EGFR基因mRNA和蛋白水平的表达,并采用四甲基偶氮唑蓝显色法(MTF)、集落形成实验观察细胞生长变化.结果pSi-EGFR可显著抑制A549细胞中EGFR基因的表达;转染pSi-EGFR细胞生长抑制率为67.8%,集落形成抑制率为59.4%.结论pSi-EGFR载体能够在A549细胞中引发RNA干扰(RNAi)效应下调EGFR基因表达来抑制细胞增殖.     

siRNA靶向Rac1真核表达载体的构建与效应检测

目的 构建、纯化并鉴定Rac1特异性siRNA的真核表达载体,并在HeLa细胞中初步检测其转染率及对Rac1基因的抑制率.方法 体外合成含针对人、鼠的Rac1特异基因序列的siRNA链,定向克隆至pSUPER质粒中, 对重组质粒进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析.将抽提的质粒转染入HeLa细胞,荧光显微镜观察转染效率,荧光定量RT-PCR法鉴定其抑制Rac1基因表达的效果.结果 利用RNAi技术成功构建抑制 Rac1 表达的小干扰 RNA 重组载体,并成功转染到HeLa细胞中(载体转染率达到70%以上).在mRNA水平对Rac1基因的表达产生明显抑制作用(抑制率为87%以上).结论 成功构建了针对Rac1的siRNA真核表达载体,为进一步研究Rac1的功能奠定了基础.     

针对Cox-2基因siRNA载体构建和沉默效应

目的 构建针对人Cox-2基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体,观察RNA干扰对肺癌细胞Cox-2基因表达的沉默作用.方法 设计Cox-2靶向的发夹状siRNA,依据设计合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入pSINsi-hU6载体,转化扩增后进行序列测定.用脂质体包裹转染人肺癌细胞NCI-H446,采用RT-PCR检测Cox-2基因mRNA表达的变化.结果 把针对Cox-2基因的siRNA的双链寡核苷酸片段克隆入pSINsi-hU6载体,经过酶切鉴定与测序.结果 正确;RT-PCR检测显示,Cox-2基因的表达水平明显降低.结论 成功构建出显著沉默细胞Cox-2基因表达的siRNA载体.     

针对MTA1基因siRNA载体构建和沉默效应

目的 构建针对人MTA1基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体,观察RNA干扰对食管癌细胞MTA1基因表达的抑制作用.方法 设计MTA1的siRNA靶序列,分别合成两条互补的寡核苷酸链,退火后重组入pRNAT-U6.2载体,转化扩增后进行序列测定.用脂质体包裹转染人食管癌细胞EC9706,采用RT-PCR和Western blotting分别检测MTA1基因mRNA和蛋白表达的变化.结果 把针对MTA1基因的siRNA的双链寡核苷酸片段克隆入pRNAT-U6.2载体,经测序分析,插入片段正确;RT-PCR和Western blotting检测显示,MTA1基因的表达水平明显降低,其中以481-499(GACCCT GCTGGCAGATAAA)为靶序列的siRNA沉默作用最强,MTA1蛋白几乎完全不表达.结论 成功构建出沉默食管癌细胞MTA1基因表达的siRNA载体,为通过沉默MTA1基因的表达来减少恶性肿瘤侵袭转移提供了实验基础.     

靶向Livin基因siRNA载体的构建和沉默效应观察

目的:构建针对人Livin基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体,并观察该载体对食管癌细胞Livin基因表达的沉默效应。方法:依据siRNA设计原则,分析Livin mRNA序列,设计并合成2个Livin靶向的发夹状siRNA靶序列,退火后分别连接入pSUPER-neo载体,转化扩增后进行序列测定。用脂质体包裹法将重组质粒转染人食管癌细胞EC9706,采用RT-PCR检测转染细胞Livin mRNA的表达。结果:经过酶切鉴定与测序,构建的靶向Livinα和Livinβ基因的siRNA载体,结果正确;RT-PCR检测显示,转染细胞Livin mRNA的表达水平降低。结论:成功构建沉默细胞Livin基因表达的siRNA载体。     

Survivin基因siRNA表达载体的构建及其在食管癌EC109细胞中的表达

目的 为研究survivin基因的功能及食管癌的基因治疗，构建针对survivin基因的siRNA的表达载体，转染细胞EC109后观察其对survivin基因表达的抑制作用。方法 利用网站选择适当位点设计并合成针对survivin基因mRNA的寡核苷酸序列，插入质粒pBAsi-hU6中形成重组载体pBAsi-survivin。重组载体经测序鉴定后转染食管癌细胞EC109，western blot检测转柒前后survivin蛋白的表达情况。结果 测序结果与所合成的寡核苷酸完全一致，证实成功构建了针对survivin基因的siRNA表达载体。Western blot检测显示转染食管癌细胞EC109后有效抑制了survivin基因的表达。结论 针对surivivin基因的siRNA表达载体成功构建，并能有效抑制食管癌细胞EC109中survivin基因的表达。     

VEGF靶向性siRNA表达载体的构建及其沉寂作用

目的：构建针对VEGF的siRNA表达载体,转染入人骨肉瘤细胞系MG-63观察其对细胞VEGF表达的沉默效应.方法：设计VEGF发卡样siRNA,依据设计合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入T载体,转化扩增后进行序列测定.用脂质体包裹转染骨肉瘤细胞MG-63,用RT-PCR方法检测细胞VEGF mRNA表达水平.结果：把针对VEGF基因的siRNA的双链寡合苷酸片断克隆到表达载体pSuperneo,经过酶切鉴定与测序,结果正确;稳定转染人骨肉瘤细胞系MG-63后,用RT-PCR方法检测细胞VEGF mRNA表达水平明显降低.结论：成功构建出针对VEGF的siRNA表达载体pSuper-neo-VEGF,转染骨肉瘤细胞后能显著降低细胞VEGF mRNA表达.     

STAT3基因siRNA表达载体的构建及鉴定

目的利用RNA干扰技术,以信号转导和转录激活因子3(STAT3)为靶基因,设计构建重组体,并进行序列分析鉴定。方法设计一条有小发夹结构的DNA序列,聚合酶链反应(PCR)扩增合成siRNA表达框架(SECs)表达框架,克隆至载体psi Lent GeneTM中构建重组体,转化E.coli DH5α菌株,提取质粒进行酶切鉴定后测序分析。结果重组质粒经EcoRⅤ酶切、电泳、测序分析表明插入序列正确,重组质粒构建成功。结论成功构建了STAT3靶向RNA干扰重组体,为肿瘤的基因治疗在分子水平、细胞水平和整体水平的研究提供一些新方法。     

人血管内皮生长因子mRNA靶向siRNA表达载体的构建和表达

目的:构建人血管内皮生长因子(VEGF)mRNA靶向siRNA表达载体,观察其表达情况.方法:设计人VEGF靶向的发夹样siRNA,依据设计,合成2条互补的寡核苷酸链,退火后连接入pSUPERneo-GFP载体,转化扩增后得到重组载体pSUPERneo-GFP-siVEGF,进行序列测定.用脂质体转染法将重组载体转染食管癌细胞株Eca109,采用RT-PCR检测转染细胞VEGF mRNA的表达水平. 结果:经过酶切鉴定与测序,pSUPERneo-GFP-siVEGF构建成功.稳定转染该重组体的Eca109细胞VEGF mRNA表达水平明显降低.结论:成功构建了针对VEGF mRNA的siRNA载体, 转染细胞后可显著抑制VEGF mRNA的表达.     

HER4基因siRNA载体的构建及其沉默作用

目的RNA干扰是由双链RNA引发的转录后基因沉默。为了研究表皮生长因子受体对食管癌细胞的作用,文中构建针对人HER4基因的小干扰RNA（siRNA）及其表达载体,转染人食管癌细胞Eca-109,观察其基因沉默效果,探索食管癌基因治疗的新途径。方法根据siRNA设计原则,设计针对HER4基因的两条寡核苷酸链,退火后与载体SUPER．neo＋gfp连接,然后进行酶切鉴定和DNA序列测定。用脂质体包裹转染食管癌细胞Eca-109,用荧光定量PCR和Western blot方法检测HERd蛋白表达情况。结果经酶切鉴定和DNA测序分析后,提示HER4靶向RNA干扰重组载体构建成功。转染食管癌细胞后,用荧光定量PCR和Westernblot法检测HER4基因表达水平显著降低。结论成功地构建了针对人HER4基因的siRNA表达载体,并可有效抑制食管癌细胞Eca-109中该基因的表达。     

CMV启动子调控的VEGF-shRNA表达载体的构建及有效干扰序列的筛选

目的:构建针对人VEGF基因的小干扰RNA(siRNA)的表达载体,实现CMV启动子调控,转染肿瘤细胞后观察其对VEGF基因的干扰作用,并筛选出有效的VEGF-shRNA.方法:设计三对VEGF靶向的发夹状shRNA,依据设计合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入质粒pDC311-SV40-RC中,转化扩增后进行序列测定.用脂质体包裹转染人骨肉瘤细胞U-2 OS,分别培养3d和7d后收集细胞培养上清液,ELISA检测上清中VEGF蛋白的表达.结果:将针对VEGF基因的siRNA的双链寡核苷酸片段成功克隆到pDC311-SV40-RC载体,经过阳性菌落PCR鉴定与测序,结果正确;转染U-2 OS细胞后,ELISA方法检测蛋白表达水平证实干扰序列3能有效降低VEGF的表达.结论:成功构建了CMV启动子调控的针对VEGF基因的siRNA载体,转染肿瘤细胞后可抑制VEGF的表达,并筛选出有效的干扰序列.     

容量调控氯通道在人胃癌细胞系SGC7901增殖中的作用

目的: 探讨容量调控氯通道在人胃癌细胞增殖中的作用. 方法: 应用细胞计数及MTT比色分析法观察细胞增殖情况;用流式细胞仪检测细胞周期时相;用膜片钳技术观察NPPB对容量调控氯通道的作用. 结果: NPPB (100 μmol/L)能够可逆性地抑制SGC7901细胞数及MTT吸光度值.经NPPB处理48 h 后,G1细胞比例比对照组明显增高.给予NPPB后可以抑制低渗激活的氯电流. 结论: 容量调控氯通道在人胃癌细胞系SGC7901的增殖中发挥重要作用.     

Effect of small interfering RNA targeting survivin gene on biological behaviour of bladder cancer

Background Bladder cancer is the most common type of urinary system tumours. It is frequently associated with genetic mutations that deregulate the cell cycle and render these tumours resistant to apoptosis. Survivin, a newly discovered member inhibitor of apoptosis protein （IAP） family in several human cancers, by inducing cell proliferation and inhibiting apoptosis is frequently activated in bladder cancer. We studied the influence of small interfering RNA （siRNA） targeting survivin on the biological behaviour of bladder cancer cells. Methods A double strand survivin target sequence specific siRNA was designed and synthesized. After transfection of bladder cancer cell line T24 by siRNA/liposome complex with increasing concentrations （50-200 nmol/L）, the transfectant cells were intratumourally injected at different doses （5 μg or 50 μg）. The effects were measured in vitro and in vivo. Results The selected siRNA efficiently down-regulated survivin mRNA expression in a dose and time dependent manner. The maximal effect was achieved at the concentration of 100 nmol/L, at which survivin expression level was down-regulated by 75.91%. The inhibition rate of cell growth was 55.29% （P〈0.01） and the markedly increased apoptotic rate was 45.70% （P〈0.01）. In vivo intratumoural injection of 50 μg siRNA-survivin could notably orevent the growth of bladder cancer （P〈0.01） in xenografted animals. Conclusion The application of siRNA-survivin could markedly inhibit survivin expression in bladder cancer cell line by inducing apoptosis and inhibiting the growth of the tumour. It may become a new gene therapy tool for bladder cancer.     

小分子干扰RNA分子化学修饰研究进展

RNA干扰是指转录后的基因沉默现象,可使基因沉默的小分子干扰RNA（siRNA）为基因治疗提供了又一个选择。为了实现其基因治疗价值,根据siRNA的作用机制和反义核酸修饰所取得的经验,为优化其药学性质和有效转运,进行了各种改进。其中,载体修饰和化学方法修饰siRNA是优化其性质的重要方法,本文对两种方法进行了简要的综述。     

特异性siRNA沉默LASP-1对HepG2细胞增殖和迁移的影响

目的应用RNA干扰技术沉默细胞内LASP-1蛋白的表达,探讨LASP-1蛋白对人肝癌HepG2细胞增殖和迁移的作用。方法根据LASP-1mRNA编码序列设计RNA干扰靶点并构建特异性小干扰RNA（siRNA）,通过脂质体转染入HepG2细胞,采用Westernblot法检测LASP-1蛋白的表达。采用CCK-8增殖实验、平板克隆形成实验、Transwell和划痕愈合实验方法,观察HepG2细胞增殖及迁移情况。结果（1）LASP-1siRNA对LASP．1蛋白表达水平有显著的下调作用（P〈0．05）。（2）体外实验结果显示,与HepG2组及阴性对照组相比,siRNA组HepG2细胞增殖和克隆形成率明显被抑制（P〈0．05）,其迁移能力也下降（P〈0．05）。结论下调LASP-1蛋白表达可显著抑制HepG2细胞的增殖和迁移能力,提示LASP-1在肝癌细胞恶性增殖和转移过程中具有重要作用,为临床上寻找抑制肝癌增殖转移的靶点提供新的思路和方法。     

小干扰RNA对人淀粉样前体蛋白基因的沉默作用

目的 观察小干扰RNA(siRNA)对人淀粉样前体蛋白(APP）基因的沉默作用，方法 该研究将设计好的一对寡核甘酸在细胞内源性地转录成小发夹RNA（shRNA)，同时构建了携带两个APP亚型的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的GFP-APP重组质粒。利用EGFP作为报告基因。在COS-7细胞内通过共转染siRNA表达质粒和GFP-APP的重组质粒来观察沉默效应。结果 针对APP的siRNA可有效地下调APP基因。结论 针对APP的siRNA将不仅在研究APP基因功能和深入研究阿尔茨海默病（AD）的病理分子机制上，而且在运用siRNA这种新型的反应核酸药物治疗AD方面扮演重要角色。