蕲艾提取液药物血清对大鼠肝星状细胞cyclin D1蛋白表达的影响

目的：研究蕲艾提取液药物血清对大鼠肝星状细胞（HSC）细胞周期调控蛋白cyclin D1表达的影响。方法：传代培养的HSC-T6与蕲艾提取液药物血清共同培养24小时后,采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫印迹（Western blot）分别检测细胞周期蛋白cyclin D1 mRNA及其蛋白表达。结果：不同浓度（5%、10%、20%）蕲艾提取液药物血清与空白对照组及血清对照各组比较,可明显抑制cyclin D1 mRNA及其蛋白表达（P〈0.01）。结论：蕲艾提取液药物血清通过抑制HSC cyclin D1 mRNA及其蛋白的表达,发挥对HSC细胞周期的调控,这可能是该药抗纤维化的机制之一。     

RNA干扰bcl-2基因的筛选及对肝星状细胞生物活性的影响

目的研究小干扰RNA（shRNA）重组载体介导抑制大鼠肝星状细胞（hepaticstellatecell，HSC）bcl-2基因的表达，初步观察其对HSC生物活性的影响。方法设计有小发夹结构的3条DNA序列构建重组质粒载体pGPU6-GFP，脂质体转染HSC—T6细胞株以荧光定量PCR和Westernblot筛选鉴定，通过CCK-8法及AnnexinV／PI双标记流式细胞术检测、观察其对HSC生长的影响。结果pGPU6-GFP—shRNA1、shRNA2均能抑制bcl-2mRNA和蛋白表达（P〈0．05），pGPU6-GFP—shRNAl转染HSC．T6株72h后对bcl-2基因抑制达80％，且HSC—T6体外生长明碌受到抑制，早期凋亡率为33．34％～44．12％。结论bel-2小发夹RNA重组载体shRNA1能最有效抑制HSC—T6中bcl-2的表达与细胞生长，促进凋亡，为下一步探索肝纤维化基因治疗提供实验依据。     

蕲艾提取液对大鼠肝组织细胞周期蛋白Cyclin D1表达的影响

[目的]研究蕲艾提取液对免疫性肝纤维化大鼠肝组织细胞周期蛋白Cyclin D1表达的影响。[方法]72只Wister大鼠随机分为正常对照（正常）组,肝纤维化模型（模型）组,蕲艾提取液低、中、高剂量组和丹参组。猪血清腹腔内注射法构建肝纤维化大鼠模型。采用荧光定量PCR和Western blot法检测大鼠肝脏组织细胞周期蛋白Cyclin D1蛋白和mRNA表达水平。[结果]与模型组比较,蕲艾提取液组可下调Cyclin D1 mRNA及蛋白表达（P〈0.05,〈0.01）。[结论]蕲艾提取液可下调Cyclin D1的表达,发挥对细胞周期的调控,使细胞复制停滞于G0/G1期,抑制细胞增殖,进而达到抗肝纤维化的作用。     

蕲艾提取液抑制免疫性肝损伤大鼠肝纤维化作用的观察

目的研究蕲艾提取液的抗肝纤维化作用。方法Wistar大鼠60只被随机分为正常对照组、模型组和大、中、小剂量蕲艾提取液处理组,采用异种血清腹腔内注射法制造肝纤维化大鼠模型;采用放射免疫法检测实验大鼠血肝纤维化指标,采用硫代巴比妥酸法检测血清超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）水平。结果各蕲艾提取液处理组与模型组相比,组织病理学上肝纤维化程度显著减轻;处理组动物血清HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-C水平均显著低于模型组（P〈0.05）;模型组动物血清SOD水平降低,MDA的含量升高,而处理组较模型组SOD活性明显提高,MDA的含量降低,差异均有显著性（P〈0.05）。结论蕲艾提取液具有明显的抗肝纤维化作用。     

bax、bcl-2和caspase-3基因在肝星状细胞株HSC-T6中的表达

目的：研究灌服赤芍水提物后的犬药物血清作用于肝星状细胞株HSC-T6基因蛋白表达的变化。方法：采用乙醛造模后的肝星状细胞株HSC-T6细胞作为酒精性肝纤维化的体外研究模型；以赤芍水提物给彼格犬一次性灌胃．取给药后2小时的血清作为实验药物血清。以免疫细胞化学法检测药物血清对HSC—T6作用72小时后bax、bcl-2、caspase-33种基因蛋白表达情况，并与乙醛造模后的HSC—T6细胞相比较。结果：乙醛造模后的HSC-T5细胞中bcl-2的表达较正常培养组细胞增加，bax、caspase-3表达降低；药物血清作用后的HSC-T6细胞中bcl-2的表达较造模组的HSC-T6细胞显著降低，bax、caspase-3的表达较模型组细胞显著增加。结论：赤芍水提物入血后可能是通过bax、bcl-2、casoase-3等基因异常表达来实现对HSC-T6的抑制增殖及促进凋亡作用。     

应用Alarma blue测定法评价软肝煎药物血清对HSC/T6增殖的影响

目的：应用Alarma blue测定法评价中药复方软肝煎对HSC／T6增殖的影响，方法：实验分为小牛血清，大鼠血清及药物血清3组，各组再分为5％，10％及20％3个浓度组，每组4只大鼠，利用中药血清药理学，通过MTT法和Alarma blue测定法测定软肝煎药物血清影响HSC／T6增殖的情况。结果：在MTT测定法中，与小牛血清组相比，大鼠血清组的5％浓度差异有显著性意义（P＜0．05），10％，20％浓度差异有非常显著性意义（P＜0．01），药物血清组各浓度差异均有非常显著性意义（P＜0．01），与大鼠血清组相比，药物血清组的5％，10％浓度差异有显著性意义（P＜0．05），20％浓度差异有非常显著性意义（P＜0．01），在Alarma blue测定法中，24h时，与小牛血清组比较，大鼠血清组与药物血清组的10％浓度差异均有非常显著性意义（P＜0．01），与大鼠血清组相比，药物血清组的10％浓度差异有显著性意义（P＜0．05，）30h时，与小牛血清组比较，大鼠血清组的10％浓度及药物血清组的10％学差异均有显著性意义（P＜0．05，P＜0．01），与大鼠血清组相比，药物血清组的10％浓度差异有非常显著性意义（P＜0．01），结论：软肝煎能抑制HSC／T6的增殖，具有抗肝纤维化作用；Alarma blue测定法是一种可靠的方法，不同动物种属的血清对肝星状细胞增殖影响不同，在培养系中使用单一的血清为好。     

蕲艾提取液对免疫性肝纤维化大鼠Ⅰ、Ⅲ型胶原及基质金属蛋白酶抑制因子-1表达的影响

目的:研究蕲艾提取液对免疫性肝纤维化大鼠Ⅰ、Ⅲ型胶原及TIMP-1表达的影响.方法:Wistar大鼠60只随机分为正常对照组、模型组和高、中、低剂量蕲艾提取液治疗组,采用异种血清腹腔内注射构建肝纤维化大鼠模型,肝组织切片HE染色后,光镜下观察大鼠肝组织纤维化程度;SABC型免疫组化染色法观察肝组织Ⅰ、Ⅲ型胶原及TIMP-1含量变化.结果:蕲艾提取液各治疗组与模型组相比,肝纤维化程度显著减轻;肝纤维化模型组及蕲艾提取液治疗组Ⅰ、Ⅲ型胶原含量及TIMP-1水平显著高于正常对照组;蕲艾提取液治疗组Ⅰ、Ⅲ型胶原及TIMP-1水平又显著低于肝纤维化模型组.结论:蕲艾提取液能够显著降低免疫性肝纤维化大鼠Ⅰ、Ⅲ型胶原及TIMP-1表达.     

太白楤木抗肝纤维化的实验研究

目的：探讨太白槐木对成纤维细胞增殖及超微结构的影响，研究太白槐木抗肝纤维化的作用机制。方法：采用体外培养的NIH3T3（小鼠胚胎成纤维细胞）作为肝星状细胞（HSC）的替代模型，常规培养，秋水仙碱、齐墩果酸及太白槐木中药血清作用于细胞，用MTT（四唑盐比色）法检测各组药物血清对NIH3T3细胞增殖的影响；用放射免疫法测定培养上清液中透明质酸（HA）的生成；电镜下观察药物血清对NIH3T3细胞超微结构的影响。结果：太白槌木、齐墩果酸、秋水仙碱血清组细胞均可抑制细胞增殖（P〈0．05）；显著抑制HA的合成，降低NIH3T3细胞培养上清中HA水平，与对照组比较差异有显著性意义（P〈0．01），而3组之间差异无显著性意义（P〉0．05）。结论：太白格木中药血清可显著抑制NIH3T3细胞增殖和细胞外HA的合成，并可通过诱导HSC细胞凋亡来达到减少细胞数目、促进纤维化的逆转，从而达到抗肝纤维化的作用。     

软肝煎药物血清对肝星状细胞/T6增殖及Ⅰ型胶原合成的影响

目的 :探讨软肝煎药物血清对肝星状细胞 (HSC) / T6的增殖、 型胶原合成的影响。方法 :实验分为大鼠血清组和药物血清两组 ,各组再分为 5 %、10 %及 2 0 % 3个浓度组 ,每组 4只大鼠。用 MTT比色法和 Alarmablue测定法评价软肝煎药物血清对 HSC/ T6的增殖抑制作用 ;用 Western blotting法和 EL ISA法评价软肝煎药物血清对 HSC/ T6合成 型胶原量的影响。结果 :在 MTT测定法中 ,与大鼠血清组相比 ,药物血清组的 5 %、10 %浓度差异有显著性意义 (P <0 .0 5 ) ,2 0 %浓度差异有非常显著性意义 (P <0 .0 1)。在 Alarma blue测定法中 ,2 4 h时与大鼠血清相比 ,药物血清组的 2 0 %浓度差异有显著性意义 (P<0 .0 5 ) ;30 h时与大鼠血清相比 ,药物血清组的2 0 %浓度差异有非常显著性意义 (P <0 .0 1)。 EL ISA法测定的细胞上清 型胶原含量 ,药物血清组与大鼠血清组相比差异有显著性意义 (P <0 .0 5 ) ,Western blottin法测定细胞内合成 型胶原的量 ,可知药物血清组 型胶原的含量明显少于大鼠血清组。结论 :软肝煎不仅能抑制 HSC的增殖 ,而且能抑制 HSC合成 型胶原的量 ,从而提示软肝煎有很好的抗肝纤维化作用。     

大鼠肝纤维化自发逆转过程中肝星状细胞凋亡与p75的表达

肝星状细胞（HSC）凋亡是肝纤维化逆转的主要机制之一。人和大鼠的HSC表达低亲和力神经生长因子受体p75，当p75与神经生长因子（NGF）结合时可引起细胞凋亡。本研究通过建立四氯化碳（CCl4）肝纤维化大鼠模型，对肝纤维化自发逆转过程中HSC凋亡和p75表达进行了研究。     

瘦素对TRAIL诱导大鼠肝星状细胞凋亡的影响及机制研究

目的：了解瘦素对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）诱导肝星状细胞（HSC）凋亡的影响及调控机制。方法MTT比色法、流式细胞术检测瘦素对外源性TRAIL诱导HSC-T6细胞增殖和细胞凋亡的影响;采用Western印迹检测信号传导与转录激活因子3（STAT3）、磷酸化STAT3（pSTAT3）、Bcl-2。结果TRAIL抑制HSC-T6细胞增殖、诱导HSC-T6细胞凋亡,而瘦素使TRAIL诱导的HSC-T6细胞凋亡明显减少（P＜0．05）;当TRAIL诱导HSC-T6细胞凋亡时加入瘦素,pSTAT3、Bcl-2表达上调。结论瘦素可以使外源性TRAIL诱导的HSC-T6细胞凋亡减少,可能与瘦素促使STAT3磷酸化,Bcl-2表达上调有关。     

抗纤软肝颗粒对大鼠肝星状细胞增殖的影响

目的:探讨抗纤软肝颗粒(KXRG)对大鼠肝星状细胞(HSC)增殖的影响。方法:传代培养的HSC-T6(肝星状细胞系)与KXRG(1.25mg/ml、2.5mg/ml、5mg/ml)及其药物血清(5%、10%、20%)共同培养72小时后,应用MTT法测定细胞增殖、流式细胞仪测定HSC细胞周期各时相的DNA含量。结果:KXRG及药物血清均能显著抑制HSC的增殖,使细胞周期阻滞于S期,且2.5mg/ml药物和10%药物血清作用最强(P0.01)。结论:KXRG通过抑制HSC的活化,阻滞其细胞周期的正常进行,进而抑制HSC增殖,从而起到抗肝纤维化的作用。     

硫化氢在p38MAPK信号通路对大鼠肝星状细胞凋亡中的作用

目的探讨硫化氢(H2S)在p38MAPK信号通路对大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)凋亡中的作用及磷酸化P38、Caspase-3蛋白表达的变化。方法实验设对照组(HSC加含10%胎牛血清的DMEM培养液)、二甲基亚砜(DMSO)组(对照组基础上加DMSO,使其终浓度为0.1%)、NaHS组(对照组基础上加NaHS,使其终浓度为50μmol/L)、SB组(DMSO组基础上加SB203580,使其终浓度为75μmol/L)、SB加NaHS(SB+NaHS)组;采用Hoechst荧光染色检测细胞凋亡;Western blotting法检测磷酸化p38MAPK表达及Caspase-3蛋白表达水平。结果与对照组比较,SB组和SB+NaHS组HSC-T6的凋亡率增加(P0.05),NaHS组p38MAPK磷酸化水平及Caspase-3表达均明显增高(P0.01);与NaHS组比较,SB组和SB+NaHS组细胞凋亡率增加明显(P0.01),p38MAPK磷酸化水平表达降低(P0.01);SB+NaHS组较SB组Caspase-3蛋白表达升高(P0.05)。结论 p38MAPK及Caspase-3在H2S刺激的HSC-T6中表达增强,H2S能促使SB203580诱导的HSC-T6细胞凋亡,其作用机制可能与活化p38MAPK的磷酸化途径,进而激活Caspase-3的表达有关。     

紫七软肝方含药血清对巨噬细胞条件培养液诱导肝星状细胞活化后增殖的影响

目的：探讨以清化湿热瘀毒法组方的紫七软肝方含药血清对巨噬细胞条件培养液诱导大鼠肝星状细胞（HSC-T6）活化增殖的影响。方法：体外应用巨噬细胞条件培养液培养诱导HSC-T6活化,在2．2、1.1、0．55g·ml^-1质量浓度的紫七软肝方含药血清分别对其作用24h、48h和72h后,MTT法检测其对HSC—T6增殖的影响。结果：紫七软肝方含药血清对活化后HSC-T6具有显著的抑制作用（P〈0．01）,且优于黄芪一贯煎方组,高浓度紫七软肝方组的抑制作用优于秋水仙碱组,中、低浓度组不及秋水仙碱组。结论：肝纤维化病程中“湿热瘀毒”为疾病病理因素,根据“清化湿热瘀毒法”拟制的紫七软肝方对肝星状细胞的活化增殖有一定抑制作用,可能是其抗肝纤维化的作用机制之一。。     

氧化苦参碱对肝星状细胞增殖抑制和促凋亡作用的影响

[目的]研究氧化苦参碱对体外乙醛造模后的肝星状细胞（HSC）增殖抑制及促凋亡作用的影响,探讨该药抗酒精性肝纤维化的作用机制。[方法]选取乙醛造模后HSC-T6为体外模型,以四甲基固氮唑盐（MTT）法分别检测800、400、200、100ug／ml浓度氧化苦参碱药物血清对HSC-T6作用48h后的抑制情况,找出最佳含药浓度;根据以上结果,以流式细胞仪检测HSC-T6的促凋亡作用。[结果]800ug/ml氧化苦参碱对HSC-T6细胞生长的抑制率最高,达到51．31％,与模型组比较差异有统计学意义（P〈0．01）。碘化丙啶染色流式细胞分析：800ug／ml药物血清作用HSC-T6,其在G0／G1、apop期细胞比例较模型组明显上升,S期细胞明显下降。[结论]氧化苦参碱可明显抑制HSC-T6增殖和诱导其调亡。     

熊果酸对肝星状细胞增殖与凋亡的影响

目的 体外观察熊果酸对肝星状细胞增殖与凋亡的影响,探讨熊果酸诱导肝星状细胞凋亡的可能作用机制. 方法 将不同浓度熊果酸作用于肝星状细胞HSC-T6及肝细胞L02,分别在药物作用24、48、72 h后用四甲基偶氮唑盐法检测熊果酸对HSC-T6及L02细胞增殖的影响;流式细胞仪检测熊果酸对HSC-T6凋亡的影响;光学显微镜观察熊果酸作用后细胞形态学变化情况;免疫细胞化学法检测HSC-T6中Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的表达情况. 结果 各种浓度的熊果酸均可抑制HSC-T6细胞的增殖,且呈剂量-时间依赖性;当熊果酸浓度为25、50、75μmol/L时可促进L02细胞增殖,浓度＞75μmol/L则表现为抑制L02细胞增殖.在病理形态学方面,熊果酸作用HSC-T6细胞48 h后,光学显微镜下可见细胞缩小变圆、核浓缩等.25、50、75 μmol/L熊果酸作用HSC-T6细胞48 h后,流式细胞仪检测显示细胞凋亡率分别为10.30%±3.85%、21.87%±4.46%、31.33%±6.18%,比对照组(2.93%±1.60%)明显升高(P＜0.01).免疫细胞化学显示Bax及Caspase-3蛋白表达较对照组升高(P＜0.05),且呈剂量依赖性,而Bcl-2蛋白表达水平与对照组无明显差异(P＞0.05).结论 在体外熊果酸可较明显地抑制HSC-T6细胞增殖,诱导其凋亡;对L02细胞的生长具有双向调节作用.熊果酸诱导HSC-T6细胞凋亡可能与降低Bcl-2/Bax比值、激活Caspase-3蛋白有关.     

TRAIL诱导大鼠肝星状细胞系HSC-T6凋亡及机制研究

目的研究肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）诱导肝星状细胞凋亡情况及调控机制。方法用RT-PCR检测大鼠肝星状细胞（HSC-T6）中α-SMAmRNA和DR5mRNA的表达;MTT比色法和流式细胞术检测外源性TRAIL对HSC-T6细胞增殖和诱导细胞凋亡的影响;采用Western blot检测Bax、Caspase3蛋白的表达。结果培养的HSC-T6细胞表达α-SMA mRNA和DR5mRNA随作用时间的延长逐渐增加,TRAIL可以抑制其细胞增殖。TRAIL与对照组比较可以诱导活化的HSC-T6细胞凋亡明显增加（P〈0.05）,Western-blotting分析显示TRAIL作用下,HSC-T6细胞中的线粒体Bax蛋白、细胞浆Caspase3蛋白表达均上调。结论外源性TRAIL可诱导活化的HSC-T6细胞凋亡,可能与DR5及线粒体Bax表达上调有关。