7株小鼠胸腺基质细胞系诱导裸鼠骨髓干细胞表达CD4…

为研究胸腺微环境在Ｔ细胞发育中的作用，我室在体外建立了７株小鼠胸腺基质细胞系，命名为ＭＴＥＣ１－ＭＴＥＣ７。通过初步分离得到裸鼠骨髓富含干细胞的细胞群，表面ＣＤ４及ＣＤ８分子均为阴性，将分离的骨髓干细胞为胸腺基质细胞共育３天后，经双色荧光抗体染色，ＦＡＣＳ分析发现胸腺基质细胞可诱导裸鼠骨髓干细胞表达ＣＤ４ＣＤ８分子。ＭＴＳＣ－ＳＮ及ＭＴＳＣ主要诱导的是ＣＤ４＾＋ＣＤ８＾－细胞，部分ＣＤ４＾＋ＣＤ８     

小鼠胸腺基质细胞系诱导裸鼠骨髓干细胞分化为T细胞

为研究Ｔ细胞分化发育的过程，在体外建立了７株小鼠胸腺基质细胞系，应用这些小鼠胸腺基质细胞系及其培养上清在体外与经过分离的裸鼠骨髓干细胞共育７２小时后，用双荧光抗体染色，分析共育后的裸鼠骨髓细胞，发现有部分细胞分化为ＣＤ￣（３＋）ＴＣＲαβ￣－，ＣＤ３￣（３＋）·ＴＣＲαβ和ＣＤ３￣－ＴＣＲαβ￣＋细胞亚群，不同的胞腺基质细胞系和培养上清的诱导作用亦有差别。     

胸腺基质细胞促进CD4CD8双阳性胸腺细胞排除或成熟

胸腺基质细胞 (Ｔｈｙｍｉｃｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌｓ ,ＴＳＣ)是胸腺微环境最重要的组成部分 ,对胸腺细胞的分化发育具有重要作用。ＴＳＣ可促进胸腺细胞的成熟分化 ,减少胸腺细胞凋亡[1] ,也可促进ＣＤ4 ＣＤ8 双阳性 (ＤＰ)胸腺细胞凋亡及克隆排除[2 ] 。本文用光镜和电     

小鼠胸腺基质细胞系(MTEC1)在裸鼠体内生物学特性研究

通过流式细胞仪（ＦＡＣＳ）、组织学染色和免疫组化的方法研究了脾内注射的小鼠胸腺上皮细胞系ＭＴＥＣ１和初代培养的小鼠胸腺基质细胞在裸鼠脾脏内存活状态及功能特性。结果发现ＭＴＥＣ１细胞不仅能够在脾脏内存活，而且在ＭＴＥＣ１细胞周围有大量不成熟的淋巴细胞。初代培养的小鼠胸腺基质细胞则不能在脾脏内存活。     

九株小鼠胸腺基质细胞系自发分泌白细胞介素7的能力

胸腺基质细胞（ＴＳＣ）及其分泌的细胞因子在Ｔ细胞发育中起重要作用。我们以真核表达质粒ｐＣＤ－ＳＲα－ｍＩＬ－７在Ｃｏｓ细胞中表达了小鼠重组白细胞介素７（ｍｒＩＬ－７），活性为１．０６×１０＾４ｕ／ｍｌ。应用特异依赖ＩＬ－７生长的ｃｌｏｎｅＫ细胞株测定ＩＬ－７的生物活性方法，检测了本室自建的９株小鼠胸腺基质细胞（ＭＴＳＣ）系分泌ＩＬ－７的能力，９株均可自发分泌低水平的ＩＬ－７，活性介于３８～２６８ｕ     

Thymic Nurse Cells Support CD4^-CD8^＋ Thymocytes to Differentiate into CD4^＋CD8^＋ Cells

Thymic nurse cells （TNCs） represent a unique microenvironment in the thymus for T cell maturation. In order to investigate the role of thymic nurse cells during T cell differentiation, a TNC clone, RWTE-1, which formed a typical complex with fetal thymocytes in vitro was established from normal Wistar rat. Hanging drop culture method was applied to reveal the interaction between TNCs and thymocytes. Our result revealed that eighty percent of immature CD4^-CD8^＋ cells differentiated into CD4^＋CD8^＋ cells after a 12-hour hanging drop culture with RWTE-1. However, in a 12-hour culture of immature CD4^-CD8^＋ cells with or without RWTE-1 supernatant, only 30% of the cells differentiated into CD4^＋CD8^＋ cells spontaneously. This observation led to the conclusion that RWTE-1 cell has the capacity to facilitate immature CD4^-CD8^＋ thymocytes to differentiate into CD4^＋CD8^＋ T cells by direct interaction.     

小鼠胸腺基质细胞系MTDC的鉴定及细胞因子对其表面分子表达的作用

目的：鉴定小鼠胸腺基质细胞系MTDC，为进一步功能研究奠定基础。方法：利用多种鉴定小鼠胸腺树突状细胞的单克隆抗体对我室建立的一株缺乏上皮细胞典型特点的胸腺基质细胞系MTDC进行鉴定；并用多种细胞因子组合对MTDC及其MTDC(10)克隆进行诱导。结果：CD40、B7.1、MHC class I在MTDC的表达阳性率分别为70%、10%、10%；MTDC不表达CD11c、MHC classⅡ及Ly5.2低表达CD8α；DEC-205这一重要的树突状细胞的表面分子在MTDC及其１４个亚克隆中有不同程度的表达，阳性率分布于5%-58%。MTDC(10)克隆细胞在GM-CSF、IL-4、IFN-γ，anti-CD40 McAb联合作用下，可上调表达MHC classⅠ、MHC classⅡ及B7.1，阳性率分别为96.3%、42.1%、52.6%，高于MTDC被诱导后表达阳性率；并且发现去除４种因子中任何一种因子，均不能上调B7.1的表达，且IFN-γ在MHCⅡ类分子上调表达中起关键作用。结论：MTDC缺乏典型树突状细胞的表达标志及上皮细胞特点，可能为一特殊的胸腺基质细胞系。     

胸腺基质细胞对热应激小鼠胸腺细胞亚群变化及HSP70表达的影响

目的探讨胸腺基质细胞(TSC)对热应激小鼠胸腺细胞的调节作用。方法应用光镜、电镜、流式细胞术等观察初代培养的TSC对热应激胸腺细胞发育的调节作用。结果 TSC可大量粘附和吞噬胸腺细胞,使热应激胸腺细胞数量明显减少,但尚存的胸腺细胞中活细胞比例却明显增加,凋亡率明显减少。TSC可促进热应激胸腺细胞HSP70表达增加,使热应激胸腺细胞的DP及SP细胞,尤其是DP细胞数量明显减少。结论 TSC可清除大量的热应激胸腺细胞,TSC促进热应激胸腺细胞HSP表达增高可能具有双重意义:既可保护胸腺细胞,又可促进TSC识别和吞噬已受损的或凋亡的胸腺细胞。     

不同年龄大鼠骨髓基质干细胞的增殖特性

为了探讨年龄差异是否对大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)的增殖有影响。本研究采用免疫组织化学和苏木素染色检测体外培养的不同年龄大鼠BMSCs增殖能力的变化。结果显示:在培养的第5d,新生组增殖率为(78.7±5.3)%,成年组为(72.0±3.3)%,老年组为(65.4±3.9)%;在第7d增殖率分别是(78.3±3.2)%、(67.3±3.9)%和(52.6±6.0)%;在第9d,分别是(66.9±3.3)%、(46.4±3.9)%和(39.1±2.2)%。统计分析表明,在培养的第5、7、9d三个年龄组BMSCs的增殖率均有显著性差异(P<0.05)。结果提示:不同年龄的骨髓基质干细胞在体外均能快速增殖,但随着年龄的增大,其增殖能力明显下降。     

混合培养对骨髓基质细胞转分化为神经元的影响

目的　研究神经干细胞(NSCs)与骨髓基质细胞(BMSCs)混合培养对骨髓基质细胞转分化为神经元的 影响。　方法　将BMSCs传代培养2d,10μg LbFGF预诱导过夜,DAPI标记后加入到已贴壁分化2d的NSCs中,神 经元培养基混合培养7d后进行神经元特异性烯醇化酶(Nse)染色。对照组于BMSCs传代2d后,一组加bFGF处理 过夜,另一组不加,神经元培养基培养7d后NSE染色。　结果　实验组中部分BMSCs呈NSE染色强阳性,比例为 (13.38±5.79)%,对照组呈NSE阴性　结论　NSCs与BMSCs混合培养可诱导BMSCs转分化为神经元。     

体外培养骨髓基质细胞的类型及来源

用液体静置法体外培养小鼠骨髓基质细胞，对贴壁生长细胞进行倒置显微镜下的原位连续观察和数种酶的细胞化学观察。根据的细胞形态和酶蛋白质活性明显的移行特点，主要区分出三种类型的细胞，即网状细胞，巨噬细胞和成纤维细胞，观察到星形细胞和至少一部分巨噬细胞来源于网状细胞。     

GM-CSF重组腺病毒扩增的骨髓树突状细胞体外经肿瘤抗原刺激后诱导抗肿瘤免疫应答

用ＧＭ－ＣＳＦ重组腺病毒感染小鼠骨髓细胞，观察扩增到的骨髓树突状细胞的生物学功能。结果表明，ＧＭ－ＣＳＦ重组腺病毒一次性感染骨髓细胞，１ｗ后能从一只小鼠股骨中扩增到２．４×１０６～３．３×１０６树突状细胞，扩增到的骨髓树突状细胞表达ＭＨＣ－Ⅱ、ＭＨＣ－Ⅰ、Ｂ７－１、Ｂ７－２和Ｉ－ＣＡＭ－１等免疫分子，分泌一定水平的ＧＭ－ＣＳＦ，对同种异体Ｔ细胞具有很强的刺激活性，体外经Ｂ１６肿瘤瘤苗刺激后免疫同系小鼠，能诱导出抗原特异性的ＣＴＬ活性，使免疫动物产生更强的保护性免疫反应，抵抗Ｂ１６细胞的攻击。提示可用ＧＭ－ＣＳＦ重组腺病毒从骨髓中扩增足够数量的树突状细胞，用于肿瘤的免疫治疗和基因治疗。     

脱细胞神经基质诱导大鼠骨髓间充质细胞向Schwann细胞分化的形态学研究

为探讨脱细胞神经基质移植物(ANA)体外诱导成年大鼠骨髓间充质细胞(BMSCs)向Schwann细胞分化的可行性,本实验将分离的大鼠BMSCs进行体外培养扩增,行表型鉴定后,取第五代细胞,用ANA匀浆进行诱导。诱导后观察细胞的形态变化,免疫细胞化学染色和流式细胞术分别检测细胞中S-100、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况;RT-PCR检测诱导前后细胞的GFAP及S-100的变化;MTT测定不同诱导剂浓度诱导后的细胞活性。结果显示:BMSCs表型鉴定为CD44+、CD54+、CD34-,免疫细胞化学染色GFAP、S-100阳性细胞比例在诱导后分别为(64±5)%、(42±4)%;流式细胞仪检测和RT-PCR反应均显示GFAP、S-100的表达诱导组较对照组有所升高;MTT检测表明诱导剂浓度为1.0mg/ml时诱导后有活性细胞的数目最多。上述结果提示ANA可诱导成年大鼠骨髓间充质细胞分化为Schwann细胞。     

NGF对小鼠骨髓基质细胞体外诱导分化作用

为观察NGF等对小鼠骨髓基质细胞的诱导分化作用,从小鼠骨髓中分离培养基质细胞并传至第3代,采用bFGF预诱导24 h,NGF、维甲酸、β-巯基乙醇等诱导24 h后,进行NF-200、GFAP、fibronectin免疫荧光染色,荧光显微镜观察免疫阳性细胞。结果表明:诱导后小鼠骨髓基质细胞形态改变不明显,但出现表达NF-200、GFAP的细胞,而表达fibronectin的细胞减少,对照组几乎无NF-200和GFAP免疫阳性细胞,主要为表达fibronectin细胞。结论:NGF等可以在体外诱导小鼠骨髓基质细胞分化成表达NF-200和GFAP细胞。     

Murine CD8+ Invariant Natural Killer T Cells are Negatively Selected by CD1d Expressed on Thymic Epithelial Cells and Dendritic Cells

Background: CD1d-dependent invariant natural killer (iNKT) cells are found as either CD4 single positive (SP) or CD4/CD8 double negative (DN) cells in mice. The size of the CD8⁺ iNKT population is extremely small. It is known that CD1d expression on developing thymocytes is sufficient for iNKT development and co-receptor choice, which is driven by Th-POK expression. This study aimed to examine the factors involved in the CD4/CD8 co-receptor choice of iNKT cells in addition to Th-POK-driven silencing of CD8 expression. Methods: In this study, we compared iNKT cells of wild-type (WT) mice with those of transgenic mice in which CD1d expression is restricted to developing thymocytes by the proximal Lck (pLCK) promoter. CD8 positive iNKT cell population were analyzed by flow cytometry. Results: We found that there was a substantial population of CD8⁺ iNKT cells in the thymus and spleen of transgenic mice, and these cells are negatively selected in between Stage 2 and Stage 3 of their developmental program by the CD1d expressed on Thymic epithelial cell (TEC) and Dendritic cells in WT mice. Conclusion: We conclude that TEC expression of CD1d in the murine thymus contributed to co-receptor choice of iNKT cells, in addition to Th-POK-driven silencing of CD8. Therefore, mostly CD4 SP and DN iNKT cells are produced under normal physiological conditions in mice.     

小鼠骨髓基质细胞和蚕丝丝素材料的体外生物相容性

目的 研究体外培养的小鼠骨髓基质细胞(BMSCs)与蚕丝丝素材料的生物相容性,寻找BMSCs组织工程化神经的支架材料. 方法 通过贴壁法体外分离、培养小鼠(C57BL/6-GFP小鼠和C57BL/6小鼠)的BMSCs,与丝素共培养,通过光学显微镜和扫描电镜,观察细胞的黏附和生长情况.利用丝素浸出液培养BMSCs后,通过透射电镜观察细胞超微内部结构,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测丝素、羟基磷灰石、有机锡浸出液和普通IMDM培养基培养细胞12h、24h、48h、72h、7d的细胞活力,每组重复12次.流式细胞术检测丝素浸出液培养BMSCs的细胞周期及细胞表型,实验重复3次. 结果 通过光镜、电镜观察,发现小鼠BMSCs黏附着丝素纤维、并沿着丝素纤维延伸,一些BMSCs缠绕并包裹丝素纤维,黏附着丝素纤维的细胞有的呈圆,形有的呈梭形.与普通IMDM培养基培养的细胞相比,透射电镜下丝素浸山液培养后的BMSCs内部结构未见异常;丝素和羟基磷灰石浸出液对BMSCs的活力无显著性影响(P>0.05);丝素浸出液对骨髓基质细胞周期和表型无明显影响. 结论 蚕丝丝素与小鼠BMSCs有好的生物相容性,且丝素对BMSCs没有毒性作用,可作为BMSCs构建组织工程化神经的支架材料.     

CD8 serum levels in acute graft-versus-host disease diagnosis

Attempts to identify an early and discriminating marker of acute graft-versus-host disease (aGvHD) have been unsuccessful. The levels of soluble CD4 and soluble CD8 in serum correlate with T cell subset activation and may be important in monitoring and characterizing immunological processes. We determined serum soluble CD4 (sCD4) and sCD8 levels with a two-site sandwich enzyme immunoassay on patients' serum samples collected prior to bone marrow transplantation and weekly after transplantation until day +28. No significant increment of sCD4 was documented in each determination. sCD8 rose significantly before diagnosis or development of maximal clinical symptoms in patients with grade II–III aGvHD than grade 0–I aGvHD [at day +21—median value 447 IU/ml; range 94–713; versus 1136 IU/ml, range 790–1416P=0.002); at day +28—median value 443 IU/ml, range 73–992, versus 1164 IU/ml, range 625–1960P=0.005)]. On the day of marrow infusion the sCD8 levels were significantly higher in patients who subsequently developed grade II–III than in patients with grade 0–I aGvHD (median value 155 IU/ml, range 10–332, versus 350 IU/ml, range 283–830;P=0.003). Careful monitoring of sCD8 is a useful tool for a prompt aGvHD diagnosis and may be used in a clinical bone marrow transplantation setting.