重组人肿瘤坏死因子-α联合肿瘤坏死因子受体1基因转染杀伤舌癌细胞的实验研究

目的 :观察重组人肿瘤坏死因子 α(rhTNF α)对建系细胞 (T T)作用效应与机制。方法 :反转录PCR方法克隆人TNFR1基因 ,并将其稳定转染入舌癌细胞中 ,建系并鉴定 ;通过MTT法检测、DNA降解片段琼脂糖凝胶电泳及电镜观察检测rhTNF α对T T细胞的作用效果与机制。结果 :成功构建含TNFR1基因的真核表达质粒 pcDNA3 TNFR1,并建立表达TNFR1蛋白活性的舌癌细胞系T T ;较之亲本Tca 8113细胞及转染空载体的T pc细胞 ,rhTNF α对T T细胞具有更强的细胞毒作用 ,且通过介导细胞凋亡的方式发挥其作用。结论 :重组人肿瘤坏死因子 α联合肿瘤坏死因子受体 1基因转染可有效地杀伤舌癌细胞 ,为舌癌基因治疗提供理论依据。     

人fadd基因cDNA的克隆和诱导舌癌细胞凋亡的研究

目的：观察人fadd基因对舌癌（Tca-8113）细胞的凋亡诱导作用。方法：用反转录PCR获取人fadd基因，将基因克隆入真核表达载体pcDNA和pIRES2和pIRES2-EGFP中，脂质体法转染舌癌细胞，通过细胞计数、荧光显微镜及电镜观察、流式细胞仪等检测技术被转染细胞的生长及其凋亡状况。结果：成功获取了人fadd基因。与对照组相比，在转染1-3d内，fadd基因的表达导致舌癌细胞存活数目减少，大量细胞发生凋亡。结论：人fadd基因可以诱导转染的舌癌细胞发生凋亡。     

腺病毒介导CD/5-FC系统治疗舌癌的实验研究

目的:探讨胞嘧啶脱氨酶基因/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)自杀基因治疗系统对舌癌细胞株的治疗效果。方法:应用透射电镜、RT-PCR检测含CD基因的重组腺病毒(AdCMVCD)对舌癌细胞株Tca8113的转染及表达情况,MTT法检测AdCMVCD/5-FC系统对舌癌细胞的杀伤作用及旁观者效应,FCM检测该系统对舌癌细胞周期的影响。结果: AdCMVCD可转染入舌癌细胞的胞核并表达CD基因;AdCMVCD/5-FC系统对舌癌细胞具有强杀伤作用和旁观者效应;FCM检测结果显示舌癌细胞S期比率显著升高(P<01001),G2+M期比率下降为0(P<01001),G1/G0期的改变不明显(P>0105)。结论:AdCMVCD/5-FC自杀基因系统对舌癌细胞株具有强的杀伤作用,杀伤作用具有细胞周期 (S期)特异性。     

双硫仑联合铜通过调控视神经萎缩蛋白1诱导舌癌细胞凋亡

目的 探讨视神经萎缩蛋白1（OPA1）在双硫仑联合铜（DSF-Cu）诱导舌癌细胞凋亡中的作用。 方法 用不同浓度的DSF-Cu干预舌癌细胞Cal-27,MTT法检测细胞增殖活性,Annexin V-FITC/PI染色结合流式细胞仪检测细胞凋亡,荧光素酶发光法检测ATP含量,Western blot法检测OPA1蛋白表达水平。 结果 DSF-Cu能抑制舌癌细胞的增殖活性,促进细胞凋亡的发生,减少细胞ATP含量,并呈浓度依赖性。Western blot结果示低浓度DSF-Cu对OPA1蛋白表达无明显影响,而中、高浓度的DSF-Cu显著抑制OPA1蛋白表达水平。 结论 DSF-Cu可诱导舌癌细胞凋亡,其机制可能是通过抑制OPA1表达。     

SIP1在人舌癌Tca8113细胞中的定位和融合蛋白表达鉴定的研究

目的检测Smad相互作用蛋白1(SIP1)在人舌癌Tca8113细胞系中的定位及融合蛋白的表达鉴定。方法 PCR扩增SIP1编码序列的全长,克隆到pCMV-Flag-MAT-Tag 1载体。利用共聚焦激光扫描显微镜观察SIP1和SIP1-Flag在人舌癌Tca8113细胞系中定位,并将构建好的Flag标签SIP1(SIP1-Flag)真核表达载体转染到人舌癌Tca8113细胞系中,提取蛋白进行Western blot检测,利用Flag标签抗体进行免疫沉淀纯化SIP1-Flag融合蛋白。结果构建了SIP1-Flag真核表达载体。SIP1和SIP1-Flag融合蛋白主要定位于人舌癌Tca8113的细胞核中,Western blot检测到SIP1-Flag融合蛋白表达,且在人舌癌Tca8113细胞中成功纯化SIP1-Flag蛋白。结论成功构建真核表达载体。SIP1和SIP1-Flag主要定位于细胞核,成功鉴定融合蛋白表达并纯化SIP1-Flag融合蛋白。     

黏着斑激酶基因沉默促进舌癌细胞失巢凋亡的实验研究

目的观察黏着斑激酶(focal adhension kinase,FAK)基因沉默对口腔舌癌细胞株Tca8113失巢凋亡抗性的影响,探讨FAK基因与口腔鳞癌转移特性的关系。方法以舌癌细胞株Tca8113为研究对象,首先应用免疫细胞化学和免疫蛋白印记的方法检测FAK基因的表达,然后利用RNA干扰的方法抑制FAK基因的表达。最后利用悬浮培养、流式细胞仪的方法观察FAK对口腔舌癌细胞株Tca8113体外培养过程抗失巢凋亡的影响。结果舌癌细胞株Tca8113体外培养过程中具有较强的抗失巢凋亡特性。特异性siRNA可以抑制FAK基因的表达。FAK基因干扰后,Tca8113细胞的失巢凋亡显著提高(P<0.01)。结论FAK基因沉默可以逆转舌癌细胞株Tca8113体外培养过程中的抗失巢凋亡特性。     

P16/cyclin D1表达与舌癌淋巴结转移关系的研究

目的 :研究P16蛋白 ,cyclinD1在舌癌原发灶及转移淋巴结中的表达 ,旨在探讨它们与舌癌淋巴结转移的关系 ,以指导治疗和评估预后。方法 :应用免疫组化方法检测 2 43例舌癌的原发灶及其转移淋巴结的P16蛋白 ,cyclinD1表达。结果 :2 43例舌癌的原发癌中P16蛋白阳性表达率为 5 6.4% ( 13 7/2 43 ) ,cyclinD1的阳性表达率为 62 .1% ( 15 1/2 43 )。P16蛋白 ,cyclinD1表达与舌癌的组织分化和淋巴结转移密切相关 ,而与临床分期和发病部位无关。结论 :P16蛋白缺失 ,cyclinD1过表达与舌癌的组织分化和淋巴结转移有关 ,可以作为舌癌判断淋巴结转移和预后评估的生物指标之一     

IL-1β作用于人牙周膜成纤维细胞后TRAF6蛋白表达的研究

目的通过研究IL-1β干预下,TRAF6在人牙周膜成纤维细胞中的蛋白表达,为细胞因子网络对细胞功能调控作用的研究提供新资料。方法原代培养人牙周膜成纤维细胞,并进行免疫学鉴定。取5～8代细胞以IL-1β梯度浓度干预,采用免疫组织化学方法检测TRAF6在人牙周膜成纤维细胞中的表达。结果TRAF6在正常的人牙周膜成纤维细胞中呈阴性表达,IL-1β干预后,TRAF6呈阳性表达,并且随IL-1β干预的浓度的升高而增强。结论IL-1β作用后,TRAF6在牙周膜成纤维细胞出现表达,且与IL-1β作用浓度相关。     

肿瘤坏死因子受体相关分子6在成牙本质细胞中表达的研究

目的 :研究肿瘤坏死因子受体相关分子 6(TRAF6)是否在成牙本质细胞中表达。方法 :通过westernblot、免疫组化染色研究TRAF6蛋白在成牙本质样细胞系MDPC 2 3中的表达。结果 :Westernblot结果显示MD PC 2 3细胞总蛋白中有大小约 60Kda的TRAF6蛋白条带 ;免疫组化法表明TRAF6在MDPC 2 3细胞浆呈阳性表达。结论 :本实验从蛋白水平证实了成牙本质样细胞MDPC 2 3表达TRAF6,提示TRAF6可能是一种新发现的影响成牙本质细胞分化的胞内信号转导分子     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及其受体在头颈部肿瘤的研究进展

肿瘤坏死因子(TNF)相关凋亡诱导配体(TRAIL)是 TNF 家族中继 TNF 和 Fas 抗原配体之后发现的又一重要的新成员,具有诱导肿瘤细胞、转化细胞等发生凋亡而对正常细胞无凋亡诱导作用的特点.自发现至今,因其对肿瘤细胞的选择性而被人们关注并逐渐发展成为靶向肿瘤治疗研究的热点.本文将对TRAIL的特性,TRAIL及其受体诱导凋亡的分子机制,以及TRAIL为靶点的基因治疗和作为抗肿瘤药物在各类肿瘤尤其是头颈部恶性肿瘤中的应用进展及前景展开综述.     

A20对IL-17介导人牙周膜细胞RANKL表达影响

目的探究A20对IL-17调控人牙周膜细胞表面RANKL表达的影响。方法转染人牙周膜细胞(h PDLCs)A20siRNA、慢病毒,获得A20沉默/过表达h PDLCs,分为沉默组、正常组、过表达组,IL-17(50 ng/ml)刺激一定时间,ELISA,PCR,Western-blot检测RANKL表达。结果 A20沉默组的h PDLCs RANKL蛋白表达水平较正常对照组高,A20过表达组较正常对照组低,IL-17(50ng/ml)刺激下,A20沉默组较正常对照组RANKL表达水平高,过表达组较正常对照组低。结论本研究首次发现A20可能参与调控IL-17引起的h PDLCs RANKL表达。     

巴戟天多糖通过上调沉默信息调节因子1抑制炎性牙周膜细胞NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3的表达及活性

目的 探讨炎性微环境下巴戟天多糖（MOP）对牙周膜细胞沉默信息调节因子1(SIRT1)及NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)表达的影响。方法 将30只大鼠随机分为对照组（n=6）和模型组（n=24）,模型组采用正畸丝结扎法建立牙周炎模型,3周后每组各处死6只大鼠,Micro-CT检测确认建模成功。剩余模型组大鼠随机分为牙周炎自然恢复组、生理盐水（NS）组和MOP组。MOP组于大鼠左上颌第一磨牙腭侧注射MOP [200 mg/（kg·3d）,50μL,持续4周],NS组注射等体积NS,牙周炎自然恢复组不做任何处理。取大鼠左上颌骨组织,采用苏木精-伊红（HE）染色观察牙周膜细胞病理改变,免疫组织化学检测SIRT1、NLRP3表达量。体外培养人牙周膜成纤维细胞（hPDLFs）,CCK-8检测MOP对细胞活性的影响。将第4代细胞分为对照组、炎症组（10μg/mL脂多糖）及实验组（5μmol/L MOP,5μmol/L MOP+10μg/mL脂多糖）。利用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）及Western blot检测SIRT1和NLRP3表达变化,免疫沉淀及酶联免疫法（ELIS...     

GLUT1基因有效siRNA序列的筛选实验研究

目的:设计合成干扰葡萄糖转运蛋白1(glucose transporter 1,GLUT1)基因表达的不同小型干扰RNA(siRNA),筛选出能高效抑制GLUT1基因表达的siRNA。方法:根据人GLUT1 mRNA的序列,设计合成4对不同的针对GLUT1的siRNA,应用脂质体LipofectamineTM2000转染试剂转染293T细胞制作病毒,将4对siRNA转染人舌鳞癌细胞Cal-27,实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术检测GLUT1 mRNA表达;Western印迹法检测GLUT1蛋白表达;18F-FDG检测GLUT1基因干扰后对Cal-27细胞摄取葡萄糖的影响。结果:设计合成的4对siRNA中有2对可有效抑制GLUT1的基因表达以及细胞对葡萄糖的摄取。结论:成功设计合成了针对GLUT1基因的siRNA,并从中筛选出能特异且高效阻断GLUT1表达的siRNA,为进一步应用RNA干扰技术进行GLUT1基因沉默,从而进行肿瘤的基因治疗奠定了实验基础。     

OLP中TNF-α、TGF-β1及其受体与细胞凋亡的关系和临床意义

目的 研究肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及其受体TNFR1，转化生长因子-β1（TGF-β1）及其受体TGFβR1在口腔扁平苔藓（OLP）的定位表达，以及与细胞凋亡的关系。方法 采用免疫组化法定位检测OLP组织和正常口腔粘膜（NOM）TNF-α、TNFR1、TGF-β、TGFβR1的蛋白表达；应用原位缺口末端标记技术，检测OLP、NOM组织细胞凋亡情况。结果 TNF-α、TNFR1在OLP组织（上皮层和固有层）内表达均有增强，明显高于对照组，二者在OLP上皮内可分布于上皮细胞，TNF-α多见于巨噬细胞和淋巴细胞，TNFR1则主要分布于部分巨噬细胞。TGF-β1在OLP固有层以及TGFβR1在上皮层和固有层的表达均有增强。TGFβR1可见于OLP全层上皮细胞，在固有层，TGF-α、TGFβR1则主要分布于成纤维细胞、血管内皮细胞和部分巨噬细胞内，二者在淋巴细胞内少见。细胞凋亡在OLP上皮层高于正常。上皮层中其阳性细胞集中分布于下部或全层上皮细胞。上皮层TNF-α表达与凋亡指数呈高度正相关。结论 TNF-α、TNFR1可能是促使上皮细胞凋亡的因素之一。TNFR1、TGF-β1、TGFβR1在OLP淋巴细胞内表达缺失，可能导致OLP痛程慢性迁延。     

干扰素诱导蛋白10对舌鳞癌细胞增殖、凋亡的影响

目的: 探讨干扰素诱导蛋白10（IP-10）对舌鳞癌细胞CAL-27增殖、凋亡的影响以及与CXCR3A、CXCR3B基因表达的关系。方法: 将CAL-27 细胞分为 3 个实验组和 1 个对照组,3 个实验组分别采用10、20、40 ng/mL 的IP-10刺激,对照组不予刺激。刺激12、24、48、72 h时,利用CCK-8法检测 4 组细胞的增殖活性;24 h 时,利用流式细胞仪检测细胞凋亡。采用Q-PCR检测10 ng/mL IP-10作用下,CAL-27细胞在12、24、48、72 h时CXCR3A、CXCR3B mRNA的表达情况。采用SPSS16.0软件包对数据进行单因素方差分析。结果: 12 h和24 h 时,3种浓度的IP-10 均能促进 CAL-27 细胞增殖（P<0.05）;在 48 h 时,只有40 ng/mL的 IP-10 能够促进 CAL-27 细胞增殖（P<0.01）; 而在72 h时,3种浓度的 IP-10对 CAL-27 细胞的增殖均无促进作用（P>0.05）。24 h后,3个实验组与对照组相比,CAL-27细胞的增殖率降低。24 h 时,3种实验组细胞凋亡率分别为（3.377±0.575）%、（6.867±2.848）%和（5.317±2.794）%,与对照组相比具有显著差异（P<0.05）,但各实验组间无显著差异（P>0.05)。12、24、48、72 h时,CXCR3A mRNA的表达量分别为0.0130±0.0007、0.0274±0.0005 、0.0204±0.0011和0.0174±0.0006,组间差异显著（P<0.05）;CXCR3B mRNA的表达量分别为0.0124±0.0015、0.0209±0.0016、0.0297±0.0013和0.0386±0.0010,组间差异显著（P<0.05）。结论: IP-10既能促进舌鳞癌细胞CAL-27增殖又能够诱导其凋亡,随着作用时间的推移,细胞增殖率降低;CXCR3A mRNA的表达先升高后降低,而CXCR3B mRNA的表达逐渐升高。CXCR3A、CXCR3B可能参与调控IP-10诱导下的舌鳞癌细胞的增殖和凋亡。     

TRPM1在舌癌组织及Tca8113细胞中表达的研究

目的 观察瞬间受体势M亚基1(Transient Receptor Potential Melastatin-1,TRPM1)在舌癌组织及舌癌Tca8113细胞系中的表达情况。方法 选取25例舌癌组织作为实验组,15例正常舌组织作为对照组,应用免疫组化及Western-blot的方法检测TRPM1蛋白在舌癌组织及Tca8113细胞与正常舌组织中的表达;应用RT-PCR方法检测TRPM1 mRNA在舌癌细胞与正常舌组织中的表达。结果 免疫组化实验结果显示,23/25例舌癌组织中TRPM1呈强阳性表达,2/25例呈阴性表达;12/15例正常舌体组织中TRPM1呈阴性表达,3/15例呈弱阳性表达。TRPM1在舌癌与正常舌组织中的表达有显著性差异(P<0.05);Western-blot实验显示舌癌组织及舌癌细胞系Tca8113细胞中TRPM1蛋白的表达水平高于其在正常舌组织的表达;RT-PCR实验结果也证实TRPM1 mRNA在Tca8113细胞中的表达高于正常舌组织。结论 TRPM1与舌癌的发生可能存在相关性。     

p75神经营养蛋白受体阳性舌鳞状细胞癌细胞的生物学特性研究

目的 对流式细胞仪分选获得的p75神经营养蛋白受体（p75NTR）阳性舌鳞状细胞癌细胞进行生物学特性研究。方法 通过流式细胞术检测舌鳞状细胞癌细胞系Tca-8113和Cal-27中p75NTR阳性细胞的表达。对流式细胞仪分选获取的 p75NTR阳性细胞进行单克隆培养、四甲基偶氮唑盐比色法及划痕实验检测,以未分选细胞为对照,分析 p75NTR阳性细胞的生物学特性。结果 舌鳞状细胞癌细胞株Tca-8113、Cal-27中,p75NTR阳性细胞的比例分别为3.1％和1.9％。与未分选的细胞相比,p75NTR阳性细胞的单克隆形成能力更高（ Tca-8113细胞, P=0.024;Cal-27细胞,P=0.009）;单克隆 p75NTR阳性细胞再培养 2周后, p75NTR阳性细胞率分别降为14.5%（Tca-8113）和5.8%（Cal-27）;p75NTR阳性细胞体外增殖能力显著增强,且具有明显的侵袭迁移能力。结论 p75NTR阳性舌鳞状细胞癌细胞具有肿瘤干细胞的特性。     

α亚族趋化因子受体3在人舌鳞癌细胞株的表达及其配体干扰素诱导蛋白-10对CAL-27细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨α亚族趋化因子受体3(CXC-chemokine receptor 3,CXCR3)在不同人舌鳞癌细胞株的表达以及其配体干扰素诱导蛋白-10(interferon induced protein 10,IP-10)对人舌鳞癌细胞株CAL-27增殖和凋亡的影响。方法采用蛋白印迹法和免疫荧光染色对3种人舌鳞癌细胞株(CAL-27、UM-1、Tca-8113)IP-10的相应受体CXCR3的表达进行检测。CAL-27细胞被分为3个实验组和1个对照组,3个实验组根据IP-10的刺激浓度,分为10 ng/mL组、20 ng/mL组、40 ng/mL组,对照组不予刺激。12 h、24 h、48 h时检测4组细胞的增殖;24 h时用流式细胞仪检测细胞的凋亡。结果 CXCR3在3种人舌鳞癌细胞株均有表达,并且CXCR3在3株细胞的胞膜及胞质内均有染色。和对照组相比,12 h、24 h时,3种浓度的IP-10均能够促进CAL-27细胞增殖(P<0.05);在48 h时,只有40 ng/mL的IP-10能够促进CAL-27细胞增殖(P<0.05),10 ng/mL、20 ng/mL的IP-10对CAL-27细胞的增殖无促进作用(P>0.05)。在24 h时,对照组、10 ng/mL组、20 ng/mL组和40 ng/mL组的细胞凋亡率分别为(0.053 3±0.472 6)%、(3.236 7±0.940 0)%、(4.516 7±1.115 4)%和(3.363 3±0.571 2)%,3种浓度IP-10均能够促进CAL-27细胞的凋亡(P<0.05),但3个实验组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论CXCR3在3种人舌鳞癌细胞株的胞膜及胞质内均有表达;IP-10既能促进CAL-27细胞的增殖,又能促进其凋亡。随着时间的延长,IP-10的促增殖作用减弱,而这种减弱可能是由IP-10的促凋亡作用的逐步发挥所引起的。     

可溶性白细胞介素-1和肿瘤坏死因子受体对大鼠正畸牙移动影响的研究

目的研究局部注射重组人类可溶性受体对大鼠正畸牙移动进程的影响。方法选取64只雄性SD大鼠,从加力第1天起在大鼠牙齿局部分别注射重组人类可溶性白细胞介素- 1受体Ⅱ（sIL- 1- RⅡ）、可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅰ（sTNF- RⅠ）、两者混合物,测量磨牙移动距离,用苏木精- 伊红（HE）染色观察被移动磨牙牙周组织形态学变化,并应用抗酒石酸盐酸性磷酸酶（TRAP）组织化学染色对破骨细胞和破牙骨质细胞的数量及分布的时相性改变进行分析。结果各受体组大鼠磨牙牙周组织形态学时相性变化与对照组相似,但各时间点牙槽骨吸收程度均较轻微,多数大鼠牙根表面很少或几乎没有明显牙骨质吸收迹象。与对照组相比,在第14天所有受体注射组牙槽骨及牙根表面TRAP染色阳性细胞降低了约50%（P<0.05）,但受体组组间差异无统计学意义（P>0.05）。结论在大鼠正畸牙局部注射重组人类可溶性白细胞介素- 1和肿瘤坏死因子受体,可以减少牙齿移动距离并减少牙根吸收。